Una estrategia eficiente para la generación de sistemas de transcripción binario tejidos específicos en Drosophila genoma editando

Resumen

Aquí, presentamos un método para generar sistemas de transcripción binario tejidos específicos en Drosophila sustituyendo el primer exón de la codificación de los genes con los conductores de la transcripción. El método basado en el CRISPR/Cas9 coloca una secuencia de transactivator bajo la regulación endógena de un gen sustituyó y en consecuencia facilita la expresión de transctivator exclusivamente en los patrones espacio-temporales de gene-específico.

Resumen

Sistemas de transcripción binario son poderosas herramientas genéticas utilizadas para visualizar y manipular el celular destino y expresión genética en grupos específicos de células o tejidos en organismos modelo. Estos sistemas contienen dos componentes como líneas transgénicas. Una línea de conductor expresa un activador transcripcional bajo el control de promotores específicos de tejido/potenciadores y un puertos de línea de reportero/efector un gene de la blanco se coloca aguas abajo para el sitio de unión del activador de transcripción. Animales que ambos componentes inducen la transactivación específica de tejido de una expresión del gen objetivo. Precisa expresión espaciotemporal del gen en tejidos específicos es fundamental para la interpretación objetiva de la actividad del gene de la célula. Por lo tanto, es esencial el desarrollo de un método para generar líneas exclusivo controlador de células/tejidos específicos. Aquí presentamos un método para generar sistema de expresión específicos altamente específica de tejido mediante el empleo de un "cluster regularmente Interspaced corto palindrómico Repeat/CRISPR-asociados" (CRISPR/Cas)-basado en genoma edición técnica. En este método, la endonucleasa Cas9 está dirigido por dos quimérica guía RNAs (gRNA) a sitios específicos en el primer exón de la codificación de un gen en el genoma de Drosophila para crear roturas de doble cadena (DSB). Posteriormente, usando un plásmido donante exógeno que contenga la secuencia del transactivator, la maquinaria de reparación celular autónoma permite reparación dirigida de homología (HDR) del OSD, dando por resultado la eliminación precisa y reemplazo del exón con el transactivator secuencia. El transactivator noqueó en se expresa exclusivamente en las células donde el cis-elementos regulatorios del gen sustituyó son funcionales. El protocolo paso a paso detallado presentado aquí para generar un controlador transcripcional binario expresado en Drosophila fgf/servicios-produciendo células epiteliales/neuronales puede adoptarse para cualquier expresión del gene o tejido específico.

Introducción

La caja de herramientas genética para genes específicos se ha desarrollado bien en Drosophila, convirtiéndolo en uno de los mejores sistemas de modelo para investigar la función de genes implicados en una amplia variedad de procesos celulares. Sistemas de expresión binaria, como levadura Gal4/UAS (secuencia de activación upstream), primero fue adoptada para regiones reventado y gen potenciador de tejidos específicos en el modelo genético de Drosophila ¹ (figura 1). Este sistema facilita el desarrollo de un gran número de técnicas tales como la regulación espacio-temporal de sobreexpresión de genes, regiones, golpe de gracia en determinados grupos de células, así como en la ablación de la célula, marca de celular, en rastreo de celulares y moleculares procesos en el embrión y los tejidos, rastreo de linaje y mosaico análisis durante el desarrollo. Un número del sistema binario de la transcripción, como la bacteriana LexALexA_op (figura 1) y Q-sistema de Neurospora , son poderosas herramientas genéticas que son ampliamente utilizados en Drosophila, además el original sistema de Gal4/UAS dirigida gene expresión^1,2,3.

