Cuantificación de endógeno auxina y citoquinina durante cultura de entrenudo de Ipecacuana

Resumen

Brotes adventicios pueden ser inducidas en los segmentos internodales de Ipecacuana sin tratamiento de fitohormonas. Para evaluar la dinámica de la fitohormona durante la formación de brotes adventicios, medimos endógeno auxina y citocinina en segmentos internodales por LC-MS/MS.

Resumen

Formación de brotes adventicios es una técnica importante para la propagación de cultivos de importancia económica y para la regeneración de plantas transgénicas. Tratamiento de fitohormonas se requiere para la inducción de brotes adventicios en la mayoría de las especies. Si se pueden inducir brotes adventicios se determina por el balance entre auxinas y citoquininas (CK) niveles. Mucho esfuerzo se va a determinar concentraciones óptimas y combinaciones de fitohormonas en cada tejido utilizado como explantes y en cada especie de planta. En jarabe de Ipecacuana, sin embargo, brotes adventicios se pueden inducir en los segmentos internodales en medio de cultivo sin tratamiento de fitohormonas. Esto permite la plasticidad inherente del jarabe de ipecacuana para la diferenciación de la célula ser evaluados. Para inducir brotes adventicios en el jarabe de Ipecacuana, nos cultiva segmentos internodales a 24 ° C con 15 μmol m⁻² s⁻¹ de la luz en un ciclo oscuro de 14 h luz/10-h en medio de B5 sin fitohormonas solidificado con la goma de gellan 0.2% durante 5 semanas. Para investigar la dinámica de la fitohormona durante la formación de brotes adventicios, medimos endógeno ácido indol-3-acético y CKs en los segmentos por líquido cromatografía-tandem espectrometría de masas LC-MS/MS. Este método permite el análisis de ácido indol-3-acético endógeno y CKs de una manera sencilla. Puede ser aplicado para investigar la dinámica de la auxina endógena y CK durante la organogénesis en otras especies vegetales.

Introducción

Gottlieb Haberlandt (1854-1945) propuso el concepto de "totipotencia", por que las plantas las células pueden dividir, diferenciar y regenerar plantas enteras incluso después de su previa diferenciación en tipos celulares específicos en plantas maduras¹. En cultivo de tejidos, si la regeneración de plantas puede ser inducida o no se determina por la combinación y concentración de fitohormonas exógeno aplicados en el medio de crecimiento. Skoog y Miller encontraron que se podían inducir brotes adventicios de callo de tabaco en el medio de cultivo que contiene una alta proporción de CKs a auxinas, mientras que se podían inducir raíces adventicias en medio que contiene una proporción baja de². Desde aquel hallazgo, cultivo de tejidos ha sido ampliamente utilizado para la propagación de cultivos de importancia económica y para la regeneración de plantas transgénicas³. Pueden inducir brotes adventicios de tejidos que no sean de meristemo apical de brote, como hojas, raíces y entrenudos. Se requiere para la inducción de brotes adventicios en la mayoría de especies de plantas tratamiento de fitohormonas. Sin embargo, las concentraciones óptimas y combinaciones diferencian por especie y tejido utilizado como explantes. Por lo tanto, mucho esfuerzo va a determinar las concentraciones óptimas y combinaciones de fitohormonas para experimentos.

Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (Ipecacuana) es una planta medicinal que contiene alcaloides como la emetina y la cefalina, principalmente en las raíces⁴. Extractos de la raíz se utilizan como expectorante, emético y un amoebicide⁵. Aunque Ipecacuana crece naturalmente en las selvas tropicales de Brasil, es reacio a establecer las semillas en la cultura, y la tasa de germinación disminuye durante el almacenamiento de la semilla en Japón, con su frío clima⁶. En cambio, se propaga por cultivo de tejidos, en adventicias que dispara la formación de entrenudos es el método más eficiente^7,8. Curiosamente, se pueden inducir brotes adventicios en esta especie sin fitohormonas tratamiento⁸.

Brotes adventicios se forman en la epidermis de la región apical de los segmentos internodales sin callusing, pero no en la región basal⁹. Esta diferencia indica polaridad de tejido en los segmentos internodales, que es probablemente bajo Reglamento fitohormonal. El sistema de cultivo de jarabe de Ipecacuana permite una oportunidad única para analizar cambios en los niveles de fitohormonas endógenas durante la formación de brotes adventicios. Aquí presentamos nuestro método para el análisis de los niveles endógenos de una auxina (ácido indol-3-acético (AIA)) y cuatro CKs (isopentenyl adenina (iP), isopentenyl adenina riboside (iPR), trans-zeatina (tZ) y trans-riboside zeatina (tZR)) en los segmentos internodales mediante LC-MS/MS.

