Medición de Cytometric del flujo de producción de ROS en los macrófagos en respuesta a Cross-linking FcγR

Resumen

Este estudio demuestra el uso de citometría de flujo para detectar la producción de (ROS) las especies reactivas de oxígeno resultante de la activación de la FcγR. Este método puede utilizarse para evaluar los cambios en el antimicrobiano y función de los fagocitos en respuesta a complejos inmunes, microorganismos opsonizadas o FcγR directa Cross-linking de señalización redox.

Resumen

La explosión oxidativa o respiratoria se utiliza para describir el rápido consumo de oxígeno y la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) por los fagocitos en respuesta a varios estímulos inmunes. ROS generados durante la activación inmune ejerce potente actividad antimicrobiana sobre todo a través de la capacidad de ROS para dañar el ADN y las proteínas, causando la muerte de los microorganismos. Ser capaz de medir la producción de ROS reproducible y con facilidad es necesario para evaluar la contribución de varias vías y moléculas para este mecanismo de defensa del huésped. En este trabajo, demostrar el uso de sondas fluorescentes y citometría de flujo para detectar la producción de ROS. Aunque ampliamente utilizado, es muy problemático, especialmente en cuanto a medición de ROS inducida por estímulos específicos y no mitogénicos medición fluorescente de ROS. Presentamos una metodología detallada para la detección de ROS generados como resultado de la estimulación específica de FcγR comenzando con generación de macrófago, cebado, coloración, FcγR Cross-linking y terminando con el análisis cytometric del flujo.

Introducción

Especies reactivas del oxígeno (ROS) son moléculas reactivas o radicales libres que son subproductos de la respiración aeróbica (revisado en ¹). Estas incluyen el anión superóxido, peróxido, peróxido de hidrógeno, radical hidroxilo y los iones hidroxilo, entre otros. En condiciones fisiológicas normales, ROS son producidos principalmente por las mitocondrias y oxidasas de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) y son desintoxicados rápidamente por varias enzimas y proteínas tales como la superóxido dismutasa y glutatión. Una exagerada producción de ROS o un defecto en la capacidad de eliminar ROS puede resultar en estrés oxidativo, por el que especies reactivas de oxígeno promueven el daño de las proteínas, lípidos y ADN llevando a estados patológicos de la enfermedad o la muerte y el estrés celular. Sin embargo, actualmente se aprecia que ROS también pueden actuar como moléculas de señalización (redox signaling), y modificación mediada por ROS de diversas moléculas y productos intermedios de la vía puede influenciar metabolismo celular, proliferación, supervivencia, inflamatoria señalización y envejecimiento². En las células fagocíticas, ROS juega un papel esencial en la prestación de la actividad antimicrobiana durante el llamado "Estallido respiratorio"^1,3,4,5,6. Durante la respuesta de los fagocitos a los estímulos externos, componentes de la NADPH oxidasa complejo (p40^phox, p47^phox, p67^phox) translocan desde el citosol a la membrana phagosomal que contiene la gp91phox y p22phox subunidades, y junto con las acciones de Rac1/2, forman un completamente funcional NADPH oxidasa complejo de la enzima. La oxidasa de NADPH montada entonces utiliza NADPH para reducir el oxígeno a superóxido dentro de la vacuola phagosomal. Aniones superóxido pueden dañar directamente o dismutated en peróxido de hidrógeno. Superóxido y peróxido de hidrógeno pueden reaccionar con otras moléculas para generar a radicales hidroxilo altamente reactivo. Daño es mediado por la reacción de estos ROS con racimos de hierro-azufre en proteínas o haciendo base oxidación del ADN, en última instancia conduce al limitado metabolismo microbiano o la muerte del microbio⁵. La importancia de la enzima oxidasa de NADPH complejo y ROS producidos durante la explosión respiratoria se ilustra clínicamente en pacientes con enfermedad granulomatosa crónica (CGD)^{7,8,9, 10}. individuos con CGD poseen mutaciones en gp91phox, resultando en una falta de producción de ROS y la susceptibilidad a infecciones recurrentes con bacterias y hongos que normalmente no son una preocupación con los individuos inmunocompetentes. Por lo tanto, si estudiar oxidativo estrés redox señalización y defensa del huésped, pudiendo medir la producción de ROS en tiempo real es un esfuerzo útil.

Múltiples ensayos se han utilizado para la producción de ROS de medida o los resultados de estrés oxidativo^11,12,13. Entre éstos, uno de los más utilizados es la sonda fluorescente 2', 7' dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFH₂-DA)¹⁴. Esta molécula es incoloro y lipofílicas. Difusión de DCFH₂-DA a través de la membrana celular permite que se actuó por esterasas intracelulares, que deacetylates DCFH_2, haciéndola celular impermeable. Las acciones de múltiples tipos de ROS (peróxido de hidrógeno, peroxinitrito, radicales hidroxilo, óxido nítrico y los radicales Peroxoborato) DCFH₂ oxidan en DCF que es fluorescente (divulgado Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) y pueden ser detectados usando un flujo de citómetro equipado con un filtro estándar de fluoresceína (FL1 canal). Superóxido no reacciona fuertemente con DCFH₂ pero puede reaccionar con otra sonda dihydroethidium (DHE) para producir el producto fluorescente 2-hydroxyethidium (así como otros productos de la oxidación de superóxido-independiente fluorescente)¹⁵. Los productos fluorescentes de oxidación DHE pueden detectarse con una longitud de onda de excitación de 518 nm y una longitud de onda de la emisión de 605 nm (FL2 canal). Aunque relativamente fáciles de usar, la utilización de estas sondas para la detección de ROS requiere conocimiento de sus limitaciones y cuidadosa incorporación de tinción procedimientos y controles en el ensayo específico se realiza para poder tener validez experimental resultados y conclusiones. El protocolo siguiente muestra el uso de un kit disponible en el mercado que emplean estos 2 puntas de prueba diseñadas para medir ROS por citometría de flujo. Mancha preparados macrófagos derivados de médula ósea con estas puntas de prueba e inducir la producción de ROS a través de cross-linking FcγR. Presentamos datos representativos obtenidos usando este protocolo y recalcar las precauciones apropiadas que se deben emprender para la experimentación exitosa.

