Preparación de DMMTAV y DMDTAV usando DMAV para usos ambientales: síntesis, purificación y confirmación

Resumen

Este artículo presenta protocolos experimentales modificados para el ácido dimethylmonothioarsinic (DMMTA^V) y dimethyldithioarsinic (DMDTA^V) síntesis, induciendo dimethylarsinic ácido (DMA^V) thiolation con la mezcla de DMA^V , Na₂S y H₂por₄. El protocolo modificado proporciona una guía experimental, de tal modo superar las limitaciones de las medidas de síntesis que podrían haber causado errores experimentales en análisis cuantitativo.

Resumen

Dimethylated thioarsenicals como el ácido dimethylmonothioarsinic (DMMTA^V) y el ácido dimethyldithioarsinic (DMDTA^V), que se producen por la vía metabólica de la thiolation de (DMA^V) ácido dimethylarsinic, han sido recientemente encontrado en el medio ambiente así como los órganos humanos. DMMTA^V y DMDTA^V pueden cuantificarse para determinar los efectos ecológicos de dimethylated thioarsenicals y su estabilidad en medios ambientales. El método de síntesis para estos compuestos es concepto, haciendo estudios anteriores difíciles de replicar. Además, hay una falta de información sobre técnicas de almacenamiento, incluyendo el almacenamiento de los compuestos sin transformación de las especies. Por otra parte, porque existe sólo información limitada acerca de los métodos de síntesis, puede haber dificultades experimentales en síntesis de productos químicos estándar y la realización de análisis cuantitativo. El protocolo presentado adjunto proporciona un método de síntesis prácticamente modificado para el thioarsenicals dimethylated, DMMTA^V y DMDTA^Vy ayudará en la cuantificación del análisis de la separación de especies utilizando líquido de alto rendimiento cromatografía en conjunto con plasma acoplado inductivamente espectrometría de masas (HPLC-ICP-MS). Los pasos experimentales de este procedimiento fueron modificados por centrarse en la preparación de reactivos químicos, métodos de filtración y almacenamiento de información.

Introducción

Puesto que el ácido dimethylarsinic (DMA^V) se ha demostrado que exhiben toxicidad aguda y genotoxicidad por sufrir metilación y thiolation a la ingestión de^1,2, la vía metabólica de arsénico thiolation tiene sido intensamente estudiado tanto in vitro e in vivo^3,4 , así como en los medios ambientales (por ejemplo, lixiviados de vertederos)^5,6. Estudios anteriores han encontrado tanto reducción y thiolated análogos de DMA^V en la vida de las células, por ejemplo, dimethylarsinous ácido (DMA^III), ácido dimethylmonothioarsinic (DMMTA^V) y dimethyldithioarsinic (ácido DMDTA^V)^7,8,9, con dimethylated thioarsenicals como DMMTA^V exhibiendo toxicidad mayor que otros conocidos arsenicales orgánicos o inorgánicos¹⁰. La abundancia de thioarsenicals altamente tóxico tiene graves consecuencias ambientales, ya que pueden plantear un riesgo para los seres humanos y el medio ambiente bajo condiciones altamente sulfídicos¹¹. Sin embargo, los mecanismos de DMMTA^V y DMDTA^V (trans) formación y su destino en los medios de comunicación ambiental todavía requieren más estudio. Así, el análisis cuantitativo de thioarsenicals es necesaria para mejorar la comprensión de los efectos ambientales de DMMTA^V y DMDTA^V.

Aunque los productos químicos estándar son el requisito fundamental para el análisis cuantitativo, los estándares de DMMTA^V y DMDTA^V son difíciles de obtener mediante la replicación de los estudios anteriores, debido al alto riesgo de transformación de especies en otras especies y procedimientos de síntesis de datos¹². Por otra parte, los métodos referenciados tienen limitaciones que pueden llevar a dificultades prácticas para sintetizar los productos químicos estándar y la realización de análisis cuantitativo. DMMTA^V y DMDTA^V comúnmente se preparan mezclando DMA^V, Na₂S, H₂para₄ en un cierto cociente molar¹ o burbujeo H₂S gas a través de una solución de DMA^{V 13,14}. La sustitución de funciones método burbujas de oxígeno por azufre mediante un suministro directo de gas de H₂S, que es altamente tóxico y difícil de controlar para un usuario inexperto. Por el contrario, la anterior mezcla método¹, ampliamente utilizado para el análisis cualitativo de DMMTA^V y DMDTA^V en estudios ambientales^5,6,12, cuenta con la thiolation de DMA^V con H₂S generado por mezcla Na₂S y H₂para₄ y produce DMMTA^V y DMDTA^V, permitiendo más fácil control estequiométrico producir productos químicos objetivo, como en comparación con el directo uso de H₂S gas.