Protocolo

Nota: Jarabe de Ipecacuana (C. ipecacuanha) fue utilizado en este estudio porque facilita el análisis de fitohormonas endógenas.

1. crecimiento condiciones para inducir brotes adventicios de Ipecacuana

1. Preparar medio de B5 sin phytohormone ajustado a pH 5.7¹⁰y agregar 0.2% la goma de gellan. Esterilice en autoclave.
2. Vierta 25 mL del medio esterilizado en una placa Petri estéril (90 mm × 20 mm).
3. Corte 8 mm segmentos internodales de plántulas de ipecac usando un bisturí con hoja nº 22 en una placa de acrílico estéril y colocar en el medio (figura 1).
4. Cultura en medio de B5 sin fitohormonas a 24 ° C con 15 μmol m⁻² s⁻¹ de la luz en un ciclo oscuro de 14 h luz/10-h por 5 semanas.
5. Identificar las regiones que (apical) a IV (basal) en cada segmento (figura 1B). Contar el número de brotes adventicios > 0,3 mm de longitud en cada región bajo un microscopio una vez por semana.

2. extracción y purificación de fitohormonas

1. Poner un grano de circonio de 5 mm en cada uno de los cuatro tubos de 2 mL de muestra.
2. Cortar los segmentos de las regiones I a IV (cada 2 mm de longitud) con un bisturí en una placa de acrílico estéril.
3. Recoger ocho segmentos de cada región en tubos de muestras separadas (10-30 mg de peso fresco).
4. Pesan y luego congelar las muestras en nitrógeno líquido.
5. Triturar las muestras congeladas utilizando un homogeneizador basado en grano.
6. Suspender las muestras machacadas en acetonitrilo 1 mL que contiene 500 pg de cada estándar interno de Auxina y CKs (d₅-IAA d₅- tZ, d₅- tZR, d₆- iP, d₆- derechos de propiedad intelectual) usando un mezclador de tipo vórtex.
7. Mantener a 4 ° C por 1 h, luego centrifugar a 3.500 × g por 5 min a temperatura ambiente.
8. Lavar el precipitado en 80% (v/v) de acetonitrilo que contenga ácido acético al 1% (v/v). Centrifugar nuevamente a 3.500 × g por 5 min a temperatura ambiente. Combinar los sobrenadantes (de pasos 2.7 y 2.8) en un tubo de vidrio desechable.
9. Añadir 600 μl que contiene ácido acético al 1% (v/v) a cada sobrenadante combinado de agua y evaporar el acetonitrilo utilizando un concentrador de vacío.
10. Equilibrar hidrofílico-lipofílico-equilibrado cartuchos de columna (HLB) mediante la aplicación de 1 mL de acetonitrilo, metanol y agua que contiene ácido acético al 1% (v/v).
11. Aplique una solución de la muestra por medio cartucho HLB.
12. Lavar los cartuchos con 1 mL de agua que contiene ácido acético al 1% (v/v).
13. Responsables todas las hormonas con acetonitrilo de 80% (v/v) de 2 mL que contiene ácido acético al 1% (v/v) en un tubo de vidrio.
14. Evaporar el acetonitrilo en el efluente para obtener el extracto en agua que contiene ácido acético al 1% (v/v) utilizando un concentrador de vacío.
    Nota: No esta seco completamente.
15. Equilibre los cartuchos de columna de modo mixto, fuerte intercambio catiónico (MCX) mediante la aplicación de 1 mL de metanol, acetonitrilo 1 mL, 0,5 mL 0.1 M de HCl y 1 mL de agua que contiene ácido acético al 1% (v/v).
16. Aplique una solución de la muestra por medio cartucho MCX.
17. Lavar los cartuchos con 1 mL de agua que contiene ácido acético al 1% (v/v).
18. Eluir IAA con acetonitrilo del de 30% (v/v) de 2 mL que contiene ácido acético al 1% (v/v) en un tubo de vidrio.
19. Lavar los cartuchos con acetonitrilo de 80% (v/v) de 2 mL que contiene ácido acético al 1% (v/v).
20. Lavar los cartuchos con 2 mL de agua y 1 mL de agua con amoniaco acuosa 5%.
21. Eluir el CKs con acetonitrilo del de 60% (v/v) de 2 mL que contiene 5% de amoníaco acuoso en un tubo de vidrio.
22. Evaporar el solvente de cada fracción de la hormona mediante un concentrador de vacío y almacenar a −30 ° C hasta el análisis de LC-MS/MS.

