Un modelo murino Syngeneic bioluminiscente y fluorescente ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración

Resumen

El objetivo de este protocolo es demostrar la inyección intra prostática de las células de cáncer de próstata, con la posterior castración. Modelos preclínicos ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración son críticos para el estudio de la enfermedad en el contexto de un microambiente tumoral clínicamente relevante y un anfitrión inmunocompetente.

Resumen

Ortotópico tumor modelación es una herramienta valiosa para la investigación del cáncer de próstata clínico previo, ya que tiene múltiples ventajas sobre ambos subcutáneo y transgénicos genéticamente modificados modelos de ratón. A diferencia de los tumores subcutáneos, tumores ortotópicos contienen vasculatura más clínico exacto, microambiente tumoral y respuestas a las terapias múltiples. En contraste a los modelos de ratón modificados genéticamente, orthotopic del modelos pueden realizarse con menor costo y en menos tiempo, implican el uso de ratón altamente complejo y heterogéneo o líneas celulares de cáncer humano, algo solo alteraciones genéticas y estas células las líneas pueden ser genéticamente modificados, como express agentes de imagen. Aquí, presentamos un protocolo quirúrgico inyectar una línea de células expresan luciferasa y mCherry murino de cáncer de próstata en el lóbulo anterior de la próstata de ratones. Estos ratones desarrollaron tumores de orthotopic que fueron monitorizados de forma no invasiva en vivo y más analizan en el volumen del tumor, peso, supervivencia del ratón y la infiltración inmune. Además, ratones con tumores de orthotopic fueron castrados quirúrgicamente, conduce a la regresión del tumor inmediata y posterior recurrencia, que representa el cáncer de próstata resistente a castración. Aunque la habilidad técnica es necesaria para llevar a cabo este procedimiento, este modelo de syngeneic ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración es de gran utilidad para todos los investigadores en el campo.

Introducción

El cáncer de próstata se estima que la incidencia más alta (161.360 hombres) y causar las muertes de cáncer masculino más tercera (84.590 hombres) en 2017¹. Tras el diagnóstico, tumores de próstata son andrógeno dependientes y son tratados por cirugía prostatectomía, radioterapia o terapia de privación androgénica (ADT), sin embargo, cada tratamiento se asocia con múltiples principales morbilidades y complicaciones^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10}. a pesar de la regresión del tumor después de ADT, se repiten casi todos los tumores como el cáncer de próstata resistente a castración (CPRP). En esta etapa, tratamientos aprobados incluyen docetaxel, inmunoterapia Sipuleucel-T y el antiandrógeno pequeñas moléculas enzalutamide y abiraterona, sin embargo, no hay terapia individual confiere un beneficio de supervivencia de más de 5,2 meses^{11, 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17}. por lo tanto, los hombres en todas las etapas del cáncer de próstata necesitan opciones de mejora del tratamiento y manejo de enfermedades, para que la enfermedad preclínica óptima modelado es crucial.

Con el procedimiento correcto, las líneas celulares de cáncer de próstata pueden ser inculcadas quirúrgicamente dentro de la próstata murina, llevando al desarrollo de ambos tumores ortotópicos syngeneic o xenogeneicos. Modelado de tumor de orthotopic es ideal para todos tumor biología y drogas desarrollo investigación, lo que permite un desarrollo de tumores con un microambiente tumoral clínicamente representativos (TME). Estudios anteriores han demostrado que los tumores subcutáneos (s.c.) tienen una vasculatura tumoral alterado, llevando a diferencial y menos clínico precisas respuestas a anti-angiogenic terapias^18,19. Además, varios estudios han observado la eficacia de aumento o disminución de varios quimioterápicos en el tratamiento de la misma línea celular, dependiendo de si es administrado s.c. o orthotopically, que representa mejor lo que se ve en humanos cáncer^20,21,22. Además, sólo en un modelo ortotópico de cáncer de colon, pero no en el modelo de s.c., tumores producen las enzimas degradativas correcto necesarias para inducir la metástasis²³. Por último, las inmunoterapias siguen apareciendo en la vanguardia de la terapia del cáncer, y especialmente deben proporcionar un beneficio significativo para el cáncer de próstata^24,25, syngeneic modelos preclínicos con TME precisa y drenaje linfáticos en anfitriones inmunocompetentes son críticos.