Aquí, presentamos un método para generar sistema fiable expresión binaria de tejidos específicos mediante el empleo de una técnica de edición del genoma. Los recientes avances en la tecnología de edición CRISPR/Cas9 genoma han permitido oportunidades sin precedentes hacer cambios de genoma dirigido en una amplia gama de organismos. En comparación con las otras técnicas de edición de genoma disponible, el sistema CRISPR/Cas9 es barato, eficiente y confiable. Esta tecnología utiliza componentes del sistema inmune adaptativo bacteriano: una endonucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes que crea una rotura de doble cadena (DSB) y un ARN quimérico guía (gRNA), que guía la Cas9 a un sitio particular del genoma para específicas OSD⁴. Las células contienen la maquinaria para reparar el OSD mediante diferentes vías. No homólogos se terminan uniendo (NHEJ) lleva a pequeñas inserciones o eliminaciones interrumpir funciones de los genes, mientras que la reparación dirigida de homología (HDR) presenta un definida dirigida/deseable genómico knock-en/knock-out mediante un donador exógeno de HDR como una plantilla. La estrategia de reemplazo basada en HDR puede utilizarse eficientemente para generar un sistema altamente confiable expresión binaria de tejidos específicos, que puede superar todas las limitaciones de los métodos de trampa tradicional potenciador. Describimos un procedimiento paso a paso para la utilización de reparación HDR CRISPR/Cas9-basado en la generación de una línea de controlador binario de transcripción que se expresa bajo el control de la regulación transcripcional y postranscripcional endógena de un Drosophila gen. En este protocolo, se demuestra la generación de una línea de controlador específica para servicios (bnl) gen codificando una proteína familia FGF que regula la morfogénesis ramificación de la vía aérea traqueal epitelio⁵. En este ejemplo, el primer exón de la codificación del gene del bnl fue substituido por la secuencia de una secuencia de transactivator bacteriana LexA sin alterar cualquier endógeno cis-secuencias reguladoras del gene del bnl . Nos muestran que la estrategia genera una línea de conductor de bnl-LexA que spatiotemporally controla la expresión de un gen reportero colocado aguas abajo de LexAoperator (LexAop o LexO) exclusivamente en bnl- expresando las células epiteliales/mesenquimales/neuronal.

