Microdisección de segmentos de tejido Renal primaria y la incorporación con la tecnología de construcción de andamio-libre nuevo

Resumen

Ingeniería de tejido renales construcciones proporcionan una solución para la escasez de órganos y los efectos deletéreos de la diálisis. Aquí, describimos un protocolo micro disecar riñones murinos para el aislamiento de segmentos córtico-medular. Estos segmentos están implantados en construcciones celulares libre de andamio, formando organoides renal.

Resumen

Trasplante de riñón es ahora una terapia convencional para la insuficiencia renal. Sin embargo, con aproximadamente 96.000 personas en la lista de espera y sólo una cuarta parte de estos pacientes conseguir trasplante, hay una extrema necesidad de alternativas para aquellas personas con falta de órganos. Para disminuir las consecuencias perjudiciales de diálisis junto con los costos en general profesional de la salud que ha incurrido, investigación activa está trabajando en la búsqueda de soluciones alternativas al trasplante de órganos. Construcciones celulares renales tejido-dirigida implantables son uno de los enfoques viable para reemplazar la funcionalidad renal perdida. Aquí, se describe por primera vez, es la microdisección de riñones murinos para el aislamiento de vivir corticomedullary segmentos renales. Estos segmentos son capaces de rápida incorporación dentro de construcciones de andamios gratis endoteliales fibroblastos que puede permitir la conexión rápida con vasculatura anfitrión una vez implantado. Riñones de ratón adulto se obtienen de donantes vivos, seguidos por el microdissection del Estereoscopio para obtener segmentos renales 200-300 μm de diámetro. Múltiples construcciones renales fueron fabricadas con segmentos renales primarios de único riñón. Este método muestra un procedimiento que podría salvar tejido renal funcional de órganos que de lo contrario serían descartados.

Introducción

Enfermedad renal crónica (ERC) es una de la actual salud pública desafíos en todo el mundo¹. La prevalencia de ERC en Estados Unidos es más 14% de la población total, con más de 600.000 estadounidenses sufren de la forma más grave, la etapa del extremo enfermedad renal (terminal ERT)². Las actuales opciones de tratamiento disponibles para aquellos con ERT incluyen trasplante de la diálisis y los riñones. Aunque aproximadamente 25.000 pacientes se someten a trasplante renal cada año, un número significativo de pacientes se agrega anualmente llevando a una gran disparidad entre aquellos en espera de un órgano vital y ésos receptores de trasplante³. Además de sus graves efectos negativos sobre la longevidad y calidad de vida, la diálisis se asocia con una sorprendente carga financiera. En 2014, Medicare pagada los reclamos sumaron sobre $ 30 billones para los pacientes ESRD². Con un suministro limitado de órgano y no tendencia bajista aparente en pacientes que requieren diálisis, esfuerzos de investigación destinados a determinar soluciones alternativas a la diálisis y el trasplante son siempre importantes. Incluso un relativamente breve retraso en la necesidad de diálisis aumenta número de un paciente de años de vida ajustados por calidad y productividad substancialmente y aplazamiento de gastos relacionados con la diálisis^4,5,6.

Soluciones para la pérdida de tejido funcional, como en ERT, se están estudiando actualmente en la ingeniería de tejidos y laboratorios de la medicina regenerativa, con enfoques muy variados desde organoide basadas en andamios fabricación órgano entero usando ingeniería decellularized estructuras del órgano para implantación celular^7,8,9,10,11. Recapitulando complejas estructuras renales de los riñones marginales o desechados sólo parcialmente ha sido investigada. De hecho, casi 20% de riñones para trasplante son descartado por diversas razones^12,13. El tejido renal funcional de estos supuestos injertos podría utilizado e incorporado en uno o varios constructos tejido-dirigida. Estudios previos han demostrado la viabilidad de trabajar con estos órganos desechados, utilizando riñones de la matriz extracelular de tejidos con fines de ingeniería^14,15. Sin embargo, pocos han utilizado primario del tejido nephronal de los riñones sanos para ingeniería de tejidos con fines^16,17,18.