Protocolo

El protocolo para el manejo de animales fue aprobado por el Comité institucional el cuidado Animal y del uso (IACUC) de University of Central Florida.

1. generación de la médula ósea derivados de macrófagos (BMDMs)

1. Preparación de medios de cultivo
   1. Preparar los medios base D10F: A de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM), añadir 10% calor inactiva el suero bovino fetal (FBS), piruvato de sodio 1 m m, 10 m m 4-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido ácido (HEPES) y 0,05 mM β-mercaptoetanol.
      Nota: Aunque es mejor utilizar medios D10F frescos, D10F base media puede preparar hasta dos semanas por adelantado para ser utilizado para experimentos múltiples dentro de una semana. Para un ratón, unos 175 mL de medio base D10F es necesaria (25 para lavar los huesos) y 150 mL para hacer los medios de diferenciación de macrófagos
   2. Preparar medios de cultivo de LADMAC: medio esencial mínimo de a águila (EMEM), añadir 10% calor inactiva FBS y 2 mM L-glutamina. Preparar el fresco de los medios de comunicación, el día que va a comenzar sus culturas.
      Nota: Un litro de medio de crecimiento de LADMAC resultará en alícuotas de 50 mL aproximadamente (19) de medios de comunicación LADMAC-condicionada.
   3. Preparar medios DMEM completo: A DMEM, añadir 10% calor inactiva FBS y 1 x antibiótico-antimicótico. Preparar el fresco de los medios de comunicación, en el día que bmdms se cosecharán.
      Nota: Para un ratón, unos 100 mL de medio completo DMEM será necesario. Esto incluye los medios usados para el cebado de las celdas.
2. Preparación de medio condicionado de LADMAC
   1. Crecen las células LADMAC a confluencia en un plato de 10 cm con 10 mL de medio de crecimiento LADMAC (definido en 1.1.2). Incube las células a 37 ° C, 5% CO_2.
   2. En confluencia, separar las células, dispensadores con fuerza los medios de comunicación sobre las células. Células de paso agregando 1 mL de células separadas en frascos T-175 con 100 mL de medio de crecimiento LADMAC. Incube las células hasta que completamente confluente en el ° C 37, 5% CO₂ (aproximadamente una semana). Esta manera, un plato de 10 cm puede producir frascos de diez T-175 o aproximadamente 1 L de medio condicionado.
   3. Una vez que las células están listas, recoger los medios condicionados y centrifugar a 350 x g durante 5 minutos para que sedimenten las células no deseadas. Filtrar el sobrenadante recogido a través de un filtro de 0,2 mm y almacenar en alícuotas de 50 mL a-80 ° C. Alícuotas de medios LADMAC-condicionada pueden conservarse a-80 ° C durante meses con una mínima pérdida de actividad.
      Nota: Si se anticipan grandes experimentos, preparar grandes lotes de medios de comunicación LADMAC-condicionado al mismo tiempo para asegurar la consistencia. Si esto no es posible, use alícuotas derivadas del mismo lote o lote de medios de LADMAC acondicionado para cada experimento.
3. Preparación de la médula ósea derivados de macrófagos
   1. En el día del experimento, preparar medios de diferenciación macrófago dulce mediante la adición de 25% de los medios LADMAC acondicionado en previamente preparado D10F medios (1 parte LADMAC acondicionado en 3 partes D10F). ¡No prepare este medio de antemano! Sólo preparar tanto los medios como sea necesario para el cultivo BMDM.
   2. Día 1: aislar células de médula ósea de ratón según el protocolo anteriormente descrito¹⁶ con una modificación para eliminar la médula ósea de fémur y tibia medios base D10F. Utilice 2,5 mL de D10F medios para eliminar los extremos de los huesos (4). Ras células de médula ósea directamente en un filtro de celular previamente húmedo 40 mm colocado encima de un tubo de 50 mL. Los restantes medios de comunicación (~ 5 mL) pueden utilizarse para enjuagar el tamiz de la célula.
   3. Centrifugar las células recolectadas de la médula a 350 x g por 5 min descartar el sobrenadante y resuspender las células en un total de 30 mL de medio de diferenciación de macrófagos (por ratón).
   4. Preparar y etiquetar cajas Petri estériles de 10 cm (6). Placa 5 mL de medio de diferenciación de macrófagos en cada uno en caja de Petri. Alícuota 5 mL de células de médula ósea resuspendidos en medios de diferenciación macrófago en cada placa de Petri para un volumen total de 10 mL por cada plato. Incubar 5 días a 37 ° C, 5% CO_2.
   5. Día 5: aspirar los medios de comunicación de las células. Lavar una vez con 1-2 mL de PBS y añadir 10 mL de medio de diferenciación macrófago recién preparada. Incubar durante 3 días.
   6. Día 8: Proceder a la cosecha de BMDMs como se describe a continuación.