Protocolo

1. diseñar y construir el gRNA Vector de expresión

1. Para sustituir precisamente una región larga definida de un exón, utilice un gRNA doble enfoque⁶, en el cual cada gRNA puede apuntar específicamente a dos extremos de la región seleccionada de interés. Para obtener la precisa expresión espaciotemporal gene-específica del controlador, seleccione dos sitios de destino de gRNA dentro del primer exón de la codificación del gene.
2. Para Drosophila melanogaster, seleccionar los sitios de destino de gRNA utilizando la herramienta de buscador de objetivo óptimo de flyCRISPR (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/). Otras herramientas de diseño disponibles CRISPR se pueden utilizar, incluyendo la herramienta de diseño optimizado de CRISPR (http://crispr.mit.edu), FlyCas9 (https://shigen.nig.ac.jp/fly/nigfly/cas9) y E-(www.e-crisp.org/E-CRISP).
   Nota: Los siguientes protocolos de gRNA diseño y clonación fue adoptado de los métodos previamente descritos^6,7.
   1. Copie la secuencia real en la caja proporcionada en la herramienta en línea. Seleccione el más recientemente publicado Drosophila melanogaster genoma anotación versión, "r_6," en el menú desplegable de "Seleccione genoma." En el campo "Guía seleccione longitud (nt)," entrada "20." Seleccione para encontrar "Todos los objetivos CRISPR" y haga clic en «Buscar CRISPR objetivos».
   2. Evaluar todos los objetivos de la gRNA candidato poniendo "Máximo" por "Rigor" y "NGG sólo" para "PAM". Trate de seleccionar los sitios de gRNA sin ningún objetivo de potencial o un número mínimo de posibles fuera de objetivos. Uso la herramienta web descrito en Doench et al 2014 ⁸ para seleccionar gRNAs con una puntuación de "bueno" de la actividad potencial.
   3. Al mismo tiempo, no Asegúrese de que polimorfismo de nucleótido único en los objetivos de gRNA en el genoma de la línea de mosca de padres seleccionado para la inyección (Por ejemplo, nos Cas9 en cromosoma X, BL # 54591). Seguir el protocolo descrito en Gratz et al 2015⁷ para extraer el ADN genómico de la línea de mosca de los padres. Amplificación de PCR, aproximadamente, las regiones nt 500 – 1.000 utilizando cebadores que flanquean la secuencia de interés y una ADN polimerasa de alta fidelidad; secuencia-verificar los productos PCR amplificado.
3. Para generar un vector de expresión de gRNA tándem, siga una ligadura independiente clonación protocolo⁶ para introducir dos secuencias protospacer en un vector de expresión de RNA de pCFD4. Tenga en cuenta que un vector de expresión multi-gRNA mejorada (pCFD5) ya está disponible donde se expresan tanto el sgRNAs de la U6:3 fuertes promotores⁹ (https://www.crisprflydesign.org). Use un método de ensamblaje de ADN a clonar los gRNAs en el vector de pCFD4.
   1. Diseñar y ordenar los iniciadores hacia adelantados y hacia atrás para introducir dos secuencias protospacer en el pCFD4 de vector de expresión de RNA (tabla 1A). Como se describió anteriormente⁶, el primer avance contiene la primera secuencia de protospacer flanqueada por las regiones correspondientes al promotor U6-1 y base del gRNA en pCFD4; el primer reverso contiene la secuencia del complemento reverso de la segunda protospacer flanqueado por las regiones correspondientes al gRNA core y el promotor U6-3 en pCDF4.
   2. Resuspender cartillas a 100 μM con agua destilada doble libre de RNasa y DNasa (ddH₂O). Hacer una cartilla de concentración 10 μM trabajo. Utilice pCFD4 plásmido como plantilla y configurar la reacción de PCR utilizando una polimerasa de alta fidelidad y recomendados para PCR la reacción⁶.
   3. Para clonar el producto amplificado en pCFD4, digerir pCFD4 plásmido con enzimas de BbsI estableciendo la siguiente reacción: 2 – 5 μg de plásmido pCFD4, 5 μL de 10 x buffer de digestión, 1 μL de enzima de BbsI y ddH₂O para hacer el volumen final de 50 μL. Mezcle el contenido de reacción suavemente golpeando ligeramente el tubo y recogiendo todas las gotitas dispersas de la pared del tubo a la parte inferior por un centrifugado breve. Incubar la mezcla de reacción a 37 ° C por 2 h.
   4. Ejecutar el producto PCR de paso 2 y el producto digerido desde el paso 3 en un gel de agarosa al 1%. Realizar la electroforesis para el tiempo suficiente para separar completamente las bandas de ADN. Corte el correcto tamaño de bandas de ADN en un trans-iluminador UV antes de purificar los productos esperados utilizando columna de elución de gel siguiendo las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales). El producto PCR debe ser 600 bp y el plásmido linearizado pCFD4 debe ser ~6.4 kb ⁶.
   5. Configurar la reacción de la Asamblea de ADN en un tubo PCR, por las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales).
   6. Transformar 2 μL del producto conjunto de bacterias competentes (DH5α o variedades similares con ΔrecA1, ΔendA1), placa de ampicilina (100 μg/mL) que contiene las placas de agar LB (LB/Amp) e incube a 37 ° C durante la noche. Tenga en cuenta que la mezcla de Asamblea de ADN podría ser tóxica para ciertas cepas de bacterias, pero diluyendo la mezcla de montaje puede reducir la toxicidad.
   7. Escoger 3-4 colonias resistentes a la ampicilina de la placa se incubó durante la noche, inocular la colonia de 3 mL LB con ampicilina μg/mL 100 y crecen las bacterias inoculadas en una coctelera de 37 ° C durante la noche. Extraiga el plásmido de las bacterias cultivadas durante la noche utilizando el kit de preparación para el mini plásmido siguiendo las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales).
   8. La plásmidos con el imprimador universal T3 pantalla para los clones correcto que contiene la inserción de gRNA tándem de la secuencia. Establecer un stock de glicerol de bacterias transformadas con un gRNA pCFD4 de secuencia verificada en glicerol al 20% y almacenar en un congelador de-80 ° C para su uso futuro.