Hay muchos factores responsables de estos resultados inconsistentes en el sitio del tumor. Con un TME diferentes, las células cancerosas están expuestas a diferentes tejidos específicos endotelio y alteración la angiogénesis, afectando tumor desarrollo^26,27. Tumores ortotópicos con TME correcto permiten el suministro de medicamentos clínicamente relevantes, condiciones hipóxicas y evaluación de anti-angiogenic terapias²⁸. Mientras que modelos genéticamente (GEMs) contienen un TME precisa, que requieren mucho tiempo épocas de cría, alto costo y son a menudo basan en manipulaciones de uno o pocos genes noqueado o sobre expresa más allá de niveles clínicamente relevantes. En contraste, las líneas celulares de cáncer de próstata humano y murino utilizadas en tumores ortotópicos, como los tumores humanos, son genéticamente más complejas dentro de las células y en Mostrar heterogeneidad entre células^29,30. También a diferencia de gemas, ortotópico líneas celulares de cáncer pueden ser diseñadas para expresar modalidades de imágenes o aumentadas o disminución de los niveles de otras moléculas de interés y in vitro e in vivo los resultados experimentales puede compararse directamente. Ortotópica de tumores también pueden ser formados de células derivadas del paciente primarias. Aquí, divulgamos la metodología para la realización de inyecciones intra prostática de las células de cáncer de próstata que forman tumores andrógeno-dependientes de orthotopic y, después de la castración, se repiten como orthotopic del CPRP.

Protocolo

Todos los animales procedimientos descritos en este protocolo deben realizarse conforme a las normas éticas y la aprobación de la correspondiente Universidad institucional Animal Care y Comité uso (IACUC).

1. preparación de materiales quirúrgicos y las células cancerosas

1. Antes del día de la cirugía, autoclave las tijeras de disección micro, pinzas Graefe, Graefe tejido pinzas, sostenedor de la aguja con los cortadores de sutura y el número apropiado de cortinas. Esterilizar una jeringa de 50 μl y agujas calibre 28 por gas de óxido de etileno (figura 1).
2. Antes del día de la cirugía, las células de Myc-CaP de cultura en platos de 10 cm en RPMI suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% penicilina/estreptomicina (P/S) en una incubadora de 37 ° C de 5% CO₂ . Para el control de tumor bioluminiscente o fluorescente, transfectar las células 293T con los vectores apropiados y posteriormente transducir células Myc-CaP con 0.45 μm filtrado lentivirus³¹. Ordenar las células para generar una línea celular estable con 100% de positividad de transducción de señales.
   Nota: Realizar todos los cultivo de tejidos en condiciones estériles y verificar que todas las líneas de celular están libres de mycoplasma. La línea celular de cáncer de próstata murino utilizada en este estudio, Myc-CaP³², es transduced para estable expresan luciferasa de luciérnaga y mCherry. La iss de línea celular Myc-CaP aislada de un c-myc-expresando ratón Hi-myc y estas células contienen un receptor de andrógenos amplificado (AR), que son andrógeno dependientes³² y formar tumores CPRP después de castración murino³³. Todos los ratones en este estudio son ratones FVB/NJ machos de 6 a 8 semanas de edad. Líneas celulares de cáncer de próstata murino alternativa pueden utilizarse con los ratones de fondo genético apropiado, así como líneas celulares de cáncer de próstata humano o las células de cáncer de próstata primario derivado de paciente con ratones inmunodeficientes. El número óptimo de células por inyección debe determinarse empíricamente para líneas celulares alternativos. Además, las modalidades de la proyección de imagen de alternativa puede ser utilizado para visualizar tumores, incluyendo la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI), tomografía por emisión de positrones (PET) o tomografía computada (CT), así como de GFP como alternativa a mCherry.
3. La noche antes de la cirugía, colocar matrigel matriz de la membrana del sótano y sin rojo fenol en hielo a 4 º C para descongelar.
4. En el día de la cirugía, recoge las células de lavado con tampón fosfato salino (PBS) y la extracción con 0.25% tripsina-EDTA. Neutralizar la tripsina con RPMI con 10% FBS y 1% P/S.
5. Centrifugar las células a 400 x g durante 5 minutos.
6. Lavar las células con 10 mL de RPMI sin FBS o P/S.
7. Contar las células y resuspender las células en PBS a una concentración de 6.67x10⁷ células/mL (1 x 10⁶ células/15 μl).
8. Añadir un volumen igual de matrigel crear una suspensión de células de PBS/matrigel 1:1 a una concentración final de 1 × 10⁶ células/30 μl y mantener las células en hielo hasta la inyección para evitar la solidificación.
   Nota: Realizar inyecciones intra prostática dentro de 3 h de preparación de suspensiones celulares de matrigel. Si realizar inyecciones intra prostática en más de 5 ratones, repita los pasos anteriores para preparar una suspensión fresca de matrigel.