2. cosecha, siembra y cebado de BMDMs

1. Después de 7 días de crecimiento BMDMs en los medios de diferenciación de macrófagos, eliminar el sobrenadante. Lave los macrófagos adherentes una vez con 1-2 mL de PBS. Aspire el PBS.
2. Dispensar 1 mL de 0.25% tripsina-EDTA a cada macrófago de la placa y dejarlos en la incubadora de 37 ° C durante 5-10 min con frecuentes escuchas para separar las células. Disociar los macrófagos tripsinizaron mediante pipeteo arriba y abajo con una pipeta P1000 y recoger los macrófagos en tubos de 50 mL que contiene 10-15 mL de medio DMEM completo. Lave la placa con medios DMEM completo 2 mL adicionales para cosechar cualquier restantes macrófagos.
   PRECAUCIÓN: No deje los macrófagos en tripsina durante más de 10 minutos.
3. Centrifugar los tubos de 50 mL a 350 x g durante 5 min., descartar el sobrenadante. Suavemente se disocian la pastilla y resuspender las células en 10 mL de medio DMEM completo. Cuenta macrófagos utilizando un hemocitómetro en presencia de una viabilidad del tinte como el trypan azul como sigue:
   1. Por ejemplo, mezclar 90 μl de azul tripán con 10 μl de células para un 1:10 dilución.
   2. De esta mezcla, cargar 10 μL en un hemocitómetro y contar la plaza central (cuadrícula de 5 x 5). El recuento de células totales = cuenta x 10⁴ x volumen de dilución factor x (10) (10 mL).
4. Ajustar la suspensión para 1 millón/ml en medios DMEM completo y 4 mL de esta suspensión celular en cada plato de 6 cm de la placa.
   Nota: Se requiere experiencia, un mínimo de 3 placas. Una placa de células será dejado sin estimular, un segundo conjunto de células se estimula a través de cross-linking de FcγRs, y la tercera placa de células se utilizará para todos los adicionales experimentales y controles de citometría de flujo.
5. Incubar las placas durante la noche a 37 ° C, 5% CO₂.
6. Al día siguiente, aspirar el sobrenadante, células de lavado una vez con 1-2 mL de PBS. Añadir 4 mL de medio completo que contiene 100 ratón ng/mL IFN-γ para cada placa. Incubar las placas durante la noche a 37 ° C, 5% CO₂.
7. Si lo desea, tomar una alícuota de las células para evaluar la adecuada generación de BMDMs por citometría de flujo. 1 x 10⁶ células por prueba y preparar tubos de poliestireno FACs para las siguientes condiciones: control de isotipo, con F4/80 (alternativamente, lacado o con CD11b).
8. Preparar la citometría de flujo tampón de tinción mediante la adición de 0.1% FBS en PBS 1 x. Utilice sólo esta cantidad de equipos para no anular los efectos de la inanición de suero en pasos posteriores.
9. Alícuota 1 x 10⁶ células por tubo y centrifugar a 750 x g durante 5 minutos.
10. Lavar una vez por decantación o aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 2 mL de tampón de citometría de flujo. Centrifugar a 750 x g durante 5 minutos.
11. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 100 μl de tampón de tinción de citometría de flujo. Añadir 1 μl de bloqueo anticuerpo de anti-ratón CD16/32 Fc a cada tubo. Incubar en hielo durante 5 minutos.
12. Sin lavar, añadir 2 μl de anti-ratón FITC F4/80 o 1 μl de anticuerpo de CD11b de anti-ratón APC a los tubos "manchados" y una cantidad similar de los anticuerpos de control isotipo correspondiente a los tubos "isotipo". Incubar en hielo, en la oscuridad, durante 30 minutos.
13. Lavar las células añadiendo 2 mL de PBS directamente a las células. Centrifugar a 750 x g durante 5 minutos.
14. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 150 μL de PBS.
15. Adquirir las muestras en un citómetro de flujo con una condición de parada de 100 μl o 10.000 eventos en la puerta de interés y asegurar que FSC, SSC, FL1 (anti-ratón FITC F4/80) o FL4 (APC anti-ratón CD11b) canales son seleccionados para que los parámetros a analizar.
16. Utilizando el software de citometría de flujo, abrir una parcela punto para FSC (en el eje x) vs SSC (en el eje y) y dibujar una puerta alrededor de las células de interés, excepto las células muertas y los desechos (las células muertas y los desechos son mucho menores que la población de la célula principal y aparecen en el Lowe ' s r a la izquierda del diagrama).
17. Compuerta en las células de interés, abrir una parcela de histograma con FL1 (anti-ratón FITC F4/80) o FL4 (APC anti-ratón CD11b) en el eje x.
18. Ejecutar el ejemplo "isotipo". Generar una puerta de marcador, por lo que la mayoría de eventos de "isotipo" muestra a la izquierda de la puerta (< 1% positivo). Aplicar esta plantilla en el archivo de la muestra teñida.
19. Ejecutar el ejemplo "manchado". Resultará exitosa generación de BMDMs en > 95% expresión de FITC anti-ratón F4/80 o APC anti-ratón CD11b (figura 1A), mientras que las condiciones de cultivo incorrecto pueden resultar en la generación óptima de macrófagos (figura 1B).
    Nota: Si genera BMDMs de múltiples genotipos, tome nota de la expresión de estos marcadores para cada lote de BMDM generado, en el caso de que esto puede ser motivo para excluir a una muestra de análisis cuando se evalúa la generación de ROS en respuesta a los estímulos.