2. diseñar y construir al donante HDR

1. Para genómica knock-in de una secuencia Gal4 o LexA , diseño de un donante HDR de doble cadena que contiene la secuencia del transactivator flanqueada por dos brazos de homología.
   1. Uso > 1,5 kb a la izquierda y brazos de homología derecha flanqueando el gRNA dirigidos a sitios. Brazos extendidos homología aumentan la eficiencia de HDR durante el proceso de reparación de ¹⁰.
   2. PCR amplifica los brazos de la homología de la DNA genómico (gDNA) extraído de la línea de mosca de padres seleccionada para la inyección (Por ejemplo, nos Cas9 (en el cromosoma X), BL # 54591). Utiliza una enzima de hot-start Taq-DNA polimerasa de revisión adecuada para la larga extensión PCR (véase Tabla de materiales). Verificar la secuencia.
2. Para evitar el retargeting de gRNA al lugar geométrico ingeniería, diseño al donante de recambio de tal manera que los sitios de reconocimiento de gRNA se interrumpen por la secuencia exógena introducida.
   Nota: para evitar alterar el elementos cis-reguladores putativos, siempre seleccionar los sitios de reconocimiento de gRNA dentro de la región codificante del exón.
3. Para la generación de un cassette de recambio, plan de la estrategia de la Asamblea de ADN para unir cuatro segmentos: los brazos de homología 5' y 3' la secuencia de ADN del medio transactivator exógena y la clonación lineal vector columna vertebral (por ejemplo, pUC19 u otro utilizan vectores de clonación). Siguiendo la pauta del fabricante para el montaje de la DNA (véase tabla de materiales), diseño de los cebadores adecuados para la amplificación por PCR y montaje de cada segmento. Resuspender cartillas a 100 μM con ddH₂O. hacer una cartilla de concentración 10 μM trabajo. Usar la polimerasa de alta fidelidad para todas las reacciones de PCR. Siga el siguiente protocolo:
   1. PCR amplifica un cassette de expresión de Gal4 o LexA de un vector disponible (por ejemplo, nls-LexA:p65; la plásmidos de expresión de Gal4/LexA/QF2 ideal se pueden encontrar y obtenida de recursos comunes como Addgene) utilizando el cartillas enumeradas en la Tabla 1B.
      1. Para conservar todas las regulaciones originales transcripcionales y postranscripcional del exón sustituyó en la expresión de la secuencia de ADN del transactivator, diseño de la cinta de tal manera que el alelo genómico editado expresaría un mRNA quimérico de la transactivator y el gen. Preservar el extremo 5' y 3' del exón dirigido a retener cualquier señal que empalma.
      2. Incorporar una T2A auto Hendedoras secuencia del péptido entre el residuo 5' codificación exón y la secuencia del transactivator para evitar la traducción a una proteína quimérica. Añadir un codón de parada de traducción después de la secuencia del transactivator exógeno (figura 5).
   2. PCR amplifica los brazos de la homología de la DNA genómico (gDNA) extraído de la línea de mosca de padres seleccionada para la inyección (Por ejemplo, nos Cas9 (en el cromosoma X), BL # 54591) usando los cebadores enumerados en la Tabla 1B. Usar la polimerasa de alta fidelidad para todas las reacciones de PCR utilizando los sistemas como sigue: 5 μL de 5 x Buffer de reacción, 0.5 μL de 10 mM de dNTPs, 1.25 μL de 10 μM adelante cartilla, 1.25 μL de 10 μM cartilla reversa, 0.5 μL de DNA de la plantilla, 0,25 μL de polimerasa de la DNA alta fidelidad , 16,25 μL de ddH₂O.
   3. Utilice el vector linearizado clonación como pUC19. Ahora hay un número de vectores de donantes. Ver una lista completa en el siguiente sitio web-http://flycrispr.molbio.wisc.edu.
   4. Ejecutar los productos PCR en un gel de agarosa al 1%. Realizar la electroforesis durante suficiente tiempo asegurar una clara separación de la banda deseada de las bandas de no específicos no deseadas (si existe). Gel-purificar los fragmentos de ADN esperados. Medir la concentración de cada fragmento de ADN purificado usando un espectrofotómetro.
   5. Configurar la reacción de la Asamblea de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante. Mezclar los fragmentos lineal de vectores y destino clonación del paso 3 y paso 4 en la siguiente reacción: 1 μL de linear vector (50 ng/μL), 2 – 3 veces exceso de cada fragmento de destino, 10 μL de 2 x mezcla principal de la Asamblea de ADN, la clonación llevar el volumen final de reacción de 20 μL con ddH < C21 > 2O. Incubar la mezcla de reacción durante 1 hora a 50 ° C.
   6. Transformar 2 μL del producto de la Asamblea en bacterias competentes, placa en placas de agar LB/Amp con 100 ampicilina μg/mL. También, Añadir X-Gal + IPTG en la placa para azul/blanco cribado.
   7. Tomar 3-4 colonias blancas de la placa se incubó durante la noche, inocular la colonia de 3 mL LB con ampicilina μg/mL 100 y crecen a 37 ° C durante la noche en una coctelera Boston. Manual del extracto de plásmido de las bacterias cultivadas durante la noche utilizando el kit de preparación para el mini plásmido siguiendo el fabricante (véase Tabla de materiales).
   8. Pantalla de la Colonia positivo por PCR o restricción de la digestión.
   9. Secuencia de verificar la región donante HDR del plásmido final. Guardar una acción bacteriana transformada con los clones correcto en 20% de glicerol a-80 ° C para inoculación de futuro.

