Guiada por la base de datos-citometría de flujo para la evaluación de la maduración de células mieloides de la médula

Resumen

La diagnosis MDS es difícil en ausencia de criterios morfológicos o citogenética no informativo. MFC podría ayudar a perfeccionar el proceso de diagnóstico de MDS. Para ser de utilidad para la práctica clínica, el análisis MFC debe basarse en parámetros con suficiente especificidad y sensibilidad, y resultados deben ser reproducibles entre diferentes operadores.

Resumen

Un grupo de trabajo iniciado dentro de la asociación francesa de citometría (AFC) fue desarrollado con el fin de armonizar la aplicación de la citometría de flujo multiparamétrico (MFC) para el diagnóstico de enfermedad mieloide en Francia. El protocolo presentado aquí fue acordada y aplicada entre septiembre de 2013 y noviembre de 2015 en seis laboratorios de diagnóstico francés (hospitales universitarios de Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Niza y Lille e Instituto Paoli-Calmettes en Marsella) y permite la estandarización de la médula ósea muestra preparación y adquisición de datos. Tres bases de datos de maduración fueron desarrollados para neutrófilos, monocítica y linajes eritroides con la médula ósea de individuos "sanos" donantes (personas sin ninguna evidencia de una enfermedad hematopoyética). Un método robusto de análisis para cada linaje mieloide debe ser aplicable para el uso rutinario de diagnóstico. Nuevos casos pueden ser analizados de la misma manera y con respecto a las bases de datos generalmente. Por lo tanto, cuantitativas y cualitativas las anormalidades fenotípicas pueden ser identificadas y aquellos por encima de 2SD en comparación con los datos de las muestras de médula ósea normal puede considerarse indicativas de patología. La principal limitación es la mayor variabilidad entre los datos que se consigue utilizando los anticuerpos monoclonales obtenidos con los métodos basados en hibridomas tecnologías y actualmente se utiliza en diagnóstico clínico. Establecimiento de criterios para la validación técnica de los datos adquiridos puede ayudar a mejorar la utilidad de MFC para el diagnóstico MDS. El establecimiento de estos criterios requiere un análisis contra una base de datos. La reducción de la subjetividad del investigador en análisis de datos es una ventaja importante de este método.

Introducción

En la ausencia de marcadores fenotípicos específicos a los que ocurren en las células mieloides durante la MDS iniciación y progresión de los cambios displásticos, ha propuesto un nuevo enfoque en los últimos años basadas en la evaluación de las vías de maduración (expresión alterada de antígenos mieloides durante la producción de células mieloides maduras) o de la distribución anormal de los diferentes tipos de células en la médula (BM) la célula compartimientos^1,2.

Este artículo presenta un nuevo método para el uso estandarizado de MFC para detectar cambios displásticos en BM compartimentos de células mieloides relacionadas con síndromes mielodisplásicos (MDS) u otras enfermedades hematológicas mieloides. Este estudio también demuestra la utilidad del uso de bases de datos de maduración para el análisis de datos MFC.

Estandarización del procedimiento de preparación de muestras, adquisición de datos y análisis con las bases de datos permitiría la identificación de las anormalidades fenotípicas más relevantes relacionados con los cambios displásicos en células mieloides BM. Por lo tanto, son necesarios para el desarrollo de una estrategia de análisis que se puede utilizar en análisis posteriores subconjuntos estadísticamente seleccionados basados en formatos bien marcados y reconocidos (separador de población automático (APS) diagramas, histogramas y diagramas de punto) rondas. El descubrimiento de anormalidades fenotípicas robustos en MDS facilitaría el diagnóstico en casos con o sin displasia morfológica mínima y sin aberrancies citogenéticas. Identificación de parámetros discriminatorios lo que permite la reducción de paneles de immunophenotypic puede simplificar el actual puntuaciones², permitiendo su aplicación en laboratorios de patología clínica.

Este método limita las interpretaciones subjetivas de datos de citometría, como se ha senalado en MDS diagnóstico³. Este paso es un requisito previo para el desarrollo de herramientas automáticas para el procesamiento y análisis de flujo de datos⁴.

