Caracterización de biopelículas acuáticas con citometría de flujo

Resumen

Citometría de flujo en combinación con agrupamiento visual ofrece un método rápido y fácil de usar para el estudio de biopelículas acuáticas. Puede ser utilizado para la caracterización de biopelículas, detección de cambios en la estructura de la comunidad de biofilm y la detección de partículas abióticas en el biofilm.

Resumen

Los biofilms son dinámicos consorcios de microorganismos que desempeñan un papel clave en los ecosistemas de agua dulce. Cambiando su estructura de la comunidad, biofilms responder rápidamente a cambios ambientales y puede ser utilizados así como indicadores de calidad del agua. En la actualidad, evaluación de biofilm sobre todo se basa en extremos funcionales e integrativa como actividad respiratoria o fotosintética, que no proporcionan información sobre la estructura de la comunidad de biofilm. Citometría de flujo y visualización computacional ofrecen un método alternativo, sensible y fácil de usar para la evaluación de la composición de la comunidad, particularmente de la parte Chlorobiaceae de biofilms de agua dulce. Requiere sólo la preparación de muestras básicas, después de lo cual toda la muestra se desarrolla a través de la citometría de flujo. La información sola célula óptica y fluorescente se utiliza para la visualización computacional e interpretación biológica. Sus principales ventajas sobre otros métodos son la velocidad de análisis y de la naturaleza de alto contenido de información. Citometría de flujo proporciona información sobre diversas características celulares y biofilm en una sola medición: tamaño de partícula, densidad, contenido de pigmento, contenido abiótico en el biofilm y grueso información taxonómica. Sin embargo, no proporciona información sobre la composición de la biopelícula en el nivel de especies. Vemos gran potencial en el uso del método de monitoreo ambiental de los ecosistemas acuáticos y como una evaluación inicial de la biopelícula paso que informa más abajo detalladas investigaciones por métodos complementarios y más detallados.

Introducción

Los biofilms son dinámicos consorcios de microorganismos que desempeñan un papel clave en los ecosistemas de agua dulce, que van desde la producción primaria, el ciclo de nutrientes y la purificación del agua a influir en la distribución de los microorganismos y su biodiversidad en el ecosistema ¹. cuando biofilms están expuestos a condiciones ambientales cambiantes o a factores de estrés, tales como productos químicos, su estructura de la comunidad se traslada rápidamente hacia más tolerantes las especies^2,3. Su alta sensibilidad convierte biofilms en sistemas de atractivo modelo para el monitoreo ambiental⁴, sin embargo ninguno de los métodos actuales se adapta perfectamente a la realidad trazar la dinámica de una comunidad de biofilm de manera rápida y fácil.

El sistema utilizado de métodos para caracterizar los biofilms consiste en la medición de variables de evaluación funcionales y estructurales. A nivel de toda la comunidad, actividad fotosintética y respiratoria, así como la actividad de enzimas extracelulares proporciona información sobre el estado funcional de la biopelícula^{5,6,7,8 ,9}. Acumulación de biomasa se utiliza como un indicador de crecimiento general de la biopelícula. Cambios estructurales en la actualidad se miden ya sea mediante la identificación de las especies tradicionales con microscopía de luz o con técnicas basadas en nucleótidos (p. ej., desnaturalizando electroforesis del gel del gradiente (DGGE), espaciador intergénico ribosomal automatizado Análisis (ARISA), metagenómica)^10,11,12. Estos métodos proporcionan información pero lleva mucho tiempo realizar, o requiere de conocimientos específicos o están todavía en desarrollo. Por último, nuevos métodos para la evaluación de las sustancias poliméricas extracelulares (EPS)^13,14 y el biofilm arquitectura¹, al tiempo que sensibles, son de bajo rendimiento y no se han desarrollado hacia con fines de monitoreo.

Es evidente que para una completa caracterización de biopelículas de agua dulce, es necesario combinar varios métodos diferentes, que proporcionan la penetración en la función de biofilm, composición y arquitectura. Para monitoreo del medio ambiente, por el contrario, un método rápido y sensible que es capaz de detectar cambios en el biofilm y la interpretación biológica básica de los cambios a nivel funcional y estructural se requiere.

Hemos desarrollado un nuevo método para la caracterización de la comunidad microbiana del componente phototrophic de los biofilms fluviales (perifiton), que es lo suficientemente rápido como para fines de vigilancia y al mismo tiempo proporciona información suficiente en la comunidad del biofilm estructura para permitir la interpretación biológica¹⁵. Se basa solo de células por citometría de flujo (FC) de las muestras de la biopelícula y junto con la visualización computacional y proporciona información sobre las propiedades ópticas y fluorescentes de la biopelícula en el nivel unicelular.