3. embrión inyección, mosca genética y proyección para la edición del genoma

1. Preparar el gran vector de expresión de pureza gRNA libre de endotoxinas, así como el plásmido donante HDR usando un plásmido maxiprep kit (véase Tabla de materiales).
2. Conjuntamente inyectar el plásmido de expresión de gRNA (100 ng/μL) y el donante de recambio (500 ng/μL) en la línea germinal de Enmiendas Cas9 embriones⁶. Nota: utilizamos un servicio comercial para la inyección, pero este procedimiento puede realizarse en el laboratorio también.
3. La mosca genética y proyección (figura 2 y figura 3):
   1. Cuando los embriones inyectados se convierten en adultos, cruzado cada solo G₀ vuela Vuela balanceador. Seleccione el adecuado balanceador para el cromosoma con el alelo específico.
   2. Anestesiar la F1 prole de G0 cada cruz en una almohadilla de CO₂ y elegir al azar los machos de 10-20 bajo un estereomicroscopio. Cruzarlos individualmente a las hembras de balanceador como se muestra en la figura 3.
   3. Cuando la escotilla de larvas de F2, recoger el padre de F1 único de cada cruz y extraer gDNA usando el única mosca genomic ADN preparación protocolo:
      1. Preparar el tampón de extracción gDNA: 10 mM Tris-Cl de pH 8.2, EDTA 1 mM, 25 mM NaCl, almacenar a temperatura ambiente. Prepare 20 mg/mL de proteinasa K solución y almacenar en el congelador.
      2. Colocar cada mosca en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y etiquetar el tubo. Mantener en el congelador de-80 ° C durante la noche.
      3. Preparar un volumen de trabajo fresca del gDNA tampón de extracción que contiene la concentración final de 200 μg/mL de proteinasa K.
         Nota: No use un tampón antiguo para este paso.
      4. Aplastar cada mosca para 10 – 15 s con una punta de pipeta con 50 μL de aplastar las buffer sin suministro del líquido. Dispensar buffer restante en el tubo y mezclar bien. Incubar a 37 ° C durante 20-30 min.
      5. Poner tubos en el bloque de calor de 95 ° C durante 1 – 2 minutos inactivar la proteinasa K.
      6. Desactivación por 5 min a 10.000 x g. Guarde la preparación en 4 ° C para su posterior análisis de la polimerización en cadena.
4. Utilizar el mismo método para preparar gDNA de una mosca nos Cas9 , que sirve como control negativo. Realizar pantallas PCR basado en tres pasos para identificar el correcto extremos del"hacia fuera" HDR (figura 2, figura 5) usando gDNA de cada macho F1 como una plantilla de⁵. Use 1 μL de la preparación de ADN en el sistema siguiente de la reacción de PCR: 10 μL de 2 x PCR Master Mix con tinte, 1 μL de cada cebador (10 μM), 1 μL de plantilla de la DNA y 7 μL de ddH₂O.
5. Como se muestra en la figura 5A, realizar PCR utilizando primers fwd1 y rev1 a pantalla la existencia de la inserción o reemplazo; realizar PCR utilizando primers fwd2 y rev2 para verificar la inserción o reemplazo de 3' región; realizar PCR utilizando primers M13F y rev3 para revisar los "extremos en" HDR (tabla 1).
6. Mantener las líneas de mosca con el HDR extremos de salida confirmada y establecer acciones equilibradas de la generación F2. Outcross a las moscas balanceador otra vez para quitar cualquier mutaciones no deseadas en otros cromosomas.
