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Resumen

Aquí se presentan los protocolos para la caracterización inmunohistoquímica y la localización del péptido de orexina, los receptores de orexina y los receptores endocannabinoides en el intestino y los cerebros de los modelos de pez cebra adultos normales e inducidos por la dieta (DIO) utilizando modelos de pez cebra adultos que utilizan modelos de pez cebra adultos que utilizan modelos de pez cebra adultos que utilizan modelos de pez cebra adultos que utilizan modelos de pez cebra adultos normales e inducidos por la dieta (DIO) utilizando modelos de pez cebra adulto sin métodos de inmunoperixidasa y doble inmunofluorescencia.

Resumen

La inmunohistoquímica (IHC) es una técnica altamente sensible y específica implicada en la detección de antígenos diana en secciones tisulares con anticuerpos etiquetados. Es un proceso de varios pasos en el que la optimización de cada paso es crucial para obtener la señal específica óptima. A través de IHC, se puede detectar la distribución y localización de biomarcadores específicos, revelando información sobre la conservación evolutiva. Además, iHC permite la comprensión de los cambios de expresión y distribución de biomarcadores en condiciones patológicas, como la obesidad. IHC, principalmente la técnica de inmunofluorescencia, se puede utilizar en peces cebra adultos para detectar la organización y distribución de moléculas filogenéticamente conservadas, pero un protocolo IHC estándar no es estasblished. Orexin y endocannabinoides son dos sistemas altamente conservados involucrados en el control de la ingesta de alimentos y la patología de la obesidad. Aquí se informan protocolos utilizados para obtener información sobre el péptido de orexina (OXA), el receptor de orexina (OX-2R) y la localización y distribución del receptor cannabinoide (CB1R) en el intestino y el cerebro de modelos de pez cebra adultos con efectos obesos normales e inducidos por la dieta (DIO). También se describen los métodos de inmunoperoxidasa y doble inmunofluorescencia, así como la preparación de reactivos, fijación, incrustación de parafina y crioprotección del tejido de peces cebra y preparación para un paso y antecedentes endógenos que bloquean la actividad Contratinción. El conjunto completo de parámetros se obtiene de experimentos anteriores de IHC, a través de los cuales hemos demostrado cómo la inmunofluorescencia puede ayudar con la comprensión de los QUIR, LA distribución, localización y conservación de la expresión de los ORX, OX-2R y CB1R en el pez cebra adulto Tejidos. Las imágenes resultantes con intensidad de señal muy específica llevaron a la confirmación de que el pez cebra son modelos animales adecuados para estudios inmunohistoquímicos de distribución, localización y conservación evolutiva de biomarcadores específicos en condiciones fisiológicas y patológicas. Los protocolos presentados aquí se recomiendan para experimentos IHC en peces cebra adultos.

Introducción

La inmunohistoquímica (IHC) es una técnica clásica bien establecida utilizada para identificar componentes celulares o tisulares (antígenos) por interacción antígeno-anticuerpo1,2. Se puede utilizar para identificar la localización y distribución de biomoléculas diana dentro de un tejido. IHC utiliza reacciones inmunológicas y químicas para detectar antígenos en las secciones3del tejido. Los principales marcadores utilizados para la visualización de interacciones antígeno-anticuerpos incluyen distículos fluorescentes (inmunofluorescencia)y reacciones de color enzima-sustrato (inmunoperoxidasa), ambos conjugados con anticuerpos 4. El uso de la observación microscópica es posible determinar la localización del tejido etiquetado, que corresponde aproximadamente a la localización del antígeno objetivo en el tejido.