El flujo de trabajo después del muestreo de biofilm consiste en preparación de la muestra en forma de sonicación, fijación y filtrado basado en el tamaño de las muestras, seguidas por la evaluación de la muestra mediante citometría de flujo. Los datos adquiridos proporcionan información sobre rasgos celulares varios en una sola medición: tamaño de partícula, densidad, contenido de pigmento, contenido abiótico (por ejemplo microplastics) en el biofilm. Este conjunto de datos es analizada mediante visualización computacional utilizando a visual vecino estocástico incrustación (viSNE)¹⁶, que permite la fácil y rápida interpretación de los datos. Aunque un par de semanas se requiere para configurar y optimizar el método, una vez configurado, tarda sólo unas pocas horas de que recoge las muestras de la biopelícula a interpretar los resultados.

Las principales ventajas del método presentado sobre otros son la velocidad de análisis y alto contenido de información. Por otra parte, las muestras pueden conservarse durante varias semanas después de la recolección sin pérdida de su óptica y propiedades de fluorescencia. Esto puede ser muy útil cuando la caracterización de un gran número de muestras es necesaria, como estudios de grandes muestras o programas de control biológico, pero también puede proporcionar una cantidad sustancial de información en pequeños estudios exploratorios.

El protocolo presentado se basa en análisis de citometría de flujo de biopelículas fototróficas (perifiton) recogido de diferentes lugares de un arroyo. Muchos pasos del Protocolo, por ejemplo, la selección de sitios adecuados para la supervisión, dependen de los objetivos de la investigación y por lo tanto no pueden prescribirse. Otros permiten menos libertad y exigen que el protocolo es seguido muy de cerca, esto se hace claro en el protocolo detallado a continuación.

El protocolo comienza con la selección de sitios para el monitoreo ambiental basada en el biofilm. El siguiente paso es configurar el citómetro de flujo (FC) para que sus medidas permiten la discriminación entre diferentes organismos phototrophic viven en biofilms en el ambiente monitoreado. Esto se realiza por la recogida de muestras de la biopelícula de los sitios, identificando las propiedades fluorescentes de diferentes especies presentes en el biofilm y setting-up el citómetro de flujo con láser y filtros que permiten la medición en el óptico longitudes de onda. Una vez que el FC ha sido puesta en marcha, los biofilms pueden ser obtenidos de los sitios periódicamente, las propiedades ópticas y fluorescentes de las solas partículas presentes en el biofilm medido por citometría de flujo y los datos analizados por agrupamiento visual. Para mejor interpretación de los resultados, es posible construir una base de datos de referencia FC de especies locales de biofilm-vida y sus fenotipos y utilizar la base de datos para identificar distintas taxonomías en los datos FC. Validación es posible a través de la clasificación basada en la fluorescencia de los clusters identificados de las células utilizando FACS y basado en la microscopía de la identificación taxonómica de las especies presentes. Un esquema del Protocolo se da en la figura 1.

Protocolo

1. ecosistema selección y muestreo de Biofilm

1. Elige un ecosistema acuático de interés y encontrar sitios de muestreo donde crecen los biofilms. Partes poco profundas de un arroyo con lento flujo de agua de medio y un cauce pedregoso para la fijación de biopelícula son apropiadas^17,18.
2. Opcional: Si el sitio no dispone de suficiente superficie para la fijación de biopelícula, o para disminuir la variabilidad de los biofilms en el sitio, colocar sustratos artificiales para la fijación de biopelícula (p. ej. portaobjetos de vidrio, cerámica) en el sitio, asegurándose se colocan en la misma dirección respecto a los flujos de agua y profundidad similar y de la intensidad de la luz¹⁹.
3. Para determinar las condiciones ambientales en el sitio de muestreo, uso de instrumentos portátiles para medir la intensidad de la luz, temperatura, conductividad, oxígeno y pH por encima de la biopelícula de la superficie debe ser muestreado de. En el transcurso de la toma de muestras, medidas repetidas (3 – 5) para calcular valores medios.
4. Opcional: Tomar muestras de agua para determinar pertinentes parámetros químicos del agua (carbono orgánico (DOC), disuelto K⁺⁺de Na, Ca^{2 +}, Mg^{2 +}, Cl^–, F-, SO₄^{2 -}, PO₄^{2 -} , NO₃², SiO₄^-4).
5. Utilizando guantes protectores, recoger piedras comparables (en tamaño, forma y tipo) de cada sitio (o sustratos artificiales). Las piedras deben estar expuestas al flujo similar y las condiciones de luz¹⁸.
6. Filtro agua corriente desde el sitio a través de filtros de 0,22 μm, para que esté listo para todas las muestras recogidas (p. ej., 15 mL por muestra).
7. Utilice un cepillo de dientes suave para eliminar el biofilm del sustrato en un matraz (cepillo hasta que se quite todo biofilm) con 15 mL de filtrado de la corriente de agua²⁰.
8. Fijar las muestras en 0.01% de glutaraldehido paraformaldehido y 0.1%²¹.