7. Preparar gDNA de alta calidad de las acciones establecidas para la amplificación de la polimerización en cadena larga (> 800 – 1.000 nt) amplicones con Taq polimerasa de alta fidelidad y secuencia verificar los amplicones obtenidos de las regiones genómicas ingeniería. Alternativamente, utilice extracto crudo gDNA como se describe anteriormente para amplificar más corta (< 800 nt), superposición de productos de la PCR para validar de secuencia el genoma editado. Utilizar el siguiente protocolo para preparar el ADN genómico de la Drosophila de buena calidad:
   1. Poner sobre 25 moscas adultas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y congelar en el congelador de-20 ° C o -80 ° C durante al menos 1 hora.
   2. Añadir 250 μL de solución A (pH 9.0 Tris HCl 0.1 M, EDTA 0,1 M, SDS 1%).
   3. Homogeneizar las moscas mediante las homogeneización majas en tubos de microcentrífuga y poner el tubo en hielo.
   4. Incubar a 70 ° C por 30 minutos.
   5. Añadir 35 μL de KOAc (5 M), agitar y mezclar bien, pero hacer no agitar con vortex.
   6. Incubar en hielo durante 30 minutos.
   7. Vuelta a 12.000 x g durante 15 minutos.
   8. Con una micropipeta de 1 mL, cuidadosamente transferir sólo el sobrenadante a un tubo nuevo, dejando atrás cualquier precipitado o interfase.
   9. Añadir 150 μL de isopropanol para el sobrenadante. Mezclar suavemente por inversión.
   10. Centrifugado a 10.000 x g durante 5 minutos.
   11. Cuidadosamente Quite el sobrenadante y dejar el sedimento en el tubo.
   12. Lavar el pellet con 1 mL 70% EtOH.
   13. Vuelta a 12.000 x g durante 5 minutos.
   14. Eliminar el sobrenadante. Secar el pellet por 15 a 20 min. No secar sobre el sedimento.
   15. Disolver el sedimento en 100 μL de ddH₂O.
   16. Uso de alta fidelidad de la polimerasa de la DNA conveniente para productos largos (> 800 bp) para amplificar la región editada completa. Lo ideal es tomar dos cartillas fuera el cassette insertado para amplificar la región genomic. Gel de purificar el producto PCR, y como se describió anteriormente, la secuencia de verificar el producto con múltiples cebadores superpuestos.
8. Validar los patrones de expresión espaciotemporal correcta de tejidos o embriones disecados de las líneas de mosca dirigidos:
   1. Realizar RT-PCR del ARN total para verificar la expresión del producto de mRNA híbrido (tabla 1).
   2. Llevar a cabo un hibridación en situ del producto de interés en los tejidos larval/embrión para validar la expresión mRNA.
   3. Pantalla para los patrones de expresión espacio-temporal específica de tejido precisa entre las líneas de salida de extremos secuencia verificada, cruzar las líneas editadas obtenidos para el conductor de la expresión binaria con el LexO- GFP o LexO- RFP (para LexA driver) line (disponible en los centros de población de Bloomington) y observe la LexA o Gal4 impulsado por la expresión del gen reportero en los tejidos de larvas y adultos de embrión, bajo un microscopio de fluorescencia.