MDS comprende un grupo heterogéneo de trastornos clonales de células madre hematopoyéticas (HSC) en el que las mutaciones del espliceosoma cooperan con modificadores epigenéticos específicos para producir el fenotipo MDS. Ahora se sabe que, junto con las mutaciones de la HSC, otros mecanismos están implicados en la fisiopatología MDS, como inflamación mediada inmune aberrante e interacciones entre HSCs malignas y el microambiente estromal del BM. Sin embargo, estos mecanismos siguen siendo mal entendidos. La heterogeneidad amplia clínica y biológica de los MDS hace el diagnóstico y la selección de la terapia óptima un desafío. En la última década, varios estudios han demostrado que MFC es a menudo más sensible en la detección de displasia² de morfología, pero las limitaciones técnicas y económicas dificultan esta técnica estandarizar, con resultados a menudo depende de la experiencia del intérprete³. Además, no está claro cómo MFC puede inclinar la balanza hacia MDS en casos con o sin displasia morfológica mínima y en ausencia de anomalías citogenéticas o en casos extremos como hypocellular MDS, con una cuenta baja blast, de otros no clonal BM trastornos como la insuficiencia de la médula ósea (ej., anemia aplásica). También sigue siendo difícil de distinguir casos dudosos de MDS con un exceso de blastos de la leucemia mieloide aguda (AML). Por todas estas razones, las directrices clínicas integran no MFC de prueba en el diagnóstico final de MDS. En 2011, red nacional de cáncer integral de Estados Unidos (NCCN) recomendó MFC para la estimación del porcentaje de células CD34 +, detección de clones de la hemoglobinuria paroxística nocturna y la presencia de clones de células T citotóxicas en hypocellular MDS⁵. Estas dos últimas situaciones implican también un objetivo terapéutico porque los datos clínicos han demostrado una buena respuesta de estos pacientes a la terapia inmunosupresiva⁶. Las guías NCCN de 2017, citando las recomendaciones del grupo de trabajo internacional (GTI), la lista aberrante immunophenotyping detección MFC entre los co criterios para el diagnóstico de la MDS, pero sin realizar ninguna Especificaciones⁶. Además, la recientemente publicada clasificación de la OMS estipula que resultados MFC solamente no son suficientes para establecer un diagnóstico primario de MDS en ausencia de datos concluyentes de la morfológica y citogenética⁷. Sin embargo, MFC puede utilizarse como una prueba adicional que el dysregulation de células mieloides patrones de maduración y cuantificar la "distancia de normal" para un paciente en un momento específico en el curso de la enfermedad.

Este método es aplicable a los laboratorios clínicos interesados en la evaluación de la displasia de las células mieloides BM usando MFC immunophenotyping, para afinar el diagnóstico en MDS u otros desordenes mieloides con anormalidades displásticas.

Protocolo

El protocolo a continuación ha sido aprobado por el "Comité de protección des Personnes" (Comité de ética independiente) 1 Sud-Est de la Universidad Hospital de Saint-Etienne, Francia.

1. citometría ajustes

Nota: La configuración de citómetro se realizaron según recomendaciones de flujo de Francia, según procedimiento EuroFlow "EuroFlow operativo protocolo de estándar (SOP) para la configuración del instrumento y compensación (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php).