Un método previamente descrito por Kim et al. implica aislamiento de "segmentos" renales de riñones de ratas sanas, que luego fueron sembrados en los andamios (PGA) ácidos poliglicólico para la construcción fabricación¹⁶. Sin embargo, poca información se da con respecto a la metodología de disección exacta y se obtuvieron segmentos de una combinación de filtración y picar fino. Se describe una modificación de este protocolo, que produce igualmente discretos segmentos renales con arquitectura nephronal intacta, pero en cambio se basa en técnicas de microdisección. Nefrectomías se realizan en la vida de ratones adultos, después de que los riñones se transfieren al microscopio de disección donde se quita la cápsula renal, y además se diseca el tejido. Agujas 30½ G pequeño tamaño se utilizan como instrumentos de corte y también como guías de ayuda en la disección, como la aguja diámetro es igual al diámetro del objetivo de los segmentos renales. Los segmentos aislados, en este caso murinos, renales mantienen viabilidad en cultivo e incorporan con construcciones celular libre andamio endoteliales fibroblastos¹⁹. Estas construcciones se han utilizado anteriormente para otros órganos, incluyendo páncreas bio-artificial²⁰.

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Protocolo

Todos los procedimientos quirúrgicos animal que se describen a continuación fueron aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité uso (IACUC) en la Universidad médica de Carolina del sur antes de alguna cirugía animal o uso de cualquier tejido animal.

1. murina nefrectomía

1. Don una máscara quirúrgica y el casquillo bouffant para minimizar el riesgo de contaminación. Mantener la esterilidad durante la preparación del área quirúrgica.
   1. Coloque cortinas quirúrgicas no fenestrados en la mesa de operaciones.
   2. Abra el paquete de instrumentos esterilizados en las cortinas estériles. Los instrumentos requeridos para la nefrectomía incluyen 3 pinzas hemostáticas pequeñas, finas pinzas con dientes, pinzas finas sin dientes y tijera de iris recta.
   3. Coloque otro no-quirúrgico fenestrado en el centro de la mesa de operaciones.
   4. Preparar 5 mL de Dulbecco fosfato tampón salino (DPBS) con calcio y magnesio, suplementado con 1% de penicilina/estreptomicina en un tubo cónico estéril de 15 mL. Colocar esta solución en el hielo junto a la mesa de operaciones.
2. Obtener un ratón C57BL/6 de 8-12 semanas de edad (hombre o mujer) del complejo de alojamiento de los animales.
3. Coloque el mouse dentro de una cámara de inducción de la anestesia e inducir con 3.5% inhalado isoflurano. Colocar un cono de nariz del ratón, uso de isoflurano 2% para anestesia de mantenimiento.
   1. Monitor para la adecuada profundidad de la anestesia periódicamente durante el procedimiento quirúrgico mediante la evaluación para el reflejo pedal (pellizco firme del dedo del pie).
4. Quitar todo el pelo del torso ventral con crema depilatoria. Lavar esta zona con agua destilada para asegurarse de que haber eliminado todo el pelo del abdomen.
5. Transferir el ratón a la mesa de operaciones estéril en posición supina en la superior no-fenestrado. Corte un hueco de 2 x 2 cm² en el paño a cubrir el abdomen de ratón.
6. Aplicar povidona-yodo seguida de etanol al 70% en el abdomen utilizando bolas de gasa o algodón estériles.
7. Con unas pinzas finas con los dientes y iris tijeras, hacer una incisión en la piel abdominal vertical 3-4 cm paralelo a la línea media, 0,5 cm a la izquierda de línea media
   Nota: Si intenta quitar el riñón derecho, se trata de una incisión de 0,5 cm a la derecha de la línea media.
   1. Sujete el peritoneo con pinza fina sin dientes y haga una incisión con tijeras de iris para entrar en la cavidad abdominal. Pinzas hemostáticas se aplican a los bordes laterales superiores e inferiores de la piel y el peritoneo lateralmente la tensión y mejorar la exposición.
   2. Desplaza el contenido intestinal delicadamente hacia el lado derecho del abdomen para exponer el riñón izquierdo. Coloque suavemente la tracción en el riñón para elevarlo fuera del abdomen.
   3. Coloque una pinza hemostática en el hilum del riñón izquierdo. Utilice tijeras de iris a transectos el uréter y los vasos renales.
   4. Coloque el riñón izquierdo en el 1% solución de DPBS de penicilina/estreptomicina en el hielo.
   5. La transferencia al tubo que contiene el riñón a la campana de cultivo estériles para tejidos. Traslado del riñón del tubo cónico de 15 mL a un plato de petri de 60 mm (figura 1). Enjuague dos veces con 5 mL DPBS calcio y magnesio. Mantener el riñón suspendido en 5 mL DPBS en el plato de 60 milímetros.
      1. Preparar un plato de petri 60 mm adicional con 5 mL DPBS para ser utilizado durante el protocolo del microdissection.
   6. Eutanasia el ratón por toracotomía y exsanguination tras la consecución del riñón, según un protocolo animal IACUC aprobado.