2. preparación de mouse preoperatorio

Nota: ratones de la casa en la Universidad Animalario para por lo menos una semana antes de la cirugía para permitir la adecuada adaptación y minimizar el estrés animal. Los pasos 2.1-2.6 son realizados por el Asistente de cirujano. Todos los pasos quirúrgicos subsecuentes son realizados por el cirujano usando herramientas quirúrgicas y guantes estériles con técnica estéril.

1. Anestesiar los ratones con isoflurano (2-5% para la inducción a través de la cámara, 1-3% para el mantenimiento a través del cono de nariz). Verificar la inducción completa por la pérdida del reflejo de pellizco del dedo del pie.
2. Peso de los ratones y administrar por lo menos de 0,05 mg/kg de buprenorfina analgésico s.c.
   Nota: Ratón peso ≥ 20 g es ideal para las inyecciones intra prostática exitosas.
3. Aplique lubricación ungüento oftálmico en ambos ojos para evitar la sequedad corneal.
4. Aféitese todos de piel del abdomen.
5. Esterilizar el abdomen por tres rondas de aplicación circular de lavado quirúrgico usando teclas no adherentes estériles seguidos de toallitas de alcohol estéril. Permita que el abdomen se seque.
   Nota: Para el resto del procedimiento quirúrgico, instrumentos quirúrgicos y guantes estériles pueden póngase en contacto con el abdomen de ratón esterilizada.
6. Transferir el ratón decúbito supino sobre una superficie limpia sobre una almohadilla de calefacción directamente en el objetivo de un microscopio quirúrgico limpio.
7. Cubre el ratón con un paño estéril con un pequeño orificio sobre el abdomen.

3. Intra prostática inyección

Nota: Realice todos los pasos quirúrgicos en condiciones estériles. Ajuste del microscopio, la colocación del ratón o cualquier otros objetos no estériles deben ser realizados por el Asistente de cirujano.