1. Configuración instrumento mensual
   1. Gire en el citómetro. Asegurar que todos los niveles de fluido adecuado y abierto Diva 6.1.3. Realizar inicio de fluidos: en la barra de menús, seleccione ' citómetro | Inicio de fluidos '. Haga clic en 'OK' cuando se le solicite. Permiten el citómetro calentar durante al menos 30 minutos.
   2. Verificación de rendimiento - cuentas de CST
      Nota: Para este paso, preparar 12 tubo poliestireno de 75 mm, perlas de CST y vaina líquido (véase Tabla de materiales).
      1. Etiquetar un tubo poliestireno 12 x 75 mm² 'CST'. Mezclar la ampolleta de grano suministrado por inversión suave o muy suave Vortex. Añadir al tubo etiquetado: 0,35 mL de líquido de la envoltura y 1 gota de granos de la CST. Vórtice el tubo suavemente y proceder a la adquisición. Guarde el tubo para un máximo de 8 h a 2-25 ° C en la oscuridad si no adquirir inmediatamente.
      2. Realizar la verificación de rendimiento: en la barra de menús, seleccione ' citómetro | CST'.
      3. En la pestaña 'Configuración' del módulo CST: confirmar el Canto II como en la configuración por defecto de 4-2 H-2V y también confirmar que existe una base creada con el lote actual de granos de la CST para esta configuración. Si no existe una línea de base, consulte la instrucciones de uso de cuentas de CST. Confirmar que la instantánea no ha caducado: bajo ' Control Setup', seleccione ' ver resultados ' en el menú desplegable.
      4. Verifique 'Cargar manualmente el tubo' y haga clic en 'Ejecutar'. Confirme que aparece el número de lote. Suavemente vórtice los granos diluidos prepararon por encima y cuando se le solicite, cargue los granos diluidos y haga clic en 'Aceptar'.
      5. Cuando finalice la comprobación de funcionamiento, verificar que citómetro rendimiento pasado. Haga clic en 'Ver informe'. Vuelva a ejecutar la comprobación de funcionamiento si los resultados no pasaron. Guardar el informe en formato PDF con la fecha de informe de seguimiento de rendimiento.
   3. Ajustar 'Voltajes fluorescentes PMT' con perlas de arco iris (Tabla de materiales).
      Nota: Los valores objetivo se establecen en Euroflow procedimiento operativo estándar (SOP) titulado "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads". Esta compensación está disponible en sitio de Euroflow (www.euroflow.org; en el área pública; Ficha de protocolos).
      1. Crear un nuevo experimento a través de ' fecha de configuración instrumento mensual | Muestra '.
      2. ', elija los parámetros ópticos y fluorocromos correspondiente a los tubos afectados (FITC, PE, PerCPCy5.5, PE-Cy7, APC, APC-H7, V450, V500) y comprobar los parámetros de adquisición deseada (registro de, A, H y / o W). Aplicar configuración actual CST (haga clic derecho sobre ' configuración de citómetro ' del experimento). Establecer el umbral para el parámetro FSC en 10.000.
      3. En el citómetro, apague la compensación mientras se ajusta la fluorescencia voltajes PMT para el ajuste de blanco MFI; para ello, ir en el 'Inspector', vaya a la ficha de 'Compensación' desactivar compensación por opción de ' permitir compensación ' desactivando.
      4. Crear una hoja de cálculo ' blanco MFI' con todas las parcelas necesarias dot (n = 2; FSC y SSC, FITC y PE), histogramas (n = 8; un histograma para cada detector de fluorescencia) y estadísticas que indiquen la referencia valores máximos (MFI y CV) para cada canal de fluorescencia.
      5. Diluya 1 gota de partículas de calibración de cuentas 8-pico arco iris en 1 mL de agua destilada y agitar antes de usar. Adquirir sin la solución de cuentas 8-pico arco iris caudal 'Bajo' de grabación. Guarde el tubo para un máximo de 8 h a 2-25 ° c en la oscuridad si no adquirir inmediatamente.
      6. Camiseta de puerta de perlas ' población P1' en el FSC versus trama de punto bivariada la SSC y el pico 8 o 7 en el FITC versus trama de punto bivariada la PE (el pico más brillante o el siguiente hacia abajo, como se estipula en el documento de Euroflow titulado "20180302_7th_ Peak_Target_Values_Rainbow_Beads") y el nombre de esta puerta P2 de la población.
      7. Continuar con la adquisición de la suspensión de grano de arco iris de 8 picos y ajustar tensiones PMT en todos los canales de fluorescencia para alcanzar valores de MFI de destino según el documento de Euroflow "20180302_7th_Peak_Target_Values_Rainbow_Beads".
      8. Una vez que se alcanzan valores de destino MFI para el pico de 8 o 7, registrar la IMF objetivo logrado y los correspondientes valores PMT finales. Adquirir 5.000 eventos y registro de datos.
         Nota: Que valores de PMT debe utilizarse debajo de paso 1.2.3 (rendimiento Compruebe - confirmación de valores de PMT con perlas de arco iris).
      9. Registrar estos valores haciendo una impresión de la pantalla con ajustes de ' destino MFI' e instrumento de hoja de cálculo y guardar como imagen jpg.