Existen dos métodos para que las reacciones fluorescentes o cromogénicas detecten proteínas: el método de detección directa, en el que el anticuerpo primario específico se etiqueta directamente; y el método de detección indirecta, en el que el anticuerpo primario no se conjuga mientras que el anticuerpo secundario lleva la etiqueta5,6,7. El método indirecto tiene algunas ventajas, que es principalmente su amplificación de señal. Además, a diferencia de otras técnicas moleculares y celulares, con inmunofluorescencia, es posible visualizar ladistribución, localización y coexpresión de dos o más proteínas expresadas diferencialmente dentro de las células y tejidos 7. La elección del método de detección utilizado depende de los detalles experimentales.

Hasta la fecha, IHC es ampliamente utilizado en la investigación básica como una herramienta poderosa y esencial para entender la distribución y localización de biomarcadores y el perfilado general de diferentes proteínas en el tejido biológico desde el ser humano hasta los invertebrados8, 9 , 10 , 11. La técnica ayuda a mostrar un mapa de expresión proteica en un gran número de órganos animales normales y alterados y diferentes tipos de tejidos, mostrando una posible regulación hacia abajo o hacia arriba de la expresión inducida por cambios fisiológicos y patológicos. IHC es una técnica altamente sensible que requiere precisión y la elección correcta de métodos para obtener resultados óptimos12. En primer lugar, muchos factores diferentes como la fijación, la reactividad cruzada, la recuperación de antígenos y la sensibilidad de los anticuerpos pueden conducir a señales falsas positivas y falsas negativas13. La selección de los anticuerpos es uno de los pasos más importantes en IHC y depende de la especificidad del antígeno y su afinidad con la proteína y las especies bajo investigación7.

Recientemente, hemos optimizado la técnica IHC para detectar miembros de sistemas de orexina/hipocretina y endocannabinoides en el tejido adulto de pez cebra. Nos hemos centrado principalmente en la fijación, la integración de tejidos utilizando dos enfoques diferentes, la sección y el montaje (que pueden afectar la resolución y el detalle durante el análisis microscópico), y el bloqueo (para prevenir falsos positivos y reducir el fondo)14. Otras características importantes son la especificidad de anticuerpos y la selectividad y reproducibilidad de los protocolos IHC individuales. La clave para proporcionar especificidad de anticuerpos es el uso de controles negativos (incluyendo ningún anticuerpo primario o tejido que se sabe que no expresa las proteínas diana) así como controles positivos (incluyendo tejido que se sabe que expresa las proteínas diana)15 . La selección de anticuerpos para IHC se realiza en función de su especificidad de especie (la probabilidad con la que reaccionan con el antígeno de interés) y los sistemas de detección de unión antígeno-anticuerpo que se utiliza4,5,6 ,7. En el caso de la inmunoperoxidasa, el color de la reacción se determina mediante la selección del cromógeno precipitante, generalmente diaminobenzidina (marrón)16. Por otro lado, immunofluorescence utiliza anticuerpos conjugados con un fluoróforo para visualizar la expresión de proteínas en secciones de tejido congelado y permite un fácil análisis de múltiples proteínas con respecto al sistema de detección cromogénica 5 , 7.

En la técnica de la inmunoperoxidasa, el anticuerpo secundario se conjuga con la biotina, una molécula de vinculador capaz de reclutar una molécula de reportero cromogénico [complejo de biotina de avidina (ABC)], lo que conduce a la amplificación de la señal de tinción. Con el método de reportero ABC, la enzima peroxidasa reacciona con 3,3'-diaminobenzidina (DAB), produciendo una tinción intensamente de color marrón donde la enzima se une al anticuerpo secundario, que luego puede ser analizado con un microscopio de luz ordinario. La tinción ABC, debido a la alta afinidad de la avidina por la biotina, produce una reacción rápida y óptima, con pocos anticuerpos secundarios unidos al sitio de la reactividad primaria de anticuerpos. Este método de detección cromogénica permite el análisis densitométrico de la señal, proporcionando datos semicuantitativos basados en la correlación de los niveles de señal marrón con los niveles de expresión de proteínas18.