1. Realizar una incisión de aproximadamente 1 cm de la piel externa a lo largo de la línea media del abdomen superior a la del pene y las glándulas prepuciales (figura 1).
2. Separar el tejido conectivo entre la piel abdominal y la musculatura abdominal interna abriendo las tijeras entre las capas.
3. Realizar una incisión similar de la musculatura abdominal interna durante el uso de fórceps para levantar la musculatura para evitar perforar los intestinos o la vejiga (figura 1).
4. Localizar una de las vesículas seminales bilaterales (figura 1A, blanco) / lóbulos de la próstata anteriores (figura 1A, negro), que son a menudo posterior, lateral y ligeramente superior a la vejiga (figura 1A, amarillo), pero esto pueden variar entre ratones . El lóbulos anteriores de la próstata son translúcidos y adjunto a la curvatura menor de las blanco las vesículas seminales.
5. Suavemente Levante la punta de la vesícula seminal con el fórceps de tejido de Graefe para crear tensión en el tejido sin pinchar la vesícula seminal (Figura 1E).
6. Mezcle la solución de matrigel de Myc-CaP transfiriendo gentile (realizada por el ayudante de cirujano), como las células pueden haber peleteado y aspirar lentamente 30 μl (1 x 10⁶ células) dentro de la aguja para evitar burbujas de aire.
7. Introduzca con cuidado el bisel de la URL de la aguja al eje largo del lóbulo anterior de la próstata. Lentamente inyecte 30 μL en el lóbulo y retraiga lentamente la aguja para evitar fugas (Figura 1F). Verificar adecuada inyección por congestión de próstata lóbulo anterior (figura 1).
8. Mantener cuidadosamente la vesícula seminal y lóbulo prostático inyectado fuera de ratón de aproximadamente 30 s para permitir matrigel solidificar parcialmente dentro del lóbulo. Durante este tiempo, recoger cualquier fuga de solución de la célula en el abdomen usando un aplicador con punta de poliéster estéril para evitar desarrollo de tumor no ortotópico, sin presionar sobre el lóbulo prostático inyectado.
9. Cuidadosamente regrese la vesícula seminal y lóbulo prostático inyectado en el abdomen sin ejercer presión sobre el lóbulo. Reemplazar cualquier tejido externalizada.
10. Realizar sutura continua para cerrar la musculatura abdominal interna con suturas de 5-0 vicryl absorbible corte inversa aguja.
11. Realizar suturas interrumpidas para cerrar la piel abdominal con suturas de aguja de corte inverso no absorbible de monofilamento de 4-0 nylon.
    Nota: Grapas esterilizada de 9 mm pueden utilizarse también para cerrar la piel abdominal externa. Sin embargo, en contraste con las suturas, interfieren con cualquier tumor bioluminiscente y fluorescente posterior señal de imagen.
12. Limpie todas las herramientas con toallitas estériles etanol (abiertos por el Asistente de cirujano) y colocarlos en un esterilizador de bolas de cristal para permitir s. 30 herramientas para secar antes del uso del ratón siguiente.
13. Enjuague la jeringa y la aguja con solución salina estéril (abierta por el Asistente de cirujano) para evitar que se obstruya por remanente matrigel.
    Nota: Un asistente del cirujano debe estar presente para todas las operaciones, realizar preparación preoperatoria ratón todo estéril y cuidado postoperatorio del ratón, así como para mezclar la solución de matrigel Myc-CaP antes de las inyecciones. Para minimizar el tiempo, como cada procedimiento intra prostática ratón requiere 20-30 min, el ayudante del cirujano puede comenzar a preparar el próximo ratón como el cirujano sutura el ratón actual.

4. postoperatorio del ratón cuidado

1. Administrar 1 mg/kg de meloxicam analgésico s.c. inmediatamente, 24 h y 48 h después de la cirugía.
2. Permiten ratones recuperar en una jaula con no ropa de cama colocado a mitad de camino en un cojín de calefacción. Controlar ratones durante al menos 30 minutos después de la cirugía hasta que recuperaran movilidad normal y la actividad, después de que coloque en una jaula limpia con alimento en el piso de la jaula.
3. Monitor más ratones diariamente para la correcta cicatrización de heridas, peso corporal, aseo y paseo después de la cirugía. Ratones separados en jaulas individuales sobre cualquier evidencia de la lucha.
4. Retire cualquier suturas restantes dentro de 14 días después de la cirugía.

5. proyección de imagen de Tumor bioluminiscente

1. Preparar Na filtrado estéril⁺ o K⁺ D-luciferin, como descrito por el fabricante y protegido de la luz.
2. Inyectar a ratones intra peritoneally con 10 μl/g de peso corporal de luciferin.
3. Por lo menos 10 minutos más tarde, ratones de la imagen con un sistema de proyección de imagen de espectro de IVIS, como se describió anteriormente^34,35.
4. Analizar imágenes usando vida Software de imagen, como describió anteriormente^34,35.
   Nota: IVIS análisis de imagen es útil para determinar éxito inyecciones intra prostática y el desarrollo de tumor inicial para normalizar la carga del tumor entre los grupos experimentales. Sin embargo, dependiendo de la intensidad de la señal fluorescente o bioluminiscente, saturación puede causar una meseta en la cuantificación de la imagen a pesar de un aumento en el tamaño tumoral real. Por lo tanto, en las últimas etapas del crecimiento del tumor, proyección de imagen de IVIS puede ser más útil para determinar las disminuciones en el tamaño del tumor al tratamiento acertado que aumenta de tamaño después de la saturación de la imagen.