         Nota: Cuando se crea un tubo de "Nuevo", a veces los valores PMT varían inesperadamente. Para ello, una doble comprobación de PMT es esencial. ¡Comparar cada vez los valores PMT a sus notas, compruebe que ' destino MFI' valores y PMT son correctos!
      10. Guardar la 'configuración de la aplicación del '. En el explorador, haga clic en ' configuración de citómetro '. En el menú desplegable, seleccione ' configuración de la aplicación 'y guardar. Haga clic en 'Aceptar'. Si se le pida, haga clic en sí para mantener los valores de umbral.
          Nota: Guarde la configuración de la aplicación utilizando el nombre por defecto. NO cambiar el nombre de la configuración.
   4. Ajustar el 'FCS' y 'Tensiones SSC' con sangre lavada sometidas a lisis (LWB).
      Nota: Para este paso, se necesitan 50 μl de una muestra de sangre periférica (PB) de una solución voluntaria, lisis saludable (Tabla de materiales) y tampón de lavado.
      1. Mide con una pipeta 50 μl de PB en un tubo. Añadir 2 mL de solución de lisis recién diluida. Mezclar suavemente e incubar 10 min a TA.
      2. Centrifugar 5 min a 540 x g.
      3. Aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular, dejar aproximadamente 50 μl volumen residual en el tubo. Mezclar suavemente y añadir 2 mL de solución de lavado filtrada.
      4. Centrifugar 5 min a 540 x g.
      5. Repetir una vez más el 1.1.4.3–1.1.4.4 pasos.
      6. Añadir 250 μl de tampón de lavado filtrada y mezclar suavemente.
      7. En el experimento destinado a adquisición de perlas de arco iris, crear una nueva ' muestra | Nueva hoja de cálculo ': dibujar un gráfico bi-paramétrica A SSC / FSC-A.
      8. Adquirir las células, los linfocitos en un FSC versus trama de punto bivariada la SSC de la puerta y ajustar voltajes FSC y SSC para alcanzar los siguientes valores de target media para la población de linfocitos cerrada: FSC: 55.000 (rango de 50.000 – 60.000) y SSC: 13.000 (gama 11.000 –15,000).
      9. Adquirir y registrar los datos con unos 10.000 eventos. Verifique que los valores medios de objetivo FSC y SSC para linfocitos cerrados. Reajuste la tensión de FSC y SSC si es necesario.
      10. Imprimir pantalla y guardar la impresión de los valores de canal de destino que se obtienen.
   5. Ajustes de compensación de fluorescencia.
      Nota: Los controles de compensación solo manchado deben establecerse después de la configuración de MFI de destino y se han establecido parámetros FSC/SSC. Para este paso, un PB de un voluntario sano, partículas de compensación (Tabla de materiales), solución de lisis y lavado tampón son necesarios. La lista de reactivos de anticuerpos conjugados con fluorocromo utilizado para instalar las matrices de remuneración de fluorescencia y sus poblaciones de referencia se enumeran en la tabla 1.
      1. Etiquetar un tubo por reactivo para ser utilizado en configuración de compensación de la fluorescencia (FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, V450, V500, PECy7 - CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 y APC-H7 - CD71) y un tubo "blanco/sin mancha".
      2. Extraiga con pipeta 50 μl de PB en cada tubo o 1 gota de "negativo" de las partículas de compensación + 1 gota de "positivo" compensación de partículas en los tubos de control de la compensación indicadas en la tabla 1.
      3. Añada la cantidad apropiada del reactivo de anticuerpo al tubo. Añadir el tampón de lavado filtrada para alcanzar un volumen final de 100 μl por tubo y mezcle suavemente. Incubar por 15 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
      4. Añadir 2 mL de solución de lisis recién diluida en los tubos con las células y mezclar suavemente. Incubar por 10 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
      5. Centrifugar 5 min a 540 x g.
      6. Aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular dejando aproximadamente volumen residual de 50 μL en cada tubo. Mezclar suavemente. Añadir 2 mL de tampón de lavado filtrada.
      7. Centrifugar 5 min a 540 x g.
      8. Aspirar el sobrenadante sin perturbar el pellet celular dejando aproximadamente volumen residual de 50 μL en cada tubo. Añadir el tampón de lavado filtrada para alcanzar un volumen final de 250 μl por tubo y mezcle suavemente.
      9. Crear controles de compensación.
         1. En la barra de menús, seleccione experimento creado para la adquisición de granos del arco iris. Crear una nueva ' muestra | Configuración de compensación | Crear los controles de compensación.
         2. En el cuadro de diálogo resultante, seleccione la opción ' control sin manchas separadas incluyen tubo/bien ' . Crear controles de compensación (no específica de etiqueta) genérico para FITC, PE, PerCPCy5.5, APC, HV450, HV500. Crear controles de etiqueta específica compensación para PE-Cy7-CD117, APC-H7 - CD10, APC-H7 - CD14 y APC-H7 - CD71. Haga clic en 'Aceptar'.