3. reactivos y material de preparación para la medición de ROS

1. Reconstituir el reactivo de detección de estrés oxidativo liofilizado en 60 μL de DMF anhidra para rendir una solución 5 mM. Mezclar suavemente antes de usar.
   Nota: Se indica en el manual del kit de ROS-ID que la vida útil del reactivo reconstituido es cerca de 1 semana a-20 ° C. Alicuotar la reconstitución inmediatamente después reactivo en pequeños frascos resistente a la luz minimiza su oxidación y maximiza la vida útil a-20 ° C.
2. Reconstituir el reactivo de detección superóxido liofilizado en 60 μL de DMF anhidra para rendir una solución 5 mM. Mezclar suavemente antes de usar.
   PRECAUCIÓN: según lo indicado en el manual del kit, tratar ambos reactivos de detección como posibles mutágenos, manejar con cuidado y deseche adecuadamente.
3. Reconstituir el inductor ROS (piocianina) en 20 μl de DMF anhidra para obtener una solución madre de 50 mM.
4. Reconstituir el inhibidor de ROS (N-acetyl-L-cisteína) en 123 μl de agua desionizada para obtener una concentración stock de 0,5 M.
5. Etiqueta 5 mL redondo poliestireno tubos (tubos de citómetro de flujo) con los controles experimentales y condiciones. (Ver 4. Las condiciones analíticas y controles)
6. Preparar suero bajo DMEM (sin rojo de fenol) mediante la adición de 0.1% FBS a DMEM libre de rojo de fenol.
7. Alícuota del anticuerpo anti-BSA en pequeñas alícuotas (dependiendo del uso) y almacenar a-80 ° C.
8. Preparar la solución madre de 100 mg/mL de BSA en HBSS (Hanks equilibrada solución de sal) o PBS. Alícuota en 100 partes alícuotas μl y almacenar a-20 ° C.
9. Preparar una solución de 2 x de las sondas ROS (2 x solución de sonda): por cada 10 mL de suero baja DMEM, añadir 4 μL de reactivo de detección de estrés oxidativo (tinte verde) y 4 μL de reactivo de detección de superóxido (tinte naranja).
10. Preparar 2 soluciones de sonda que contiene sólo reactivo de detección de estrés oxidativo (2 x solución de sonda, verde solamente), o que contengan sólo superóxido reactivo de detección (2 x solución de sonda, sólo naranja). Preparar sólo la cantidad de reactivo necesario para el experimento y siempre preparar la solución de 2 x inmediatamente antes del uso.
    Nota: Para preparar volúmenes más pequeños de 2 x solución de detección, utilice un intermedio 1:10 dilución de los reactivos de detección de verde y naranja antes de la dilución final en DMEM. Por ejemplo, para preparar 1 mL de 2 x solución de detección, 1 μl de cada sonda diluir en 9 μl de DMEM (1:10 intermedio dilución). Diluya 4 μL de esta dilución en 1 mL de DMEM intermedio de 1:10.

4. Análisis de las condiciones y controles

1. Incluyen los siguientes controles experimentales para compensación de citometría de flujo para cada experimento:
   a) células sin manchas y sin estimular.
   b) células teñidas solo con el reactivo de detección de estrés oxidativo (verde reactivo) y trataron con inductor ROS.
   c) células teñidas solo con el reactivo de detección de superóxido (naranja reactivo) y trataron con inductor ROS.
2. Por cada ratón o repetición biológica, incluyen las siguientes 6 condiciones:
   un) sin manchas y sin estimular las células
   b) las células manchas y sin estimular
   las células c) manchado tratan con inductor positivo
   d) células tratadas con positivo inductor e inhibidor de la ROS
   e) células activadas mediante Cross-linking FcγR
   f) células activación mediante Cross-linking FcγR y trataron con un inhibidor de la ROS
3. Calcular la cantidad de 2 x solución de sonda necesitada basada en el número de ratones y de las condiciones (200 μL de la 2 x solución de sonda se utilizará para cada condición que requiere la coloración).
   Nota: Para un ensayo con 6 ratones, se necesitarán 5 condiciones que requieren tinción con las sondas por ratón. Esto eleva el número total de condiciones a 30. Así, la cantidad total de solución de sonda x 2 necesaria es por lo menos 6 mL (30 * 200 μL).

5. preparación de la célula

1. Después de cebar los macrófagos durante la noche, aspirar el sobrenadante. Lavar las células una vez con PBS.
2. Suero de hambre las células mediante la sustitución de los medios de comunicación con el mismo volumen de suero baja DMEM. Para cada ratón, una placa será tratada con anti-BSA IgG₁ mientras suero de hambre, mientras que la otra será dejada sin tratamiento. Añadir sólo bajo del suero DMEM a placas sin tratar. Añadir el suero bajo DMEM que contenía 2,5 μg/mL de de IgG murino anti-BSA₁ a las placas tratadas.
   Nota: Una placa sin tratamiento adicional es necesario para cada experimento para los controles de compensación de citometría de flujo.
3. Incubar las placas durante 4 h a 37 ° C, 5% CO₂.
4. Después suero pasando hambre, cosechar las células por raspado suave o mediante el uso de 0,2 mM de EDTA en PBS. Recoger en etiquetado 5 mL fondo tubos redondos y centrífuga en 750 x g por 5 min hacer un seguimiento de que las células fueron tratadas con murino anti-BSA IgG₁.
5. Lavar el pellet de células una vez con 2 mL de PBS para deshacerse de cualquier anti-BSA residual de las células tratadas.
6. Resuspender el precipitado de células en 600 μl de DMEM baja del suero.
7. De la suspensión de células 600 μl, alícuotas de 200 μL en lo 5 mL etiquetada redondos tubos como sigue:
   1. De las células sin tratar, tomar 200 μL para tubos etiquetados "sin estimular", 200 μL para tubos etiquetados "positivo inductor del" y 200 μL para tubos etiquetados "inductor positivo + inhibidor"
   2. De IgG anti-BSA₁ células tratadas, tomar 200 μL para tubos etiquetados "FcγR reticulación/FcγR XL" y 200 μL de los tubos etiquetados "FcγR XL + inhibidor"
   3. De las células no tratadas para controles de compensación, tomar 200 μL para el tubo etiquetado "sin mancha sin estimular", 200 μL para la «verde + inductor» control y 200 μL de "naranja + inductor" de control.
      Nota: Si las células de 5.7.1 y 5.7.3 se derivan en el mismo ratón, las células del mismo "sin mancha sin estimular" pueden utilizarse para el control experimental y compensación. Si no, se necesitará un adicional 200 μL de células para un control experimental "mancha sin estimular" para una).
8. Mantenga los tubos en hielo hasta que la coloración y la estimulación. Durante hambre de suero y atascamiento de IgG_1, preparar las sondas, estímulos específicos y los inductores como se indica a continuación.
   Nota: Si se realiza el análisis para la primera vez, si no está disponible ninguna plantilla o ninguna indemnización después de los hechos está disponible en el citómetro de flujo y el software correspondiente, estimular y controles de compensación de la mancha y ejecutar en el citómetro de flujo para llevar a cabo compensación manual antes además de estímulos para muestras experimentales.