6. tumor colección, análisis del Tumor, supervivencia extremo

1. Si recoger el tumor para su análisis, humanamente eutanasia ratones por exposición a CO₂ y dislocación cervical secundaria, o por métodos alternativos de IACUC aprobado y diseccionar los tumores del abdomen. Los tumores deben ser orthotopically situado en la próstata.
   Nota: Los tumores atado a la pared abdominal anterior o sembradas en todo el abdomen indican pobre o con fugas de inyección intra prostática y no deben considerarse como tumores ortotópicos.
2. Peso de los tumores.
3. Calcular el volumen del tumor como π/6 × L × W × H (L = longitud del eje mayor del tumor, W = ancho perpendicular, H = altura perpendicular).
4. Los tumores pueden ser analizadas por la histología (arreglo en 10% formalina tamponada neutra), citometría de flujo (crear suspensiones celulares solo), proteína (preparar tejido lisado en almacenador intermediario RIPA), o el RNA (inmediatamente lugar tejido en RNAlater).
5. Para análisis inmunológicos, también recogen los próstata tumor-drenaje paraaórticos ganglios linfáticos (figura 1B, naranja) y el bazo.
   Nota: Si después de ratones para la supervivencia, el punto final de este modelo se define como la aparición de ascitis abdominal hemorrágica³⁶ o disminución de ambulación, grooming y piloerección³⁷. Ratones para análisis de supervivencia reciban analgesia pre y postoperatoria (pasos de protocolo 2.2, 4.1) y deben ser vigilados regularmente. Ratones deben ser separados en jaulas individuales si cualquier lucha se produce y debe ser sacrificado humanitariamente a la aparición de cualquiera de las anteriores lecturas de punto final.

7. quirúrgica castración a modelo CPRP

1. Para modelo CPRP, realizar el anterior protocolo de inyección intra prostática (pasos 1-5 del Protocolo).
2. Por lo menos una semana más tarde, después del desarrollo del tumor, realizar castración quirúrgica mediante cauterización, como se describió anteriormente³⁸.
3. Monitorear regresión del tumor y la recurrencia de imágenes bioluminiscentes. Después de la castración, se producirá la regresión del tumor dentro de 3 días y recurrencia tumoral se producirá en aproximadamente 30 días, representando CPRP.

Resultados

En este manuscrito, quirúrgicamente inyectamos la línea celular de cáncer de próstata murino, Myc-CaP, en el lóbulo anterior de la próstata (figura 1A), llevando al desarrollo de tumores de próstata ortotópico con un TME clínicamente relevante y la correcta próstata-drenaje linfáticos (figura 1B). Esto se realizó con tijeras micro disección Graefe fórceps, Graefe tejido pinzas, un sostenedor de la aguja con los cortadores de sutura y una jeringa de 50 μL con una aguja de calibre 28 (figura 1). Tras realizar una incisión aproximadamente 1 cm de la línea media abdominal por encima de las glándulas prepuciales (figura 1), una vesícula seminal y adjunto anterior lóbulo prostático fueron localizados y exteriorizado (Figura 1E) y 30 μl (1 x 10⁶ células) de un Suspensión 1:1 PBS/matrigel se inyectó en la próstata (Figura 1F), verificada como inicialmente por la hinchazón de los senos del lóbulo y la falta de salida (figura 1).

Para supervisar el crecimiento del tumor ortotópico, nos estable transfected las células Myc-CaP para expresan luciferasa de luciérnaga y mCherry, permitiendo tumores seguida de invasiva en vivo bioluminiscencia (figura 2A) y fluorescencia (figura 2B), respectivamente. Una limitación de esta imagen es que, dependiendo de la intensidad de la señal, la cuantificación de la proyección de imagen puede saturar mientras que el tumor continúa creciendo en tamaño. Por lo tanto, con intensidades de la señal alto, esta en vivo la proyección de imagen es más útil para normalizar inicialmente carga tumoral a través de grupos experimentales y para más adelante determinar disminución en el tamaño del tumor después de tratamientos experimentales. Modalidades de imágenes adicionales también pueden ser utilizadas, como el pequeño animal PET y MRI y CT.