2. microdisección de riñón murino para el aislamiento del segmento Renal

1. Seguir utilizando una técnica estéril para esta parte del Protocolo, incluyendo guantes estériles, mascarilla quirúrgica y cardado para minimizar el riesgo de contaminación.
   1. Lugar estéril cortinas en la plataforma de microscopio estéreo, así como las áreas a la izquierda y derecha del microscopio para tener un campo estéril para los instrumentos. Coloque hojas adhesivas de plástico en las perillas de enfoque del microscopio y rocíe con etanol al 70%. Encender el iluminador doble cuello de cisne a la luz de la etapa.
   2. Abierto los instrumentos esterilizados (finas pinzas sin dientes, mango de bisturí, hoja de bisturí #15, dos pinzas hemostáticas rectas, dos 30½ medidor de agujas hollow-agujeree) sobre cortinas estériles. Lugar #15 hoja sobre el bisturí Mango ahora y colocar una pinza hemostática para cada adaptador/eje de la aguja para crear instrumentos de disección de la aguja para uso posterior, como se muestra en la figura 1.
2. Mueva las cajas Petri 60 mm, con el riñón en DPBS y la DPBS única, de la campana de cultivo de tejidos en el área de microscopio.
   1. Coloque el plato de petri 60 mm bajo el objetivo y retire la tapa para exponer el riñón. Deja el plato que contiene la DPBS al lado en el campo estéril para su uso posterior.
   2. Mueva el plato de manera que sólo la superficie anterior o posterior del riñón está a la vista (es decir, la cara plana grande del riñón, con la otra cara toque el fondo del plato). Zoom x 4 3.2 para esta parte del procedimiento. La mano no dominante, utilizar finas pinzas sin dientes para perforar y el riñón del perno contra el plato cerca de los polos superiores e inferiores del riñón.
   3. Mantenga la mano no dominante en el lugar para fijar el riñón. Con la mano dominante, use la hoja #15 para quitar la capa capsular fibrosa translúcida de la superficie expuesta. Afeitarse el 0,5 mm más superficial de la superficie expuesta del riñón para eliminar el resto de la cápsula.
   4. Use la hoja #15 para disecar una pirámide invertida de tejido de la zona de decapsulated, aproximadamente³ de 2 mm de tamaño. Recuperar el plato de 60 mm que contienen sólo DPBS y colocar la pirámide de tejido en el plato limpio. Deseche el resto del riñón.
   5. Disminución aumento a 1.5-2.0 X para el resto de la disección. Utilizando dos instrumentos de aguja pinza hemostática como instrumentos de corte, cortar el fragmento de tejido en partes progresivamente más pequeñas hasta que los segmentos de tejido están menor o igual al diámetro de las puntas de aguja. Una de 2 mm de tejido renal³ tamaño producirá más de 50 segmentos una vez completamente disecados.
   6. Mover el plato de 60 mm con segmentos renales a la campana de cultivo de tejidos. Quite la DPBS con pipeta de 1000 μl. Añadir 5 mL DMEM, suplementado con 10% suero bovino Fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina.
   7. Cultura durante 3 días a 37 ° C en una incubadora o implante en construcciones celulares inmediatamente.