Con las técnicas de inmunofluorescencia, la detección simultánea de múltiples proteínas es posible debido a la capacidad de diferentes fluorocromos para emitir luz a longitudes de onda únicas, pero es importante elegir los fluorocromos cuidadosamente para minimizar la superposición espectral 5. Además, el uso de anticuerpos primarios en diferentes especies anfitrionas minimiza las dificultades relativas a la reactividad cruzada. En este caso, cada anticuerpo secundario específico de la especie reconoce sólo un tipo de anticuerpo primario. Los reporteros fluorescentes son moléculas orgánicas pequeñas, incluyendo derivados comerciales, como los tintes Alexa Fluor.

Muchos modelos animales se utilizan para entender condiciones fisiológicas y patológicas particulares. Hasta la fecha, se ha establecido que muchas vías metabólicas se conservan a lo largo de la evolución. Por lo tanto, los estudios de IHC en organismos modelo como el pez cebra pueden proporcionar información sobre la génesis y el mantenimiento de las condiciones patológicas y no patológicas17. El objetivo de este informe es ilustrar los protocolos IHC que se pueden realizar en el tejido adulto de pez cebra y utilizarse para obtener imágenes detalladas de la distribución y localización de OXA, OX-2R y CB1R a nivel periférico y central. También se informa nifiquen los protocolos para la aplicación de dos métodos indirectos principales de IHC en los tejidos periféricos y centrales del pez cebra adulto. Se describe el método indirecto, que permite la amplificación de la señal en los casos en que un anticuerpo secundario se conjuga con un tinte fluorescente (método de inmunofluorescencia) o un reportero enzimático (método de inmunoperoxidasa). Los métodos de detección cromogénicos y fluorescentes poseen ventajas y desventajas. En este protocolo se informa el uso de IHC, principalmente inmunofluorescencia, en el pez cebra adulto, un modelo animal ampliamente utilizado para estudiar sistemas que se conservan evolutivamente en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas.

Protocolo

1. Protocolo de inmunoperoxidasa

NOTA: El pez cebra fue obtenido por el Prof. Omid Safari (Departamento de Pesca, Facultad de Recursos Naturales y Medio Ambiente, Universidad Ferdowsi de Mashhad, Mashhad, Irán)10.