Tumores ortotópicos fueron disecados del abdomen en 30 días después de la inyección intra prostática (Figura 3A). Tumores ortotópicos deben estar ubicados en el sitio del lóbulo anterior de la próstata. Tumor de masas en el abdomen o fijada a la pared abdominal anterior indicar inadecuada inyección intra prostática y fugas. Con la técnica adecuada, se pueden grabar con error estándar relativamente pequeño volumen del tumor (figura 3B) y peso (figura 3). Sin embargo, como se observa, habrá cierta variabilidad con las masas de tumor pequeño y grande. Por lo tanto, su uso inicial de la cuantificación de imágenes de pretratamiento para igualar la carga del tumor entre los brazos experimentales es fundamental para todos los experimentos. Además, como estas células cancerosas murinas fueron inyectadas en ratones FVB/NJ inmunocompetentes, lo TME puede ser analizada por inmunohistoquímica (IHQ) (o citometría de flujo u otras técnicas) de las células de T de CD3 (figura 3D) (u otros tipos de células inmunes). Por último, este modelo proporciona un punto final objetivo de supervivencia, como el tumor primario grande causas masivo hemorrágico ascitis abdominal³⁶ (figura 3E) o disminución de ambulación, grooming y piloerección³⁷. En ocasiones, la muerte también puede ser causada por el crecimiento del tumor bloqueando la salida de la orina.

Por último, este modelo puede ser utilizado para estudiar el cáncer de próstata andrógeno-dependiente y CPRP, el último de los cuales confiere mal pronóstico y necesita opciones de nuevo tratamiento. Después del desarrollo de tumor de orthotopic, ratones fueron castrados quirúrgicamente, como se describió anteriormente³⁸. Es la segunda cirugía mayor supervivencia, adicional debe tener cuidado con seguimiento de recuperación y cualquier eventos adversos o complicaciones. Dentro de 3 días después de la castración, se observó regresión del tumor fuerte, seguido de posteriores recidivas después de aproximadamente 30 días, representando el CPRP (Figura 4A). Tumores CPRP pueden disección y análisis histológico y no muestran ninguna diferenciación neuroendocrina, ya que mantienen altos niveles de AR y son negativos para el marcador neuroendocrino, sinaptofisina (Figura 4B).

Figura 1: lóbulo Anterior próstata, drenaje de los ganglios linfáticos y representante técnica de inyecciones de células intra prostática. Imágenes del lóbulo prostático anterior derecha (A) (negro, *), une la vesícula seminal derecha (blanco), derecha testículo y cojín gordo (verde) y vejiga (amarillo), (B) bilateral próstata drenaje paraaórticos ganglios linfáticos (naranja), (C) tijeras disección micro, Graefe pinza, Graefe tejido pinzas, un sostenedor de la aguja con los cortadores de sutura y 50 μl jeringa con aguja de calibre 28 (de izquierda a derecha), incisiones de la línea media (D) , (E) la vesícula seminal y anterior del lóbulo prostático externalización, (F), inyección intra prostática y congestión (G) del lóbulo anterior de la próstata. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: En vivo bioluminiscente y fluorescente tumor proyección de imagen de. (A) (B) y luciferasa mCherry-expresar tumores ortotópicos Myc-CaP se reflejada mediante un sistema de proyección de imagen de espectro de IVIS. Bioluminescence se cuantificó por flujo total (fotones/s). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Análisis de tumor ortotópico por peso, volumen del tumor, histología de infiltración inmune y la supervivencia. Tumores ortotópicos se diseca el día 30 después de la inyección intra prostática y se analizaron por (A) proyección de imagen, (B) tumor volumen bruto (π/6 × L × W × H; L = longitud del eje mayor del tumor, W = ancho perpendicular, H = altura perpendicular), (C) peso del tumor, (D) CD3 IHC (barra de escala = 100 μm) y (E) la supervivencia, con el criterio de valoración objetiva como la aparición de hemorrágico abdominal ascitis. (A-B) Datos representados como media ± error estándar de la media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: inyecciones Intra prostática posterior castración quirúrgica para cáncer de próstata andrógeno-dependiente y CPRP. (A) ratones tumores expresan luciferasa ortotópico fueron reflejadas por bioluminiscencia pre y post castración (Cx), y (B) se repitió CPRP tumores fueron disecados (negro = orthotopic del tumor de la próstata; amarillo = vejiga) y analizadas por H & E, IHC AR y el synaptophysin IHC (con control positivo murino) (barra de escala = 50 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

En este manuscrito Contorneamos el protocolo para realizar inyecciones de células de cáncer prostático intra quirúrgica. Utilizamos el andrógeno-dependiente y MYC -overexpressing (MYC sobreexpresión es vista a 80-90% de cáncer de próstata humano³⁹) línea de celular del murino de cáncer de próstata, Myc-CaP, aislado originalmente de la Hi-Myc ratón^{32 ,33}. Esta línea celular fue transduced estable para expresan luciferasa y mCherry, no invasivo en vivo imagen de tumor bioluminiscente y fluorescente, respectivamente. También se realizó la castración quirúrgica, más después del desarrollo de tumor dependiente de andrógenos, conduce a la regresión del tumor y la recurrencia posterior. Por ello, ofrecemos información para el cáncer de próstata andrógeno-dependiente ortotópico y CPRP en un anfitrión inmunocompetente.