         3. En una nueva hoja de cálculo, crear un gráfico A SSC / FSC-A bi-paramétricas y dibujar una puerta en linfocitos (P1) y el histograma correspondiente al fluorocromo que se detectan en cada tubo y dibuja una puerta P2 para el pico positivo. Mostrar la jerarquía (clic derecho en un gráfico y seleccione ' Mostrar jerarquía de población ') para visualizar el número de eventos en P2, excepto el tubo de Control sin manchas.
         4. En el navegador, ampliar a la muestra de controles de compensación.
         5. Vórtice las células sin manchas, preparado anteriormente, para instalar s. 3 – 5 las células sin manchas preparadas en el citómetro. Ajustar el flujo a 'medio ' y haga clic en ' obtener datos '. En la parcela de FSC-A vs SSC-A punto, ajuste la puerta P1 para abarcar completamente la población de linfocitos. Haga clic en la puerta de P1. Seleccione 'Aplicar a todo el control de compensación'.
         6. En el panel de 'Adquisición' , haga clic en 'datos de registro ' para adquirir 5.000 eventos. Para todas las celdas de control teñida del solo-color, compruebe que la puerta P2 del intervalo abarca a la población positiva.
         7. Para el PE-Cy7 y tubos de APCH7, añadir una puerta de intervalo de P3 al histograma y asegúrese de que comprende a la población negativa, y que la P2 abarca a la población positiva.
         8. Calcular indemnización. En la barra de menús, seleccione ' experimento | Configuración de compensación | Calcular indemnización '. Nombre de la matriz de compensación: «Fecha de compensaciones». Seleccione 'Link y guardar'.
         9. Guardar la matriz de compensación en la configuración de la aplicación Catálogo: haga clic en 'citómetro de configuración | Configuración de la aplicación | Guardar ', nombre de la matriz de compensación 'Fecha de compensación' y haga clic en 'Aceptar'.
         10. En el explorador, haga clic en ' configuración de citómetro '. En el Inspector, desplácese a la ficha de 'Compensación' , haga clic en imprimir en la esquina inferior derecha.
             Nota: Esta información también puede ser obtenida del catálogo.
         11. Control de la matriz de compensación.
             1. Mezclar en un tubo del solo tubo manchado (APCH7 de elección).
             2. Crear un nuevo experimento llamado 'Fecha de verificación de compensación', agregar nueva muestra, haga clic derecho en la ' configuración de citómetro ' de este experimento y elija ' enlace | Desenlazar | Configuración de aplicación ' guardó en el paso 1.1.3.10. Adquirir 50.000 eventos de este tubo con la nueva configuración.
             3. Aplicar una nueva hoja de cálculo Global. Crear trama de puntos 1 FSC-SSC-A/A y dibuja una puerta para visualizar los linfocitos y n x (n-1) / 2 otras parcelas se centró en la puerta de los linfocitos para visualizar parámetros de dos en dos.
2. Configuración instrumento diario
   1. Gire en el citómetro. Asegurar que todos los niveles de fluido adecuado y abierto Diva 6.1.3. Realizar inicio de fluidos: en la barra de menús, seleccione ' citómetro | Inicio de fluidos '. Haga clic en 'OK' cuando se le solicite. Permiten el citómetro calentar durante al menos 30 minutos.
   2. Verificación de rendimiento - cuentas de CST: Repita los pasos 1.1.2.1–1.1.2.5.
   3. Control de rendimiento - confirmación de los valores PMT con perlas de arco iris.
      1. Etiquetar un tubo de poliestireno como ' perlas de arco iris ' y compruebe que el número de lote es el que está en uso. Mezclar bien el frasco de arco iris del grano. Preparar las perlas de arco iris, añadir 1 gota de perlas de arco iris 1 mL de agua destilada o desionizada. Proteger de la luz.
         Nota: Proceder a la adquisición o almacenar el tubo a 2-8 ° c hasta la adquisición.
      2. Crear un nuevo experimento: ' fecha de perlas arco iris '.
      3. Vincular las compensaciones: haga clic en ' configuración de citómetro ', seleccione ' configuración de enlace ', seleccione la matriz de compensación adecuada creada en el paso 1.1.5.9.9 y seleccione "Sobrescribir".
      4. Desvinculación de compensación: haga clic en ' configuración de citómetro ', seleccione 'Desvincular desde la configuración previamente vinculada' y pulse 'Aceptar'.
      5. Aplicar ' Configuración de la aplicación: haga clic en ' configuración de citómetro ', seleccione ' Configuración de la aplicación, aplicar la configuración que creó en el paso 1.1.3.10 durante la instalación mensual y 'mantener el valor de compensación '.
      6. Deseleccione la opción 'Activar compensación'.
      7. Crear a una nueva muestra en el experimento con la plantilla de hoja de cálculo para perlas de arco iris. Adquirir el tubo en la adquisición de 'Baja' .
      8. Durante la adquisición de granos, ajuste la puerta P1 para incluir sólo la población de tira de camiseta. Ajustar la puerta P2 en la trama de la FITC-A / PE-A punto para incluir sólo la población de tira de camiseta. Registrar eventos de 10.000.
      9. Compruebe que la IMF y los valores de CV obtenidos para la población de P2 en los objetivos previamente definidos del protocolo. Lo contrario, lave el citómetro y empezar la operación. Guarde el informe como formato PDF.