2. determinación de parámetros óptimos-de citometría de flujo (FC)

1. Submuestras de transferencia a un microscopio de luz (con un 40 X / 0.75 objetivo; si es necesario utilice un objetivo de aceite de 100 × 1.3) e identificar las especies presentes en las muestras,^22,23.
2. Sola especie orden identificado de colecciones de cultivos apropiados (por ejemplo, la Ficología Experimental y cultura colección de algas en la Universidad de Go! ttingen [EPSAG] o colección de cultivo de algas en la Universidad de Colonia [CCAC] si monitoreo se realiza en ecosistemas Europa central).
3. Crecer la sola especie continuamente en condiciones ambientales similares (por ejemplo, luz, temperatura, pH) para el medio ambiente que se tomaron muestras de la biopelícula. Mantenerse dentro de 1 ° C y 0.5 puntos del pH de las muestras ambientales se recomiendan.
4. Para separar/dispersar las células, 15 mL de muestras de especies individuales en tubos de centrífuga y poner los tubos en el centro de un baño de agua y sumerja, por lo que la superficie del líquido de la muestra está en el mismo nivel que la superficie de la bañera. Someter a ultrasonidos las muestras durante 1 min a 45 kHz^24,25.
5. Registrar los espectros de absorbancia y fluorescencia de la sola especie usando un lector de placas. Refiera por favor al lector de la placa de elección para las instrucciones. En este ejemplo, las placas de poliestirol transparente de fondo plano de 96 pozos fueron cargadas con volumen de muestra de 200 μl y la absorbancia se midió. (Configuración utilizada: modo de exploración (a) fluorescencia; paso de longitud de onda de emisión tamaño 10 nm, emisión exploración número 30, ancho de banda 20 nm, ganar 100, 25 destellos, 20 US modo de barrido de tiempo o (b) la absorbancia de integración; 25 destellos, ancho de banda 9 nm).
6. Configurar el citómetro de flujo con láser, dicroicos splitters y filtros que conjuntamente cubren todas las gamas de las fluorescentes en las que diferentes especies tienen propiedades específicas. Para flujos de Europa central, un 405 nanómetro, 488 nanómetro y 638 nm láser producen resultados útiles.
7. Ajustar el ajuste de la tensión de los photomultipliers (no aplicable a todos los citómetros de flujo) y la gama de las medida fluorescencias para incluir al menos el 99% de todos los eventos de las muestras.
8. Alternativamente, si se dispone de conocimientos sobre las especies presentes en los biofilms, comience con el paso 2.2. Si se conocen propiedades fluorescentes, comienzan con paso 2.6.

3. opcional: Preparación de una base de datos de referencia de citometría de flujo

Nota: FC no permite identificación taxonómica de las células presentes en el biofilm. Una base de datos de referencia de mediciones de FC de única especie conocida para estar presentes en los biofilms, cultivados en condiciones similares como los biofilms puede ayudar con la interpretación de los datos.

1. Referencia: única especie
   1. Utilizando los parámetros optimizados de FC en 2.5 – 7, medir las propiedades ópticas y fluorescentes de especies individuales (fijadas en paraformaldehido y glutaraldehído y filtrada a través de filtros de tamaño apropiado para el citómetro de flujo).
   2. Normalizar los datos de la misma especie en la misma forma que los datos de los biofilms (ver paso 6.1.2).
2. Referencia: las células dañadas y que se decae
   Uno de los más importantes indicadores de salud de biofilm es la fracción de células dañadas/muerte presentes en el biofilm. Para cuantificar estas células, se puede preparar una referencia de las células en descomposición.
   1. Tomar submuestras de 1 mL de biofilms diluidos y les centrifugar a temperatura ambiente a 8.000 x g durante 10 minutos en una centrífuga de mesa. Suspender el sedimento resultante en 1 mL de etanol de 90% y almacenar la suspensión durante la noche a 4 ° C. Repita al día siguiente.
   2. Con la configuración optimizada de FC, medir las propiedades ópticas y fluorescentes de las células dañadas y que se decae (fijo y filtrado).
3. Referencia: microplastics
   Nota: si está interesado en el seguimiento de partículas microplastic en los biofilms, comprobar si difieren bastante de las partículas bióticas en ópticas y propiedades de fluorescencia para la identificación.
   1. Suspender las partículas de microplastic según las instrucciones del productor microplastics y medir sus propiedades ópticas y fluorescentes (usando parámetros FC de 2,7).
   2. Añadir las partículas microplastic a la muestra de biofilm y dejar durante la noche a 4 ° C.
   3. Filtrar la suspensión y la medida con los mismos parámetros FC como arriba.