6. realizar el análisis

1. Preparar 2 x solución positiva inductor diluyendo la piocianina 1: 100 en el 2 x sonda solución (preparada en el paso 3.9) para obtener una concentración de 2 x de 500 μm de piocianina (concentración final será de 250 μm). También, diluya 1: 100 de piocianina en cada uno de los "2 x solución de sonda, verde sólo" y "solución de sonda x 2, naranja sólo" preparado en 3.10.
   Nota: Ambas condiciones con "inductor positivo" y "inductor positivo + inhibidor" se tratarán con el inductor positivo. Planificar en el cálculo de la cantidad de 2 x solución de inductor positivo preparar. Por ejemplo: si se realiza el ensayo con 3 ratones, 6 condiciones (3 * 2) serán tratados con inductor positivo, así que prepárate 6 * 200 μL = 1,2 mL de 2 x solución inductor positivo.
2. Preparar un 2 x solución de BSA diluyendo la solución madre de BSA en 2 x solución de sonda para obtener una concentración de 2 μg/mL (concentración final será 1 μg/mL).
   Nota: Ambas condiciones con "FcγR XL" y "FcγR XL + inhibidor" serán tratados con el 2 x solución de BSA. Planificar en el cálculo de la cantidad de solución a preparar. Por ejemplo: Si realiza el ensayo con ratones de 3, 6 (3 * 2) será necesario 1,2 mL de 2 x solución de BSA o condiciones serán tratadas con la solución de BSA y tan 6 * 200 μl.
3. Antes de iniciar la estimulación específica (FcγR reticulación), asegúrese de que todos los reactivos y las células están listas. Coloque los tubos en hielo en el orden que será estimulados.
4. Citómetros de flujo con un muestreador automático, tome nota del tiempo que tarda el citómetro para analizar una muestra y pasar a la siguiente, incluyendo cualquier mezcla y sonda de lavado pasos (por ejemplo 3,5 min).
   Nota: La sincronización es muy importante para este análisis. En orden para cada condición de ser bien controladas, la estimulación debe realizarse en el momento exacto (30 min) para cada condición. Estimular las células en orden e incorporar el tiempo entre la adquisición de la muestra por el citómetro de flujo. Por ejemplo, si el tiempo necesario para que el citómetro analizar una muestra y pasar a la siguiente es 3,5 min, estimular las células en el orden en que se analizará cada 3,5 minutos.
5. En caso de compensación manual en este punto, estimular tubos de control para la compensación (paso 5.7.3). Añadir 200 μL de 2 x solución de sonda, verde del"solamente" que contiene el inductor (de 6.1) en los tubos marcados "verde + inductor" (paso 5.7.3). Añadir 200 μL de "2 x solución de sonda, sólo orange" que contiene el inductor (paso 6.1) en los tubos marcados "naranja + inductor" (paso 5.7.3).
6. Incube las células por 30 min a 37 ° C, 5% CO₂ en oscuridad.
7. El software de citometría de flujo, generar etiqueta 3 archivos de ejemplo para el control "sin mancha, no se trata", "verde + inductor" y "naranja + inductor" muestras, asegurándose de indicar los canales/parámetros a ser analizados (FSC SSC, FL1, FL2) y desea parar condiciones (100 μl, 3 min, etcetera). Generar y etiquetar un conjunto similar de archivos de muestras experimentales.
8. Ejecutar el ejemplo "sin manchas, sin tratar". Abrir una parcela punto para FSC (en el eje x) vs SSC (en el eje y) y dibujar una puerta alrededor de las células de interés, excepto las células muertas y los desechos (las células muertas y los desechos son mucho menores que la población de la célula principal y aparecen en la parte inferior izquierda de la trama).
9. Con esta puerta de "células", abra otra trama de punto de FL1 (eje x) vs FL2 (eje y). Dibujar una puerta cuadrante inicial. Ajuste las puertas de cuadrante para que los eventos aparecen en el cuadrante izquierdo inferior de la parcela de vs FL2 FL1.
10. Ejecutar la muestra "verde + inductor". Ajustar la tensión de modo que los acontecimientos aparecen en los cuadrantes inferiores izquierdos y derecho de la parcela de vs FL2 FL1. Esta matriz de compensación se aplican a todos los archivos de muestra 3.
11. Ejecutar el ejemplo "naranja + inductor". Ajustar la tensión para que los eventos aparezcan en la parte superior e inferior izquierda cuadrantes del diagrama vs FL2 FL1. Esta matriz de compensación se aplican a todos los archivos de muestra 3.
12. Verificar cada archivo de compensación y eventos "sin mancha, no se trata" aparecen en el cuadrante izquierdo más bajo, "verde + inductor" eventos aparecen en los cuadrantes inferiores izquierdos y derecho, y "naranja + inductor" eventos aparecen en la parte superior e inferior izquierda cuadrantes del vs FL1 Parcela de FL2. Aplicar la matriz de compensación para todos los archivos de muestra experimental.
    1. Asegúrese de que una compensación adecuada se aplica a todos los archivos de muestra de control antes de aplicar la matriz de compensación a todos los archivos de muestra experimental. Consulte la figura 2 para datos representativos mostrando no compensada y muestras correctamente compensadas.
       Nota: Muchos citómetros designan FL1 como el estándar FITC/GFP (excitado por el láser azul 488 y detectados con un sistema de filtro 530/30) y FL2 como el canal estándar de PE (excitado por el láser azul 488 y detectados con un sistema de filtro de 585/40). Utilizamos esta misma Convención pero usuarios de citometría de flujo nuevo PRECAUCIÓN consultar con su administrador de base citometría de flujo para asegurar que su citómetro está configurado de manera similar y que los canales adecuados se utilizan para detectar estas puntas de prueba. Dependiendo del modelo de citómetro de flujo y que acompaña el software, es posible realizar la compensación antes o después de las muestras han sido adquiridas. Si es posible una compensación después de los hechos, el paso de compensación puede realizarse después de las muestras experimentales han sido adquiridas por el citómetro. Para citómetros con un rango dinámico, donde no se necesitan ajustes de voltaje PMT, un experimento de compensación también se puede realizar en un día separado y puede guardar la plantilla experimental (incluyendo la matriz de compensación) para reducir el tiempo necesitado para realizar compensación manual.
13. Una vez se ha realizado la compensación manual y se obtiene una plantilla experimental, iniciar el tratamiento de las muestras experimentales. Antes de tratar con inductor positivo o estímulo de célula FcγR, marca que tubos Haz inhibidor de ROS. Tratamiento de estas células con el ROS inhibidor por lo menos 30 min antes de inductor positivo o estímulo FcγR.
14. Para añadir el inhibidor ROS, preparar una concentración final de 5 mM por agregar 1 μl de inhibidor de la a 200 μL de células resuspendidas (sin anti-BSA IgG₁).
15. Tratar las células con el estímulo (o inductor positivo) y las células de carga con las sondas ROS como sigue:
    1. Sin estimular células: Añadir 200 μL de 2 x solución de sonda sin ningún estímulo a 200 μL de suspensión celular etiquetado "manchadas, sin estimular".
    2. Para los controles positivos: Añadir 200 μL de 2 x positivo inductor solución (preparada en el paso 6.1) a 200 μL de suspensión celular etiquetados "inductor positivo" o "inductor positivo + inhibidor".
    3. Para las células estimuladas por FcγR Cross-linking (estímulo específico): Añadir 200 μL de 2 x solución de BSA (preparada en 6.2) a 200 μL de suspensión celular con "Fcγr XL" o "FcγR XL + inhibidor".
       Nota: No olvide incorporar el tiempo entre el análisis de la muestra mediante la adición de estímulos cada minuto x donde x es el tiempo entre la adquisición de una muestra y la siguiente.
16. Incube las células por 30 min a 37 ° C, 5% CO₂ en oscuridad. Analizar las muestras en el orden en que fueron estimulados con un citómetro de flujo equipado con un automuestreador. Utilice las plantillas de análisis generadas en los pasos de compensación inicial. No lave las células antes del análisis.