2. preparación de la muestra BM

Nota: Realice la célula lavado protocolo justo antes del procedimiento de tinción.

1. Pipetear 600 μl de la muestra principal en un tubo de centrífuga de 15 mL.
2. Añadir 10 mL de tampón de lavado (PBS + 0,5% BSA [> 98% puro BSA] + 0,09% NaN₃ filtrado de solución, pH 7.4). Mezclar la suspensión de células con una pipeta.
3. Centrifugar 5 min a 540 x g (lavado 1). Deseche el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares.
4. Repita los pasos 2.2 – 2.3 (programa 2).
5. Suspender el sedimento celular en 400 μL de tampón de lavado.
6. La coloración de los marcadores de columna vertebral. Transferir todo el volumen de los anticuerpos de la espina dorsal a un tubo de polipropileno para el análisis FACS, identificado con los datos del paciente y la "columna vertebral". Añadir 350 μl de la muestra lavada (el volumen de la muestra lavada que llenan todos los tubos del panel). Mezclar con una pipeta.
   Nota: Calcular el volumen total de anticuerpos de la columna vertebral para la membrana superficial de tinción (como se muestra en la tabla 2).
7. Pipetear cantidades iguales de la mezcla de muestra-columna vertebral en 3 tubos de polipropileno para el análisis FACS, identificado con los datos del paciente y "número 1 del tubo" a "número de tubo de 3". Si es necesario, uso de tampón de lavado para llegar a un volumen final de 200 μL por tubo.
   PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no dejar ningún rastro de la muestra en las paredes de los tubos; de lo contrario, estas células no se mancharon. Si es necesario, vórtice de las células y el tubo de la centrifugadora.
8. En cada tubo, agregue el volumen adecuado de anticuerpos dirigidos contra marcadores de superficie celular (a excepción de los marcadores de columna vertebral), como especificado en la tabla 2. Mezclar con una pipeta. Incubar durante 30 min a TA protegido de la luz.
9. Añadir 2 mL de solución de lisis. Mezclar con una pipeta. Incubar por 10 min a TA protegido de la luz.
10. Centrifugar 5 min a 540 x g. Deseche el sobrenadante sin perturbar el pellet celular, dejando aproximadamente volumen residual de 50 μL en cada tubo. Mezclar con una pipeta.
11. Añadir 2 mL de buffer para el precipitado de células que se lavan. Mezclar con una pipeta.
12. Repita los pasos 2.10-2.11 (programa 2).
13. Centrifugar 5 min a 540 x g. Deseche el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares y Resuspenda el precipitado de células en 200 μL de PBS. Mezclar con una pipeta.
14. Adquirir preferentemente las células, inmediatamente después de la tinción o almacenar a 4 ° C, protegido de la luz, para no más de 1 h hasta medido en el citómetro de flujo.

3. adquisición de datos

1. Abra un nuevo experimento en software Diva y cámbiele el nombre según el nombre, tipo de muestra y fecha.
2. Crear a una nueva muestra que contienen 3 tubos. Especificar en el diseño de experimento los anticuerpos utilizados en cada tubo.
3. Haga clic derecho en la ' configuración de citómetro ', seleccione ' configuración de la aplicación ' y aplicar los valores obtenidos en configuración mensual (paso 1.1.3.10).
4. Abra una nueva hoja de cálculo Global y crear los diagramas de punto: A SSC / FSC-A, SSC-A / CD45-HV500-A, SSC-A / FITC-A, SSC-A / PE-A, SSC-A / CD34-PerCP-Cy5.5, SSC-A / CD117-PECy7-A, SSC-A / APC-A, SSC-A / APCH7-A, SSC-A / HLA-DR-HV450-A. En la trama de punto SSC-FSC-A/A, crear una puerta para seleccionar las células de la camiseta. En la trama de punto SSC-CD45-BV500-A/a, crear puertas para seleccionar 4 poblaciones: granulocitos, monocitos, blastos y linfocitos. Proyecto de estas poblaciones en las parcelas de punto creadas anteriormente.
5. Crear una nueva hoja de cálculo Global para el control de compensación como se describe en el paso 1.1.5.9.11.3.
6. Adquirir el tubo en 'Medio' adquisición y registro 500.000 eventos/tubo. Después de validación técnica (evaluación de la compensación y la tinción adecuada), exportar los datos como archivos FCS3.0.

4. Análisis de datos

Nota: Para construir las bases de datos de BM normales fueron archivos de donantes sanos y de individuos sin ninguna evidencia de una enfermedad hematopoyética 11 de los 18 archivos para el Neutrophils_NM base de datos, 10 de los 18 archivos de base de datos de Monocytes_NM y 14 de 18 archivos de base de datos de NRC_NM. Los archivos descartan presentaron diversos problemas técnicos, tal como se presenta en la sección de resultados de representante. Los archivos individualmente se analizaron utilizando el software de Infinicyt (Tabla de materiales), conforme a las diversas estrategias que se muestra en la figura 1A(1-3) para linaje neutrófilo (perfil Neutrophils_Maturation.inp), figura 2 A por linaje monocito (perfil Monocytes_Maturation.inp) y figura 3A(1-2) de linaje de células eritroides (perfil NRC_Maturation.inp).