4. preparación y almacenamiento de la muestra

1. Una vez que se ha establecido la FC y la base de datos de referencia FC está listo, uno puede proceder con la evaluación de muestras de biofilm fresco, recolectadas según pasos 1.1-7. Para separar/dispersar el biofilm, transferir 15 mL de las muestras de los frascos (ver paso 1.7) en tubos de centrífuga.
2. Poner cada tubo en el centro de un baño de agua y sumérgete para que la superficie del líquido de la muestra está en el mismo nivel que la superficie de la bañera. Someter a ultrasonidos las muestras durante 1 min a 45 kHz.
3. Fijar las muestras en 0.01% paraformaldehido y 0.1% de glutaraldehído (stock en agua nanopure). Almacenar a 4 ° C hasta que esté listo para el análisis.
4. Importante: Utilizar la mitad de las muestras para el análisis de citometría de flujo y mantener la mitad de almacenamiento seguridad y validación opcional con clasificación celular activado por fluorescencia y microscopía de luz (véase capítulo 6).
   Nota: almacenado en el refrigerador, las muestras de biopelícula fija deben mantener sus propiedades ópticas y fluorescentes durante tres semanas.

5. ejecución de la muestra a través de la FC

1. Si las muestras fueron almacenadas en la nevera, someter rápidamente a los ultrasonidos o pipeta varias veces para separar las partículas. Filtro de las submuestras con 50 filtros de μm (tamaño del filtro depende de la anchura del tubo capilar FC) antes de medir.
2. Las muestras individuales de carga (1-2 mL, esto depende del citómetro de flujo utilizado) en el citómetro de flujo y medir las propiedades ópticas y fluorescentes de cada partícula. Repita la medición tres veces por cada repetición biológica (tres repeticiones técnicas).
3. Exportar los datos de la FC en formato CSV.

6. datos preparación y análisis de correlación

FC puede analizar varios parámetros (por ejemplo, área, altura, anchura) para cada propiedad óptica medida y rango de fluorescencia. Realizar un análisis de correlación de las variables medidas y mantener sólo aquellas medidas que no están altamente correlacionadas. Esto generalmente elimina todos menos uno de los parámetros FC (p. ej., área de la señal) y puede también quitar altamente correlacionado fluorescentes medidas (generalmente provienen del mismo laser y vecinos filtros).