La referencia mezcla método procedimientos^1,3,4,8,15 mencionado en este estudio exhiben limitaciones en algunos de sus críticos pasos experimentales, que puedan llevar a error experimental. Por ejemplo, los detalles de la preparación de disolventes específicos (es decir, desionizada agua) y la extracción y cristalización de los arsenicales sintetizados son demasiado abreviados o no descritos con suficiente detalle. Tan dispersa y limitada información sobre las etapas del procedimiento podría dar lugar a la formación incompatible de thioarsenicals y análisis de cuantificación fiable. Por lo tanto, el protocolo modificado desarrollado en el presente documento describe la síntesis de DMMTA^V y DMDTA^V soluciones con análisis de separación cuantitativa de especies.

Protocolo

1. síntesis de DMMTA^V

1. Preparación química y relación molar de mezcla de DMA^V, Na₂S y H₂SO₄
   Nota: DMA^V: Na₂S:H₂por₄ = 1:1.6:1.6
   1. Disolver 5,24 g de DMA^V en 40 mL desionizada y N₂-purgado (purgado por lo menos 30 min) agua en un tubo de centrífuga de 50 mL.
   2. Preparar el reactivo de Na₂S disolviendo 14,41 g de Na₂S·9H₂O en 50 mL desionizada y N₂-purgado en un matraz de 250 mL.
   3. Preparación H₂modo reactivo₄ añadiendo 3,3 mL de ácido sulfúrico concentrado (96%) y 40 mL de desionizada y N₂-purgado de agua en un tubo de centrífuga de 50 mL.
      Nota: Fracción molar Final de DMA^V: Na₂S:H₂SO₄ = 1:1.6:1.6 ^1,3,4,8,15.
   4. Añadir el preparado 40 mL de solución DMA^V (paso 1.1.1) a lo 50 mL de Na₂S contenida en el frasco de 250 mL (paso 1.1.2). Enjuague el tubo que contiene el DMA^V con 10 mL de agua purgada y añadir al matraz de 250 mL.
   5. Cerrar el matraz con un tapón de caucho de tres orificios que con tubos de vidrio. Utilizar el vidrio de los tubos para entrada de gas de₂ N, salida y H₂SO₄ entrada de solución, respectivamente. Inmediatamente después de cerrar el frasco, permiten el flujo del gas N₂ en el matraz.
      Nota: La presión de Gas debe mantenerse fluyendo sobre la superficie de la solución de reacción sin salpicar.
   6. Conexión a prueba de ácido tubo el tubo de vidrio de H₂SO₄ entrada de solución con una jeringa de 50 mL agregar el preparado 40 mL de H₂por lo tanto₄ solución (paso 1.1.3). Añadir 40 mL de H₂hasta₄ solución, lentamente y de manera gradual.
      PRECAUCIÓN: Al añadir el ácido sulfúrico, se generarán humos blancos; Utilice una campana bien ventilada.
   7. Monitorear el cambio del color de la mezcla en el matraz de reacción al añadir ácido sulfúrico a intervalos regulares. Mantener un intervalo de 4-5 mL gotas de H₂hasta₄; la mezcla debe tener una solución turbia blanca.
      Nota: Puede aparecer precipitación amarillo instantáneo debido a la rápida adición de ácido sulfúrico concentrado.
   8. Garantizar que la solución de reacción ha estado de pie durante 1 hora desde el inicio del paso 1.1.4.
2. Extracción de^V de DMMTA método de extracción líquido-líquido
   1. Después de 1 h, verter la solución de reacción en un matraz que contiene unos 200 mL de éter dietílico.
   2. Agitar el embudo de 5-10 minutos, liberando el gas varias veces cambiando la llave de paso.