1. Estrategia de análisis para los neutrófilos -Construcción de base de datos de Neutrophils_NM 
   1. Identificar CD34 + ráfagas de neutrófilo cometido mediante un cruce de siete puertas, permitiendo la selección de CD34 + CD117 + HLADR + baja CD10 - CD13 + CD11b-eventos (1 de figuraA.1). Asignar estos eventos a la pestaña 'Neutrófilo' en el árbol de jerarquía de población y después desmarque esta pestaña para quitar estas células (mostradas en azul) de la pantalla de los eventos restantes (gris).
   2. Aislar el CD117 + CD34 - CD13 + CD11b-HLADR + precursores de neutrófilos baja mediante una intersección de seis puertas como se muestra en la figura 1A(2) y asignarlos a la pestaña 'Neutrófilo' .
   3. Identificar los neutrófilos más maduros con una intersección de cuatro puertas, lo que permite la discriminación de CD45dim SSCint-Hola CD117-HLADR-las células y su asignación a la pestaña 'Neutrófilo' .
   4. Desmarque los eventos restantes, manteniendo sólo los neutrófilos visible, luego exportación esta población haciendo clic en ' archivo | Exportación de ' y verificar que todos los parámetros requeridos son verificados y guardar los datos como archivos de FCS.
   5. En un archivo combinado de todos los archivos exportados de FCS, realizar una verificación de calidad mediante la evaluación de la intensidad de la expresión de marcadores de cada subpoblación. Con APS parcelas con medias para cada archivo y las curvas de SD para cada subpoblación se muestra, quite los casos fuera de las curvas de 2SD (ver detalles en la sección de resultados de representante) (figura 1B).
   6. En el archivo resultante compuesto con "Neutrófilos" visibles, dibujar el camino de maduración en un diagrama APS (a la izquierdafigura 1C ) y guardar como un archivo de .cyt.
      Nota: Una comparación de esquema de maduración permite la visualización de todos los parámetros de todos los archivos incluidos en la base de datos de Neutrophils_NM representada la base de datos normalizada. El diagrama presentado en la figura 2C, lado derecho, muestra que todos los archivos incluyen en la base de datos de Neutrophils_NM (n = 11) en 2 SD en comparación con la mediana del grupo.
2. Estrategia de análisis para los monocitos - Monocytes_NM construcción de base de datos
   1. Identificar las células de estirpe monocítica (CD117 +-CD64 + Hola HLADR + hi) mediante una intersección de cuatro puertas (figura 2A). Asignar estos eventos a la pestaña 'Monocítica' en el árbol de jerarquía de población.
   2. Desmarque los eventos restantes, manteniendo sólo las células monocytic visible, luego exportación esta población haciendo clic en ' archivo | Exportación de ' y verificar que todos los parámetros requeridos son verificados y guardar los datos como archivos de FCS.
   3. En un archivo combinado de todos los archivos exportados de FCS, realizar una verificación de calidad mediante la evaluación de la intensidad de la expresión de marcadores para cada subpoblación y, a continuación, quite los casos fuera de las curvas de 2SD (detalles en sección resultados representante) (figura 2 B).
   4. En el archivo resultante con las células "Monocítica" visibles, dibujar el camino de maduración en el diagrama de la APS (a la izquierdafigura 2C ) y guardar como un archivo de .cyt.
      Nota: Una comparación de esquema de maduración permite la visualización de todos los parámetros de todos los archivos incluidos en la base de datos de Monocytes_NM representada la base de datos normalizada. El diagrama presentado en la figura 2C, lado derecho, muestra que todos los archivos incluyen en la base de datos de Monocytes_NM (n = 10) en 2 SD en comparación con la mediana del grupo.
3. Estrategia de análisis para eritrocitos nucleados (NRCs) - construcción de base de datos NRC_NM
   1. Identificar CD34 + blastos eritroides cometidos utilizando un cruce de siete puertas que permiten la selección de CD34 + CD117 + HLADR + baja CD105 + CD33 - CD36 + CD71 + eventos (figura 3a.1). Asignar estos eventos a la pestaña "NRC" en el árbol de jerarquía de población y luego desmarque esta pestaña para quitar estas células (mostradas en rojo) de la pantalla de los eventos restantes (gris).
   2. Identificar NRCs más maduros con una intersección de cuatro puertas que permiten la discriminación de CD45-/ + dim SSClow CD36 + Hola CD71 + Hola CD105 + /-de las células. Asignar estos eventos a la pestaña de "NRC" (figura 3A(2)). Las plaquetas (CD36 + Hola SSClow células) debe ser retirado de la población de NRC (figura 3A(2)).
   3. Desmarque los eventos restantes, manteniendo sólo las células de la NRC visible, luego exportación esta población haciendo clic en ' archivo | Exportación de ' y verificar que todos los parámetros requeridos son verificados y guardar los datos como archivos de FCS.
   4. En un archivo combinado de todos los archivos exportados de FCS, realizar una verificación de calidad mediante la evaluación de la intensidad de la expresión de marcadores para cada subpoblación, seguida de la eliminación de los casos fuera de la (2) (ver detalles en sección resultados representante) curvas Figura 3 B).
   5. En el archivo resultante con las células "NRC" visibles, dibujar el camino de maduración en el diagrama de la APS (figura 3C, izquierda) y guardar como un archivo de .cyt.
      Nota: Una comparación de esquema de maduración permite la visualización de todos los parámetros de todos los archivos incluidos en la base de datos NRC_NM representada la base de datos normalizada. El diagrama presentado en la figura 3C, lado derecho, muestra que todos los archivos incluyen en la base de datos NRC_NM (n = 14) en 2 SD en comparación con la mediana del grupo.
4. Evaluación de la maduración en compartimientos mieloides BM utilizando las bases de datos de maduración
   1. Abra el archivo .cyt correspondiente al linaje de interés (es decir., Neutrophils_NM_GMFF.cyt de linaje neutrófilo, Monocytes_NM_GMFF.cyt de linaje monocytic y NRCs_NM_GMFF.cyt de linaje eritroide).
   2. Haga clic en la pestaña de 'Maduración' debajo de la ficha correspondiente al linaje de interés (' neutrófilos | Monocítica | NRC') y guardar la base de datos de maduración a maduración.
   3. Abra un nuevo archivo de FCS y realizar análisis como se explicó anteriormente (paso 4.1.1–4.1.3 para neutrófilos, paso 4.2.1 para las células Monocytic, y de paso 4.3.1–4.3.2 para NRC).
   4. Dibujar el camino de maduración para la población de interés.
   5. Abra la base de datos correspondiente en la pestaña 'Herramientas' (análisis de la base de datos) y comparar la población a analizar con la base de datos correspondiente de maduración. Verificar los datos para la compatibilidad con la base de datos disponible: completa compatibilidad (triángulo verde); compatibilidad parcial, en la mayoría de las discrepancias de casos en el nombre de los parámetros (triángulo amarillo); e incompatibilidad (triángulo rojo).
   6. Si los datos son compatibles o parciales compatibles, el software crea el diagrama ' normalizado de las diferencias de maduración ' . Para visualizar las ' diferencias de maduración parámetro banda ', abrir un nuevo diagrama en pestaña 'Diagrama' , 'Maduración' , haga clic en y elija cuántos parámetros se muestran, haga clic en 'OK' y el diagrama aparecen. Con click derecho en el diagrama; pueden hacer cambios en la visualización de datos, visualización de la base de datos y visualización del esquema de maduración.
   7. Para visualizar la importancia de las diferencias entre el nuevo archivo y datos incluidos en la base de datos, configurar un zoom (haga click en ' diferencias de maduración normalizado ' y aplicar 'Zoom').