7. resultados esperados y análisis de datos de citometría de flujo

1. Dentro del software de citometría de flujo, abra los archivos de análisis previamente generado para las muestras experimentales (plantillas fueron generadas en los pasos 6,7-6.12 y las muestras se corrieron en paso 6.16). Asegúrese de que la matriz de compensación realizar compensación manual fue correctamente aplicada a las muestras experimentales.
   Nota: Citómetros de flujo y flujo cytometry software capaz de compensación después de los hechos, si la matriz de compensación no se aplicó anteriormente a los archivos de ejemplo experimental, aplicarlo en este momento.
2. Similar a la verificación de la correcta compensación manual, asegúrese de que los controles de las muestras experimentales se comportan como se esperaba.
   1. Asegurar que los acontecimientos "sin manchas, sin tratar" aparecerán en el cuadrante izquierdo inferior de la parcela de FL2 vs FL1, que los eventos de "inductor positivo" presentan mayor fluorescencia en la parte superior izquierda, superior derecha y bajan cuadrantes derecho de la trama de FL2 FL1 vs y que" positivo inductor + inhibidor de ROS"eventos muestran una reducción de la fluorescencia en la parte superior izquierda, superior derecha y bajar cuadrantes derecho del vs FL1, FL2 trama en comparación con la fluorescencia observada con la muestra"inductor positivo".
   2. Si los controles en las muestras experimentales no muestran ningún aumento de la fluorescencia, compruebe que se realizaron todos los pasos de análisis, verificar la adecuada generación y cebado de macrófagos derivados de médula ósea (2.7-2.19) y repetir el experimento. Si los controles en las muestras experimentales muestran las tendencias esperadas, proceder a analizar las muestras experimentales estimulada a través de FcγR (Figura 3A).
3. Verificar que el estímulo específico FcγR está funcionando apropiadamente. Ejecutar los ejemplos siguientes de un ratón C57BL/6J WT: "sin mancha, sin estimular", "manchado, sin estimular", "manchado, estimulado a través del FcγR", y "teñido, estimulado a través del FcγR + ROS inhibidor". Corresponden a muestras 4.2a, 4.2b, 4.2e y 4.2f en la sección 4, respectivamente.
   1. Asegurar que los acontecimientos "sin mancha, sin estimular" aparecerán en el cuadrante izquierdo inferior de la parcela de vs FL2 FL1, que eventos "manchado, sin estimular" también aparecerán en el cuadrante izquierdo inferior de la parcela de vs FL2 FL1, que eventos "manchado, estimulado a través del FcγR" presentan mayor fluorescencia en la parte superior izquierda, superior derecha y bajar cuadrantes derecho de la parcela de vs FL2 FL1 y que "manchado, estimulado a través del FcγR + ROS inhibidor" eventos mostrará disminución de fluorescencia en la parte superior izquierda, arriba a la derecha y abajo a la derecha cuadrantes de la trama de FL2 vs FL1 en comparación con la muestra "manchadas, estimulado a través del FcγR" (Figura 3A).
   2. Si estas expectativas no se cumplen, por ejemplo, el "manchado, estimulado a través del FcγR" muestra mínima o ninguna fluorescencia creciente en comparación con la muestra "manchadas, sin estimular", o la muestra "manchadas, sin estimular" ya muestra marcado aumento de los niveles de fluorescencia en comparación con la muestra "sin manchas, sin estimular", compruebe que todos los pasos de análisis se realizaron correctamente, verificar la apropiada generación, cebado y manejo de BMDMs (2.7-2.19) y repetir el experimento. Si se cumplen estas expectativas, proceder al análisis del resto de las muestras experimentales.
      Nota: Las células de producción de ROS que reaccionan con la sonda verde (peróxido de hidrógeno, peroxinitrito, radicales hidroxilo, óxido nítrico, radicales Peroxoborato, etc.) aparecen en la parte superior derecha e inferior derecha cuadrantes de un registro FL1 (eje x) versus un registro FL2 trama de punto (eje y). Células productoras de ROS que reaccionan con la sonda naranja (principalmente pero no exclusivamente superóxido) aparecerán en los dos superiores cuadrantes de un registro FL1 (eje x) versus un registro FL2 trama de punto (eje y).
4. Generar histogramas individuales, gated en las células de interés, para el análisis de fluorescencia FL1 y FL2. Utilizando las muestras "sin manchas, sin estimular", generar un marcador histograma tal que todos los eventos "sin manchas, sin estimular" aparecen a la izquierda de este marcador. Este terreno se aplican con el marcador para el resto de las muestras experimentales (figura 3B).
5. Presentar los resultados del experimento como el porcentaje de las células positivas para cada una de las sondas ROS o demostrando la intensidad de fluorescencia media (IFM) de las muestras estimuladas versus control (figura 3).

8. superficie de la célula coloración en combinación con análisis cytometric del flujo de producción de ROS (opcional)

Nota: Este paso proporciona un protocolo para la tinción de macrófagos con un marcador de superficie de la célula antes de la estimulación de la medición FcγR y ROS. Esto puede ser útil para evaluar la producción de ROS en las poblaciones de mezclado de la célula. Es importante elegir un anticuerpo marcador superficial macrófago conjugado con un fluor apropiado que no interfiera con la fluorescencia de los reactivos de detección de estrés o superóxido oxidativos. En este protocolo, se utiliza un anticuerpo de ratón que F4/80 conjugado a Alexa fluor 647.