      Nota: Sintetizada DMMTA^V será transferida a la capa superior de éter dietílico (0.713 g·mL^-1).
      PRECAUCIÓN: Gas de éter dietílico puede ser perjudicial; Utilice una campana bien ventilada.
   3. Recoge la solución de reacción en un vaso de precipitado y recoger por separado el éter dietílico que contiene DMMTA^V en una botella. Vuelva a colocar la solución de reacción en el mismo matraz y añadir aproximadamente 200 mL de dulce éter dietílico para reshaking. Repita los pasos 1.2.2 - 1.2.3 tres veces.
   4. Vierta el éter dietílico recogido de paso 1.2.3 en el mismo embudo separatory otra vez y añadir unos 100 mL N₂-purgado de agua desionizada. Agite durante 5-10 min y descartar el N₂-purgado de agua desionizada y unos pocos mL de éter dietílico para propósitos de pureza. Recoge el éter dietílico restante en un plato de petri de vidrio (diámetro interno mínimo de 160 mm) y altura mínima de 50 mm.
   5. Transfiera el plato de petri de vidrio en una caja de guante de atmósfera de N₂ para evitar la transformación de las especies.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de que el solvente no se tira en la bomba de vacío a través de la salida de la caja de paso.
   6. Seco hasta un precipitado blanco de dimethylmonothioarsinate (cristalizada DMMTA^V) se forma en el plato de petri de vidrio.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí.
3. Verificación del almacenamiento y síntesis DMMTA^V
   1. Tomar el precipitado blanco de cristal DMMTA^Vy mida y registre su peso total.
      PRECAUCIÓN: Use una campana bien ventilada o guantera para evitar la inhalación de sulfuro de hidrógeno gas.
   2. Disolver crystalized DMMTA^V en 50 mL de N₂-purgado de agua desionizada y filtrar el precipitado amarillo a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm.
   3. Asumir que la total a partir del uso DMA^V se convierte en DMMTA^V, es decir,≈9, 649 mg As· L^-1. Diluir la solución madre de DMMTA^V a ≈1 mg· L^-1 y ≈40 μg· L^-1 para el análisis de verificación con ionización por Electrospray masa Spectromtery (ESI-MS) y HPLC-ICP-MS, respectivamente.
   4. Análisis de m/z de DMMTA^V con ESI-MS^11,16 y fragmentos en m/z 155 en el modo positivo-ion o en m/z 153 en el modo de iones negativos (tabla 1).
      Nota: Ver los valores de referencia de m/z (tabla 1).
   5. Cromatograma de DMMTA^V en la solución usando HPLC-ICP-MS^11,16,17 con eluyente apropiado condiciones de analizar y confirmar un pico principal se encuentra en el tiempo de retención se describe en el literatura.
      Nota: Pureza de sintetizado DMMTA^V debe calcularse usando los resultados del análisis del paso 1.3.5.
   6. Analizar la concentración de arsénico total utilizando ICP-MS después de la digestión ácida¹¹ y calcular la concentración verdadera de DMMTA^V en sintetizada DMMTA^V solución madre con factores de dilución y de la pureza, como en la siguiente ecuación:
      Total analizado como concentración (μg· L^-1) · Factor de dilución · Pureza (%) = concentración de verdad DMMTA^V DMMTA^V solución stock (μg· L^-1)
   7. Almacene la solución stock DMMTA^V a 4 ° C en la oscuridad para mayor especiación cuantitativa análisis¹⁸.