Resultados

Las 54 muestras de BM en anticoagulante EDTA K se incluyeron en el estudio. Se analizaron los datos MFC en la ausencia de cualquier información sobre los pacientes. Estudio retrospectivo demostró que las muestras del BM eran de 7 donantes sanos (5 machos y 2 hembras con una edad media de 47.4 [35-48], 11 personas sin evidencia de una enfermedad hematopoyética (8 varones y 3 hembras con una edad promedio de 57.9 [35-72]) y 36 casos con varias condiciones patológicas: 1 caso con anemia...

Discusión

La calidad de aspirado del BM podría impactar en los resultados finales. La hemodilución de la aspirada del BM podría distorsionar la distribución de células en diferentes etapas de maduración debido a la ausencia de progenitores o precursores. Probablemente emplear un bulto lisis método puede ayudar en la normalización de BM aspira por hemodilución en los análisis de citometría de flujo. Además, los pasos críticos para la evaluación de la displasia mieloide BM por citometría de flujo son la muestra proces...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACSCanto II flow-cytometer	BD Biosciences, CA, USA	SN: V33896301336	3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R Centrifuge	AWEL Industries, FR	SN: 910120016; Model No: 320002001	low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes
Pipetts of 10µL and 200µL
Pasteur pipettes
15 mL Falcon tubes
polypropylene tube for FACS
Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Biosciences, CA, USA	655874	clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)
Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences, CA, USA	560777	clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)
Mouse Anti-Human CD16	BD Biosciences, CA, USA	656146	clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD13	BD Biosciences, CA, USA	347406	clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD34	BD Biosciences, CA, USA	347222	clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)
Mouse Anti-Human CD117	BD Biosciences, CA, USA	339217	clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)
Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, CA, USA	333143	clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm
Mouse Anti-Human CD10	BD Biosciences, CA, USA	646783	clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD35	BD Biosciences, CA, USA	555452	clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD64	BD Biosciences, CA, USA	644385	clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD300e	Immunostep	IREM2A-T100	clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, CA, USA	641394	clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD36	BD Biosciences, CA, USA	656151	clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences, CA, USA	560839	clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD33		345800	clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD71	BD Biosciences, CA, USA	655408	clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Lysing Solution 10x Concentrate (IVD)	BD Biosciences, CA, USA	349202
FACSFlow Sheath Fluid	BD Biosciences, CA, USA	342003
FACSDiva CS&T IVD beads	BD Biosciences, CA, USA	656046
RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS	Cytognos, Salamanca, Spain	SPH-RCP-30-5A	lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)	BD Biosciences, CA, USA	ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3	BD Biosciences, CA, USA
Phosphate buffered saline tablets	R&D Systems, Minneapolis, USA	5564
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, France	A9647
Sodium azide 99%	Sigma-Aldrich, France	199931
Infinicyt software version 1.8.0.e	Cytognos, Salamanca, Spain