1. Generar BMDMs, cosecha y prime ellos como descrito anteriormente (secciones 1 y 2).
   Nota: Se necesita un mínimo de tres placas de 6 cm con el fin de realizar todos los controles experimentales y condiciones como se describe a continuación. Una placa se tratarán con anti-BSA IgG₁ mientras que el suero de hambre mientras que las otras dos placas se quedarán sin tratamiento.
   1. Incluye 4 Controles experimentales que se utilizará para la compensación de citometría de flujo (por experiencia):
      a) células sin manchas y sin estimular.
      b) las células de tratan con el reactivo de detección de estrés oxidativo (reactivo verde) y el inductor ROS.
      c) las células tratan con el superóxido detección reactivo (reactivo de naranja) y el inductor ROS.
      d) células teñidas solo con anti-ratón conjugado Alexa 647 F4/80.
   2. Por cada ratón o repetición biológica, incluyen las siguientes 3 condiciones:
      a) teñidos con F4/80 y a la izquierda sin estimular
      b) teñidos con F4/80 y activado a través del FcγR
      c) teñidos con F4/80 y activado a través del FcγR y tratado con un inhibidor de la ROS
2. Después de cebar los macrófagos durante la noche, aspirar el sobrenadante. Lavar las células una vez con 1-2 mL de PBS. Suero de hambre las células mediante la sustitución de los medios de comunicación con el mismo volumen de suero baja DMEM. Para cada ratón, una placa será tratada con anti-BSA IgG₁ mientras suero de hambre, mientras que las otras dos placas que se atiende. Incubar las placas durante 4 h a 37 ° C, 5% CO₂.
3. Después suero pasando hambre, cosechar las células por raspado suave o mediante el uso de 0,2 mM de EDTA en PBS. Recoger cada placa en etiquetado 5 mL alrededor de tubos y centrifugar a 750 x g por 5 min hacer un seguimiento de que las células fueron tratados con murino anti-BSA IgG₁.
4. Lavar el pellet de células una vez con 1-2 mL de PBS para deshacerse de cualquier anti-BSA residual de las células tratadas.
5. Suspender uno de los pellets de células de la placa que no consiguió en 600 μl de DMEM bajos del suero de IgG anti-BSA₁ . Estas células a no ser sometido a tinción de superficie celular. Utilizar estos controles de compensación. Alícuota 200 μL de esta suspensión celular en (3) 5 mL redondo inferior Tubos etiquetados estrés oxidativo un) sin manchas, sin estimular b) verde reactivo, reactivo de detección superóxido c) naranja + inductor ROS, inductor ROS.
6. Resuspenda cuidadosamente uno de la célula de las pelotillas de la placa que no consiguieron anti-BSA IgG_1, en 300 μL de tampón de tinción de citometría de flujo (PBS + 0.1% FBS). Alícuota de 100 μl de esta suspensión celular en (2) alrededor de 5 mL tubos para tinción con anti-ratón Alexa 647 F4/80.
7. Resuspender el pellet celular de la placa que recibió de IgG anti-BSA₁ en 300 μL de tampón tinción de citometría de flujo. Alícuota de 100 μl de esta suspensión celular en (2) alrededor de 5 mL tubos para tinción con anti-ratón Alexa 647 F4/80.
8. Las células, que eran alícuotas en 8.6 y 8.7, con 5 μl de anti-ratón Alexa 647 F4/80 por 30 min en hielo, en la oscuridad de la mancha.
9. Después de la tinción, las células de lavado agregando 2 mL de PBS y centrifugue a 750 x g, aspirar el sobrenadante y resuspender cada tubo en 200 μL de suero bajo DMEM sin rojo de fenol. Dejar de lado un tubo sin tratar para servir como control de FL4 solo manchada. Preparar sondas, inductor, FcγR estímulo e ROS inhibidores como se indica en las secciones 3.9, 3.10, 6.1, 6.2 y 6.14.
   1. Para las células no reciben anti-BSA IgG₁, etiqueta los tubos con las siguientes: a) ningún estímulo o inductor b) ROS.
   2. Para las células que recibieron anti-BSA IgG₁, la etiqueta con los siguientes: a) XL Fc o Fc b) XL + inhibidor.
10. Estimular las muestras a ser utilizado para la compensación de acuerdo con sus respectivos tratamientos como se indica en 6.5-6.6, en el orden en que se leerá en el citómetro de flujo, incorporando el tiempo entre la adquisición de una muestra y la siguiente.