2. síntesis de DMDTA^V

1. Preparación química y relación molar de mezcla de DMA^V , Na₂S y H₂SO₄
   Nota: DMA^V: Na₂S:H₂por₄ = 1:7.5:7.5
   1. Disolver 1,38 g de DMA^V en 40 mL de agua desionizada en un tubo de centrífuga de 50 mL.
   2. Para preparar reactivo de Na₂S 18,01 g de Na₂S·9H₂O en una 50 mL de agua desionizada en un matraz de 250 mL de disolución.
   3. Preparación H₂modo reactivo₄ añadiendo 4 mL de ácido sulfúrico concentrado (96%) a 40 mL de agua desionizada contenida en un tubo de centrífuga de 50 mL.
      Nota: Fracción molar Final de DMA^V: Na₂S:H₂SO₄ = 1:7.5:7.5^1,3,4,8,15.
   4. Añadir el preparado 40 mL de solución DMA^V (paso 2.1.1) a lo 50 mL de Na₂S contenida en el frasco de 250 mL (paso 2.1.2). Enjuague el tubo que contiene el DMA^V con 10 mL de agua desionizada y añadir al matraz de 250 mL.
   5. Añadir el preparado 40 mL de H₂hasta₄ solución (paso 2.1.3), lentamente y de manera gradual, en el matraz.
   6. Monitorear el cambio del color de la mezcla en el matraz de reacción al añadir ácido sulfúrico a intervalos regulares. Mantener un intervalo de 4-5 mL gotas de H₂hasta₄; la mezcla debe tener una solución turbia, blanco, amarillo.
      Nota: Puede aparecer precipitación amarillo instantáneo debido a una rápida adición de ácido sulfúrico concentrado.
      PRECAUCIÓN: Al añadir el ácido sulfúrico, se generarán humos blancos; Utilice una campana bien ventilada.
   7. Mantener la solución de reacción en el frasco toda la noche sin cubrir.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí.
2. Extracción de^V de DMDTA método de extracción en fase sólida (SPE)
   1. Después de la reacción durante la noche de pie, filtro de la solución de reacción utilizando una jeringa de C18 tipo SPE basados en sílice para atrapar sintetizado DMDTA^V en la resina.
      PRECAUCIÓN: Utilice una campana bien ventilada.
   2. Disolver 0,77 g de acetato de amonio en 1 L de agua desionizada para preparar acetato de amonio 10 mM (pH 6.3). Eluir un suficiente volumen de acetato de amonio 10 mM a través de la jeringa de C18 (paso 2.2.1) para extraer el DMDTA adsorbido^V. Recoger el acetato de amonio filtrado en una placa de Petri (diámetro interno mínimo de 160 mm) y altura mínima de 50 mm de vidrio.
   3. Transfiera el plato de petri de vidrio en una caja de guante de atmósfera de N₂ para evitar la transformación de las especies.
      PRECAUCIÓN: Asegúrese de solvente no se tira en la bomba de vacío a través de la salida de la caja de paso.
   4. Secar hasta que es un precipitado blanco de dimethyldithioarsinate formado (cristalizada DMDTA^V) sobre el plato de petri de vidrio.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí.
3. Verificación del almacenamiento y síntesis DMDTA^V
   1. Tomar el precipitado blanco de cristal DMDTA^Vy medir su peso total, la medición de la grabación.
      PRECAUCIÓN: Use una campana bien ventilada o guantera para evitar la inhalación de sulfuro de hidrógeno gas.
   2. Disolver crystalized DMDTA^V en 50 mL de N₂-tubo de centrífuga agua desionizada purgado de 50 mL y filtrar cualquier precipitado a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm.
   3. Asumir que el total a partir del uso DMA^V se convierte en DMDTA^V, es decir,≈2, 539 mg As· L^-1. Diluir la solución madre de DMDTA^V a ≈1 mg· L^-1 y ≈40 μg· L^-1 para el análisis de verificación usando ESI-MS y HPLC-ICP-MS, respectivamente.
   4. Análisis de m/z de DMDTA^V con ESI-MS^11,16 y fragmentos en m/z 171 en el modo positivo-ion o en m/z 169 en la modalidad de iones negativos (tabla 1).
      Nota: Ver los valores de referencia de m/z (tabla 1).
   5. Analizar el cromatograma de DMDTA^V en la solución usando HPLC-ICP-MS^11,16,17 con eluyente apropiado condiciones y confirmar que un pico se encuentra en el tiempo de retención que se describe en la literatura.
      Nota: Pureza de sintetizado DMDTA^V debe calcularse usando los resultados del análisis del paso 2.3.5.
   6. Analizar la concentración de arsénico total utilizando ICP-MS después de la digestión ácida¹¹ y calcular la concentración de DMDTA^V verdadero en sintetizada solución DMDTA^V utilizando factores de dilución y la pureza como la siguiente ecuación:
      Total analizado como concentración (μg· L^-1) · Factor de dilución · Pureza (%) = concentración de verdad DMDTA^V DMDTA^V en la solución madre (μg· L^-1)
   7. Almacene la solución stock DMDTA^V a 4 ° C en la oscuridad para mayor especiación cuantitativa análisis¹⁸.

Resultados

Ya DMMTA^V ha sido preparado por error por la DMA^III síntesis método¹⁹, verificación de sintetizado DMMTA^V y DMDTA^V es un paso crítico para la síntesis y extracción y determinar la norma ideal materiales químicos. Productos químicos sintetizados pueden ser verificados por el pico de DMMTA^V (154 MW g·mol^-1) y relación de masa de la carga DMDTA^V (170 MW g·mol^-1) (m/z...

Discusión

El protocolo desarrollado ha aclarado los pasos críticos que anteriores estudios^1,3,4,8,15 omitido o abreviado, que pudo haber llevado a dificultades o el fracaso durante la DMMTA^V y DMDTA^V síntesis. DMMTA^V es sensible a la oxidación^1,5, reactivos químicos para su s...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cacodylic acid	Sigma-Aldrich	20835-10G-F
Sodium sulfide nonahydrate	Sigma-Aldrich	S2006-500G
Sulfuric acid 96%	J.T.Baker	0000011478
Ammonium acetate	Sigma-Aldrich	A7262-500G
Formic acid 98%	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	066-00461
Diethyl ether (Extra Pure)	Junsei Chemical	33475-0380
Adapter cap for 60 mL Bond Elut catridges	Agilent Technologies	12131004	Syringe type of SPE
Bond Elut C18 cartridge	Agilent Technologies	14256031	Syringe type of SPE
HyPURITY C-18	Thermo Scientific	22105-254630	5 um, 125 x 4.6 mm
Glovebox	Chungae-chun, Rep. of Korea		Customized
Agilent 1260 Infinity Bio-inert LC	Agilent Technologies	DEAB600252, DEACH00245
Agilent Technologies 7700 Series ICP-MS	Agilent Technologies	JP12031510
Finnigan LCQ Deca XP MAX Mass Spectrometer System	Thermo Electron Corporation	LDM10627