MYC-CaP las células se inyectan en el lóbulo anterior de la próstata de ratones. La próstata del ratón consiste en los lóbulos anteriores, ventrales y dorsolateral de próstata y la próstata humana consiste en una zona periférica, zona transicional y zona central dentro de un solo lóbulo⁴⁰. Mientras que estudios anteriores han comparado anatómico e histológico del lóbulo dorsolateral del ratón al humano periférico de la zona, el sitio de la mayoría de los cánceres de próstata⁴¹y el lóbulo anterior del ratón a la zona central humano^{42, 43}, más reciente y amplio análisis ha demostrado que el lóbulo anterior y lóbulo dorsolateral muestran patrones de expresión de genes estrechamente relacionados, en comparación con el lóbulo ventral. ⁴⁴ además, desarrollo de cáncer de próstata se ha observado en el lóbulo anterior de gemas⁴⁰y, para el procedimiento intra prostática, lóbulo anterior permite la inyección del volumen necesario de solución de la célula de cáncer con fuga mínima y variabilidad.

Utilizando s.c. y Gema transgénica modelos de cáncer tienen varios defectos y limitaciones. S.c. los tumores en un TME artificial tienen respuestas diferenciales a las quimioterapias, en contraste con ambos tumores ortotópicos de la misma línea celular y enfermedad humana^20,21,22. Esto puede ser debido a la vasculatura alterada de tumores s.c., como ejemplificado por su diferencial respuesta a anti-angiogenic terapia^18,19. Por el contrario, los tumores orthotopic desarrollan un TME adecuado drenaje de los ganglios linfáticos y vasculatura y pueden realizarse con líneas celulares murinas, de tal modo también permitiendo análisis de Inmunología tumoral y respuesta a las inmunoterapias.

Gemas de transgénicos desarrollan tumores con un TME apropiado en un anfitrión inmunocompetente, sin embargo, estos modelos normalmente oversimplify cáncer humano mediante el desarrollo de tumores con alteraciones genéticas solo o pocos²⁹. Un análisis de Myc-CaP y otras líneas celulares de cáncer de próstata reveló que contenían mucho mayor alteraciones de número de copia somáticas y alteraciones cromosómicas que los tumores de los ratones Hi-Myc y otras gemas que eran derivados²⁹. Además, gemas están limitadas por el aumento de los costos y el tiempo necesario para los ratones de cría para realizar experimentos de suficiente potencia. Modelado de orthotopic tumor puede superar estas limitaciones. Líneas celulares de cáncer de próstata humano y murino contienen muchas alteraciones genéticas relevantes para la enfermedad humana²⁹y, como cáncer en humanos, también muestran gran heterogeneidad entre las células individuales³⁰. Tumores syngeneic murinos ortotópico permiten análisis inmunológicos, mientras orthotopic tumores xenogeneicos humanos permiten análisis de la terapéutica de células humanas. Finalmente, a diferencia de con gemas, célula líneas pueden ser modificadas antes de la inyección, lo que permite expresión de bioluminiscente o fluorescente de moléculas para controlar el crecimiento del tumor, normaliza la carga del tumor entre los grupos experimentales, vigilar la respuesta al tratamiento y a Siga la regresión del tumor y la recurrencia de CPRP después de la castración quirúrgica.