11. Incube las células por 30 min a 37 ° C, 5% CO₂ en oscuridad. Analizar las muestras en el orden en que fueron estimulados con un citómetro de flujo equipado con un automuestreador.
12. Realizar compensación manual como se describe en 6.7-6.12 y análisis de datos como se describe en la sección 7.
13. Utilizando el software de citometría de flujo, generar y 4 archivos de muestra para el control de la etiqueta "sin mancha, no se trata", «verde + inductor», «naranja + inductor» y «F4/80 manchado» muestras, asegurándose de indicar los canales/parámetros a ser analizados (FSC SSC, FL1, FL2, FL4) y las condiciones de parada deseado (100 μl, 3 min, etcetera).
14. Ejecutar los ejemplos y generar diagramas de punto para realizar la compensación manual.
    1. Para la tinción de superficie celular, generar dos parcelas adicionales: FL1 (eje x) vs FL4 (eje y) y FL2 (eje x) vs FL4 (eje y). Ajustar la tensión para garantizar que la indemnización correspondiente se aplica como se muestra en la Figura 7A. Una vez que todas las compensaciones se ha realizado correctamente, aplicar la matriz de compensación para todos los archivos de muestra experimental.
15. Una vez se ha realizado la compensación manual y se obtiene una plantilla experimental, iniciar el tratamiento de las muestras experimentales como se indica en 6.13 6.15.3 y adquirir muestras en un citómetro de flujo, como se describe en 6.16.

Resultados

Utilizando el protocolo descrito dentro, presentamos datos representativos mostrando detección cytometric del flujo de producción de ROS resultantes de la estimulación de WT C57BL/6J BMDMs a través del FcγR. Como se esperaba, observamos cambios mínimos en la fluorescencia FL1 o FL2 por encima de los niveles de fondo en las células sin estimular (Figura 3A, Comparar "manchadas, sin estimular" vs "sin manchas, sin estimular" punto parcelas). Observamos un marcado aumento en fluorescenci...

Discusión

DCFH₂-DA y detección basada en DHE de ROS es una técnica ampliamente utilizada^14,15. Facilidad de uso y la adaptabilidad de estas sondas ROS para microplacas cinética formatos, análisis de fluorescencia microscopía o flujo cytometric ha contribuido a su popularidad. Sin embargo, en nuestros estudios de las funciones de macrófagos mediada por FcγR, no parecía ser un protocolo estándar para la realización de este ensayo para el análisis cytome...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-BSA IgG1	Innovative Research	IBSA9E2C2
Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400626
Anti-mouse CD16/32	BioLegend	101302
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647	BD Biosciences	565853
Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC	BioLegend	123108
Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647	BioLegend	101218
beta-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M3148-100ml
Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV	Fisher	BP1600-100
C57BL/6J	Jackson labs	Stock No.000664
CM-H2DCFDA	Molecular Probes	C6827	Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit
Dihydroethidium (DHE)	Molecular Probes	D11347	Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit
DMEM 1x	Corning	10-013-CV
DMEM no phenol red	Gibco	31053-028
DMF Anhydrous	Acros Organics	61094-1000
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	97068-085
FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400506
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
L glutamine	Gibco	25030-081
LADMAC cells	ATCC	CRL-2420
MEM	Corning	10-010-CV
mouse IFN-g	GoldBio	1360-06-100
N-Acetyl-L-cysteine	EMD Milipore	106425	Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit
Novocyte flow cytometer with autosampler	Acea	2060R
Pyocyanin (ROS inducer)	Cayman chemical	10009594	Can be a substitute for inducer in the Enzo kit
ROS-ID total ROS/superoxide detection kit	ENZO	ENZ-51010
Sodium pyruvate (100mM)	Gibco	11360-070
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056