3. LC-MS/MS análisis de IAA y CKs

1. Disolver el extracto de cada hormona en un tubo con 600 μl de metanol y transferir la solución a un frasco de recuperación total del cuello de tornillo. Evaporar el disolvente utilizando un concentrador de vacío.
2. Disolver la fracción de IAA en 20 μL 30% (v/v) acetonitrilo y las fracciones CK en 20 μl de agua que contiene ácido acético al 1% (v/v) en viales de tornillo cuello recuperación total.
3. Analizar las muestras en el modo de iones positivos en un sistema de MS triple cuadrupolo equipado con un sistema HPLC.
   Nota: Hemos creado las condiciones HPLC como se indica en la tabla 1.
   1. Para la elución de la IAA, utilizar un gradiente binario de 5% - 50% de disolvente B sobre 7 minutos, luego aumentar por 98% solvente B durante 1 min y luego equilibre durante 2 min a 5% disolvente B por inyección de nido.
   2. Para la elución de CK, utilizar un gradiente binario de 2% - 40% disolvente B sobre 5 minutos, 40% - 70% de disolvente B en 7 minutos, luego aumentar al 95% solvente B durante 1 min y luego equilibre durante 2 min a 2% solvente B por inyección de nido.
   3. Establecer la ionización por electrospray (ESI)-MS los parámetros de la fuente de iones que se enumeran en la tabla 2.
4. Utilizar la reacción múltiple control de transición (MRM) para la cuantificación de cada analito que se enumeran en la tabla 3.
5. Cuantificar los niveles endógenos de IAA y CK contra una curva estándar de la proporción de a los estándares marcados con deuterio.

Resultados

En la 1 semana de^st , no habían formado brotes adventicios. En la semana 2^nd , aparecieron pequeños brotes. En el 3^rd y 4 semanas de^mayo , el número de brotes mayor sobre todo en las regiones apicales (I y II) (figura 2A). En^{la semana 5,} el número de brotes fue aproximadamente 7 en región I y 5 en la región II (figura 2B). En cambio, s?...

Discusión

Para identificar la distribución de fitohormonas en la organogénesis, es importante utilizar materiales de la planta en la que puede observarse en medio libre de fitohormonas, organogénesis porque cuando fitohormonas exógeno se aplican a los explantes para la inducción de brotes o raíces, afectan el explante entero, lo que hace difícil evaluar la plasticidad inherente de las plantas en la diferenciación celular y organogénesis. Brotes adventicios pueden ser inducidos en medios de cultivo libres de fitohormonas e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
[2H5]indole-3-acetic acid	Olchemlm Ltd	031 1531	Internal standard for LC-MS/MS
[2H5]trans-zeatin	Olchemlm Ltd	030 0301	Internal standard for LC-MS/MS
[2H5]trans-zeatin riboside	Olchemlm Ltd	030 0311	Internal standard for LC-MS/MS
[2H6]N6-isopentenyl adenine	Olchemlm Ltd	030 0161	Internal standard for LC-MS/MS
[2H6]N6-isopentenyl adenosine	Olchemlm Ltd	030 0171	Internal standard for LC-MS/MS
indole-3-acetic acid	Wako	098 00181	standard for LC-MS/MS
trans-zeatin	SIGMA-ALDRICH	Z0876 5MG	standard for LC-MS/MS
trans-zeatin riboside	Wako	262 01081	standard for LC-MS/MS
N6-isopentenyl adenine	SIGMA-ALDRICH	D7674 1G	standard for LC-MS/MS
N6-isopentenyl adenosine	ACROS ORGANICS	22648 1000	standard for LC-MS/MS
acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv	MERCK	1.00029.1000	solvent for LC-MS/MS
Water for chromatography LiChrosolv	MERCK	1.15333.1000	solvent for LC-MS/MS
HPLC	SHIMADZU	Prominence
MS	Sciex	3200QTRAP
Oasis HLB 30 mg/1 cc	Waters	WAT094225	cartridge column
Oasis MCX 30 mg/1 cc	Waters	186000252	cartridge column
screw neck total recovery vial	Waters	186002805
blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum	Waters	186000274
Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 mm	Waters	186002350	UPLC column
Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 mm	Agilent	699775-902	UPLC column
Digital microscope	Leica	DHS1000
TissueLyser II	QIAGEN	85300
Surgical blade	Feather	No. 22
Scalpel handle	Feather	No. 4
Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap	Thermo Fisher Scientific	SPD111/RVT4104	vacuum concentrartor
Disposable glass tobe (13x100 mm)	IWAKI	9832-1310
Sterile petri dish	INA OPTICA	I-90-20