Pasos críticos en este protocolo incluyen localización y externalizar la vesícula seminal y el adjunto anterior lóbulo prostático sin dañar otros tejidos o punción de la vesícula seminal, realizar un acertado inyección intra prostática de 30 μl de células suspensión sin salida y recogida adecuadamente cualquier fuga para prevenir el desarrollo de tumor no orthotopic en todo el abdomen. La limitación principal de inyecciones intra prostática es lograr la habilidad técnica necesaria para minimizar la variabilidad de tumor entre ratones. Esto es especialmente importante para el modelado de CPRP, que tiene la variable agregada de la castración quirúrgica. Ratones intra-prostatically inyectados y castrados deben también ser seguidos de cerca para la recuperación y los eventos adversos, como han sometido a dos cirugías de mayor supervivencia. Otra limitación es el tiempo de cada inyección intra prostática. Esto se puede reducir a como bajo como 20 min y el cirujano asistente puede preparar el siguiente ratón como el ratón actual está siendo suturado. Por último, los tumores orthotopic Myc-CaP son agresivos, rápido crecimiento tumores que alcanzan el extremo de supervivencia en aproximadamente 46 días (y ya en 35 días) debido al tumor primario total. Estudios que requieren de más lento desarrollo del tumor o tratamientos a largo plazo deben optimizarse empíricamente para el régimen de cuenta y tratamiento de células de inyección inicial. En contraste con las limitaciones de tumores s.c. y joyas, todos de las limitaciones del modelo ortotópico tumor pueden superar, y pueden hacer modificaciones adicionales del protocolo basados en necesidades experimentales.

Como el trasplante orthotopic del modelo de tumor implica el uso de vitro-mango, estas células pueden ser modificadas dependiendo de las necesidades del estudio. Aquí, modificamos estas células para estable expresan luciferasa y mCherry en vivo seguimiento tumoral. También hemos realizado un nocaut en el Cas9 CRISPR del supresor del tumor PTEN, para generar una línea más agresiva, clínicamente relevante de la célula que crece más rápido como tumores ortotópicos (manuscrito en revisión). Con las ventajas del modelo ortotópico de tumor, la capacidad para el estudio de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y CPRP tanto el potencial de expresar modalidades de imágenes o caída o sobrexpresan genes selectos, este protocolo sirve como un valioso recurso para todos investigación de cáncer de próstata.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Myc-CaP cell line	ATCC	CRL-3255	Verify as mycoplasma-free before use
Micro-dissecting scissors	Roboz	RS-5910
Graege forceps	Roboz	RS-5135
Graefe tissue forceps	Roboz	RS-5150
Olsen-Hegar needle holder with suture cutters	FST	12002-12
50 µL Syringe 705 RN SYR	Hamilton	7637-01	Sterilize by ethylene oxide gas
28-gauge Needles Small Hub RN	Hamilton	7803-02	Point style 4, Angle 45°, Length 0.75 in. Sterilized by ethylene oxide gas
RPMI	Gibco	18875-093
FBS	Gibco	10437-028
Pencillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
PBS	Gibco	14190-144
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Matrigel basement membrane matrix, phenol red-free, LDEV-free	Corning	356237	Thaw on ice in 4°C overnight before use
Isoflurane	Henry Schein	11695-0500-2	Acquired from Northwestern University Center for Comparative Medicine (CCM)
26 5/8-gauge syringe	BD	309597	For meloxicam and buprenorphine injections
Buprenorphine hyrochloride 0.3 mg/mL		12496-0757-5	Controlled substance, acquired from Northwestern University CCM
Ophthalmic ointment lubrication	Akron	17478-162-35
Betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%)	Purdue Products	67618-151-16
Sterile non-adhering pads	Moore Medical	10775
Sterile alcohol wipes	Fisher Scientific	22-363-750
Surgical microscope Stemi DV4	Zeiss
Sterile polyester tipped applicators	Puritan	25-806 1PD
5-0 vicryl absorbable reverse cutting needle sutures	eSutures	J493G
4-0 nylon monfilament non-absorbable reverse cutting needle sutures	eSutures	699H
Glass bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Sterile saline 0.9% sodium chloride	Hospira	0409-4888-02
Meloxicam (Eloxiject) 5 mg/mL	Henry Schein	11695-6925-1	Acquired from Northwestern University CCM
D-luciferin Firefly, sodium salt monohydrate	Goldbio	LUCNA
IVIS Spectrum Imaging System	PerkinElmer
Cauery surgical pen	Bovie Medical Corporation	AA01
CD3ε antibody (clone 2GV6)	Ventana	790-4341
Caliper	Fisher Scientific	14-648-17
Androgen receptor antibody	Thermo Scientific	RB-9030-P1	1:500 staining dilution
Synaptophysin antibody (clone Z66)	Life Technologies	18-0130	1:200 staining dilution