Resultados

Este protocolo fue utilizado con éxito para generar una expresión binaria específica reportero sistema específica para bnl expresando células⁵. El cis-elementos reguladores (CREs) que controlan la expresión espaciotemporal complejo bnl no caracterizan. Por lo tanto, para lograr expresión espacio-temporal bajo el control de la secuencia de regulación endógena bnl , solamente el primer exón codificación de bnl f...

Discusión

Tradicionalmente, las trampas de potenciador de Drosophila fueron generadas por dos métodos diferentes. Una de las formas incluye inserción al azar de un conductor (ej., Gal4) secuencia en el genoma por transposición (e.g., transposición de elemento P)¹ . Por otra parte, las secuencias de controlador pueden colocarse bajo el control transcripcional de una región enhancer putativos/promotor en una construcción del plásmido, que luego se integrarían en un sitio ect...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
X-Gal/IPTG	Gentrox (Genesee Scientific)	18-218	cloning
LB-Agar	BD Difco	BD 244520	cloning
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Molecular Biology
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Molecular Biology
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Molecular Biology
UltraPure DNase/RNase-Free Water	ThermoFisher Scientific	10977-023	Molecular Biology
10% SDS	Sigma Aldrich	71736	Molecular Biology
KOAc	Fisher-Scientific	P1190	Molecular Biology
EtOH	Fisher-Scientific	04-355-451	Molecular Biology
GeneJET Miniprep	ThermoFisher Scientific	K0503	Miniprep
PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits	ThermoFisher Scientific	K210006	Maxiprep
BbsI	NEB	R0539S	Restriction enzyme
Primers	IDT-DNA		PCR
pCFD4	Kornberg Lab		DNA template and vector for gRNA
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)	Kapa biosystems	KK2601	PCR
Q5-high fidelity Taq	NEB	NEB #M0491	PCR
Gibson Assembly Master Mix	NEB	NEB #E2611	DNA assembly
pBPnlsLexA:p65Uw	Addgene		DNA template for LexA amplification
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Molecular Biology
2x PCR PreMix, with dye (red)	Sydlab	MB067-EQ2R	Molecular Biology
Gel elution kit	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-300	Molecular Biology
TRI reagent	Sigma-Aldrich		Molecular Biology
Direct-zol RNA purification kits	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-330	Molecular Biology
OneTaq One-Step RT-PCR Kit	NEB	E5315S	Molecular Biology
lexO-CherryCAAX	Kornberg Lab		Fly line
UAS-CD8:GFP	Kornberg lab		Fly line
btl-Gal4	Kornberg lab		Fly line
MKRS/TB6B	Kornberg lab		Fly line
Confocal Microscope SP5X	Leica		Imaging expression pattern
CO2 station	Genesee Scientific	59-122WCU	fly pushing
Stereo microscope	Olympus	SZ-61	fly pushing
Microtube homogenizing pestles	Fisher-Scientific	03-421-217	genomic DNA isolation
NanoDrop spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-1000	DNA quantification