3. renal segmento celular construcción fabricación

1. Fibroblastos dérmicos humanos normales cultura (NHDF) y adiposas microvasculares células endoteliales humanas (HAMEC) durante varias semanas obtener 7,2 x 10⁵ fibroblastos y 1,8 x 10⁵ células endoteliales por construcción deseada. En la campana de cultivo de tejidos, semilla de la proporción adecuada de los fibroblastos a las células endoteliales (4:1) en los pocillos en forma en moldes de agarosa para formar libre andamio pre-vasculares endoteliales fibroblastos construcciones (espec.) como se describió anteriormente de Czajka et al. ¹⁹.
2. Obtener una pinza esterilizada, aguja 30½ y una espátula estéril con punta plana.
   1. Retirar la mayoría de los medios de comunicación de la placa de 60 mm que contienen segmentos renales, teniendo cuidado de no aspirar y retirar los segmentos renales.
   2. Equiparse con lupas quirúrgicas visualizar la implantación de los segmentos.
   3. Raspar el extremo de la espátula suavemente a lo largo de la parte inferior del plato 60 mm para obtener segmentos de 10-15, repartidos uniformemente a lo largo de la punta de la espátula. Coloque la punta de la espátula lo más cerca posible al borde del pozo donde fue sembrada la especificación.
   4. Utilizar un instrumento de aguja pinza-30½ G en la otra mano mover cada segmento individual de la punta de la espátula en el borde del pozo. Mueva suavemente cada segmento hacia abajo en el bien con la punta de la aguja hasta que ligeramente sumergida en la suspensión celular previamente sembrada.
   5. Segmento renal-SPEC en 2 la cultura: relación 1:1 de medio de la mutilación genital femenina-2/EGM-2/DMEM (volumen de 2.5 mL total). Cambiar el medio de cultivo cada 24 h durante 3 días. Eliminar las construcciones de los moldes a las 72 h y fijar o flash-freeze para el procesamiento.

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Resultados

El protocolo descrito produce aproximadamente 50 segmentos renales por sección de³ piramidal de 2 mm de tejido renal. Los segmentos renales que han sido procesados y reflejada tienen componentes glomerulares y tubulares en diferentes proporciones (ver figura 2). Los segmentos intactos fueron sometidos a un análisis para determinar la viabilidad de diferentes segmentos una vez cada 24 h durante tres días. Verde fluorescente calceína-AM está pre...

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Discusión

Métodos utilizados para tejido renal vivo constructos varían ampliamente en relación con el tipo de células y biomateriales utilizados y en muchos casos, son obsoletos o no bien caracterizado en la literatura⁷. Mientras que muchos utilizan enfoques de la célula de vástago o recapitulando los componentes individuales de la arquitectura renal aislada, es la posibilidad de recrear artificialmente un órgano entero con más de 26 tipos diferentes de célula diferenciada de suspensiones celulares...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Non-fenestrated Sterile Field	Busse Hospital Disposables	696
Fenestrated Sterile Field	Busse Hospital Disposables	697
Halsted Mosquito Forceps 5 Curved	Miltex	Mil-7-4	"Hemostat" in manuscript
Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teeth	Fine Science Tools	11155-10	Fine forceps with teeth
Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth)	Fine Science Tools	11152-10	Fine forceps without teeth
Fine Scissors - Tungsten Carbide	Fine Science Tools	14568-09	Iris Scissors
Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5%	Purdue Products L.P.	67618-151-17
Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4")	Fisher Healthcare	22-415-469
Dulbecco's Phosphate Buffered Solution	Corning	21-030-CV
Penicillin/Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-Cl
Isoflurane, USP	Manufacturer: Piramal, Distributor: McKesson	2254845
Nair Hair Remover	Nair	22600-23307	Hair Removal Cream in text
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2705	Diluted to 70% Ethanol Solution
BioLite 60mm Tissue Culture Dish	Themo-Scientific	130181
Press'n Seal	Glad	12587-70441	Applied to Stereoscope
SZX16 Stereo Microscope	Olympus	SZX16
Fiber Optic Illuminator	Cole Parmer	41720-20
Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L Gooseneck	Cole Parmer	EW-41720-60
Scalpel Handle #3	Miltex	Mil-4-7
Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15	Bard-Parker	371115
31 1/2 Gauge Needle	ThermoFisher Scientific	14-826F	Becton Dickinson 305106
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Corning	10-017-CV
Fetal Select 100% Bovine Serum	Atlas Biologicals	FS-0500-AD
Normal Human Dermal Fibroblasts	Lonza	CC-2511
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells	Sciencell Research Laboratories	7200
Surgical Loupes (2.5x)	Orascoptic	(N/A) Custom Order
FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added)	Lonza	CC-3131, CC-4126
EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added)	Lonza	CC-3156, CC-4176
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells	ThermoFisher Scientific	L3224
Anti-Cytokeratin-18 Antibody	Abcam	ab668
Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633	ThermoFisher Scientific	A-21052
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546	ThermoFisher Scientific	A-11010
Anti-Von Willebrand Factor Antibody	Abcam	ab6994
Albumin, Fluorescein isothiocyanate Conjugate	Sigma Aldrich	A9771-50MG
Hoescht 33342	BD Pharmingen	561908
Background Buster	Innovex Biosciences	NB306