1. Ejecutar CYT como un toolbox de Matlab:
   1. Importar los datos FC reducción en formato .csv de todas las muestras que deben ser analizadas en la CYT software¹⁶, como todo técnico y biológico Replica. (Haga clic en +, *.csv filtro de archivo, seleccionados archivos de importación).
   2. Transformar los canales fluorescentes de todas las muestras usando la transformación arcoseno hiperbólico. El valor del cofactor debe ser seleccionado; 150 obras para más biopelículas fototróficas y citómetros de flujo y optimización pueden ser necesarias para configuraciones experimentales particulares y biofilms heterótrofos. (Cofactor de derecha-clic/transformación/Enter 150)
   3. Control de calidad, se comparan visualmente (en CYT) los histogramas de la muestras individuales y canales ópticos y fluorescentes individuales para asegurarse de que hay no hay afloramientos en el nivel técnico y biológico de la replicación. Afloramientos se manifestarán en distribuciones fluorescente óptico significativamente cambiado de puesto entre las repeticiones. (Seleccionar datos, seleccionar canales, parcela)
      1. Alternativa: ejecutar un análisis de componentes principales (PCA) en los valores medianos de distribuciones fluorescentes y asegúrese de que agrupan repeticiones técnicas y biológicas.
   4. Combinar la técnica replica en cada repetición biológica y submuestra por que replica el biológico, para que cada uno está representado por el mismo número de partículas (células, fragmento de la célula y abióticas partículas) y por lo que el número total de las partículas analizadas Barnes-choza vecino estocástico incrustación (bh-SNE) es alrededor de 150.000 (para mejor visualización de resultados²⁶). (Seleccione datos, clic derecho, fusión/submuestra)
   5. Para la comparación entre las muestras, es importante seleccionar sólo aquellas muestras que deben ser comparados. Seleccionar las muestras y realizar bh-SNE²⁷. Una vez que el algoritmo está acabados, nuevos canales, llamado bh-SNE1 y bh-SNE2 aparecen. Estas son las coordenadas de la SNE de todas las partículas analizadas, que pueden utilizarse para visualizar los datos en un diagrama de dispersión (viSNE mapa). (Seleccionar datos, seleccionar canales, haga, bh-SNE sí, normalizados datos)
   6. En el mapa de viSNE, las partículas son colocadas según la similitud y agrupadas en racimos separables visualmente. Revise las propiedades de la óptica fluorescente de los racimos y marca y nombre de los que están bien separadas y tienen propiedades ópticas/fluorescencia diferentes mediante el uso de las herramientas de dibujo disponibles en CYT. (Seleccionar canal bh-SNE1, bh-SNE2)
   7. Opcional: Si se dispone de una base de datos de referencia de especies microbianas individuales (medido con la misma configuración de citometría de flujo y crecido en condiciones similares), exportar los mapas de viSNE en Matlab y proyectar la base de datos de referencia en los mapas. De esta manera, grupos particulares pueden conectarse a grupos de especies particulares, taxonómica (scripts disponibles para descargar en https://github.com/anzezupanic/FC_analysis). (Sesión/Save)
   8. Solución de problemas: Si el análisis bh-SNE no devuelve grupos separables visualmente, pero una sola grande, muchas partículas se utilizaron en la bh-SNE. Pruebe con menos partículas por muestra. Si no hay racimos, pero más bien escasos puntos individuales, incrementar el número de partículas.
2. Opcional: En lugar de depender de bh-SNE para el agrupamiento, otros métodos de clustering (p. ej., jerárquica, basada en el centroide o densidad basado en clustering) pueden utilizar los datos normalizados y luego superpuestos en el mapa de viSNE (https://github.com/ anzezupanic/FC_analysis).
3. Una vez que se han identificado los grupos, cuente el número de partículas en cada grupo perteneciente a cada repetición biológica en cada muestra. Evaluar las diferencias entre las muestras, con test ANOVA y del Tukey apropiada (por ejemplo, Holmes) corrección para comparación múltiple.

7. opcional: Validación de la interpretación de Cluster usando clasificación celular activado por fluorescencia

1. Una vez se han identificado los grupos, usar celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación para ordenarlas de las muestras si lo desea, siempre que la FACS tiene una configuración similar (o idéntica) de filtros fluorescentes y rayos láser.
2. Para cada grupo identificado, CYT ofrece puertas ópticas y fluorescentes que definen el grupo. Utilizar estas puertas para clasificar hacia fuera las partículas en cada cluster con el FACS y luego identificar las células clasificadas usando microscopia ligera.

Resultados

Utilizando el procedimiento presentado aquí (figura 1), se analizaron muestras tomadas de varios sitios de un arroyo local en Suiza. En cada sitio, se tomaron tres piedras de tamaño similares (10 – 12 cm) y biofilms se restó de las piedras. Las muestras fueron entonces sonicada, fijaban, filtraron y posteriormente analizan por citometría de flujo. La configuración de la citometría de flujo y la base de datos de referencia utilizados fueron los mismos ...

Discusión

El protocolo descrito anteriormente es relativamente sencillo de implementar. Sin embargo, mientras que las programaciones presentadas han demostrado ser aptos para todo fototrófica biofilm probado hasta el momento, optimización (como se describe en el protocolo) es necesario para maximizar la información obtenida por el método. De hecho, las propiedades ópticas y fluorescentes de biofilms pueden variar, dependiendo de las condiciones ambientales (época, temperatura, composición química del agua)

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multimeter	WTW	MultiLine 3620 IDS	For measuring temperature, pH, dissolved oxygen
Ultrasonic cleaner	VWR International	97043-986	Tank dimesions: 15*14*10 cm
Flow cytometer	Beckman Coulter	Gallios	Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016.
Plate reader	Tecan	Infinite M200	used for selecting appropriate setting of the FC
Cell sorter	Beckman Coulter	MoFlo Astrios	Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016.
Fluorescence microscope	Zeiss	Axiovert 135	Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective
SOFTWARE
Matlab	MathWorks	R2013a	software for numerical computing
CYT	Dana Pe'er Lab	Version 1.1	free interactive visualization tool for analysis of cytometry data