  1. Disección de tejidos
    1. Sacrificar el pez cebra por inmersión en agua helada (5 partes de hielo/1 parte de agua, 4 oC); dejarlos hasta el cese de todo movimiento para asegurar la muerte por hipoxia.
    2. Retire rápidamente el intestino y el cerebro con el siguiente método de disección:
      1. Seque el pescado sobre una toalla de papel y colóquelo sagitalmente sobre una estera de diseción, bloqueando la parte ventral de la cavidad ocular y la parte carnosa de la cola.
      2. Para el intestino: cortar la piel y retirar cuidadosamente la piel y el músculo subyacente del lado del pez hasta que los órganos internos sean visibles. Retire el intestino de la cavidad del cuerpo estirando.
      3. Para el cerebro: retire la cabeza con una cuchilla de afeitar. Retire el tejido blando del lado ventral del cráneo con fórceps. Abra el cráneo y retire el hueso del lado ventral del cerebro. Retire la piel y los huesos del cráneo del lado dorsal del cerebro. Quita el cerebro.
  2. Fijación de tejido
    1. Fijar los tejidos de dissección por inmersión en fresco 4% paraformaldeydo (PFA) en tampón de fosfato (PB, pH 7.4, 4 oC) durante 3 h a temperatura ambiente (RT).
      1. Preparar 0,1 M PB disolviendo 1,755 g de NaH2PO4H2O y 4,575 g de Na2HPO4 en 450 ml de agua destilada (dH2O), y ajustar a un pH de 7,4 con la cantidad necesaria de NaOH 1N.
      2. Preparar 4% PFA disolviendo 4 g de PFA en 100 ml de 0,1 M PB (pH 7,4) mediante agitación en una placa de calor. Cuando se alcance una temperatura de 60 oC, agregue 2-4 gotas de NaOH 1N para obtener una solución clara. Izquierda PFA 4% en RT y controlar el pH . Ajuste el pH a 7.4.
        NOTA: La fijación de tejidos durante más de 4-6 h puede provocar una sobrefijación, que enmascara los antígenos, limitando la unión entre anticuerpos y epítopos. El tiempo de fijación depende del tamaño del tejido.
  3. Incorporación de tejidos
    1. Enjuagar los tejidos 5 veces durante 5 min cada uno, por inmersión en 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Deshidratar los tejidos por inmersión posterior en alcohol 70% (6 min), 80% (6 min), 95% (5 min), 95% (5 min), 100% (1 min), y 100% (1 min).
    3. Aclarar los tejidos por inmersión en 100% alcohol:xileno (1:1) durante 10 min, luego 2x en xileno durante 5 min cada uno.
    4. Infiltrar los tejidos con cera de parafina (56 oC) dos veces durante 1 h cada uno por inmersión directa en parafina.
    5. Incruste los tejidos en bloques de parafina a temperatura ambiente (RT) y guárdelos en RT hasta el seccionamiento.
  4. Corte de tejidos
    1. Cortar los tejidos en secciones coronales o sagitales con 8 m de espesor con un microtome, y recoger las secciones en serie alternativa en diapositivas de vidrio adhesivo en el agua y calentado a 38 oC.
    2. Seque los portaobjetos con secciones a 37oC durante la noche.
  5. Desfinación y rehidratación de secciones tisulares
    1. Dewax las secciones por inmersión en xileno durante 5 min seguido de inmersión en xileno durante 3 min.
    2. Rehidratar las secciones por posterior inmersión de diapositivas en alcohol 100% II (1 min), 100% I (1 min), 95% (1 min), 75% (1 min), 50% (1 min), luego colocar los portaobjetos en dH2O (5 min).
      NOTA: Desparase completamente las secciones antes de iniciar la reacción. Si las secciones todavía tienen trazas de parafina, realice una inmersión adicional en xileno durante 5 minutos o más.
  6. Recuperación de antígenos
    1. Trate las secciones con tampón de citrato (0,01 M, pH 6,0) sumergiendo los portaobjetos en la solución y calentando en un horno microondas durante 5 minutos a máxima potencia.
    2. Deje que las secciones se enfríen.
    3. Repita el ciclo de 5 minutos en el microondas a la máxima potencia para completar la recuperación del antígeno.
      1. Preparar el tampón de citrato (0,01 M, pH 6,0) disolviendo 2,10 g de ácido cítrico en 100 ml de dH2O y 5,882 g de citrato de sodio en 200 ml de dH2O. Mezclar citrato de sodio (0,01 M) con ácido cítrico (0,01 M) a una proporción de 1:4 por volumen y ajustar el pH 6 usando HCl 0.1N.
  7. Bloqueo de la peroxidasa endógena
    1. Desmarca el área de tejido en las diapositivas con una pluma resistente a los disolventes.
    2. Enjuague las secciones 3 veces, 5 min cada una, con solución salina tris-buffered (TBS) (0,1 M, pH 7,3).
      1. Preparar 0,1 M TBS disolviendo 12,1 g de base trizma y 9 g de NaCl en 950 ml de dH2O y ajustar a pH 7.3 con HCl 0.1N.
    3. Bloquear la actividad endógena de la peroxidasa deslizando la inmersión en una solución de 0,75% H2O2 durante 5 min a RT.
      1. Preparar la solución de 0,75% H2O2 disolviendo 5 ml de 30% H2O2 en 195 ml de dH2O.
        NOTA: Las enzimas nógenas pueden reaccionar con los reactivos IHC y producir resultados falsos positivos. Por otra parte, los tejidos altamente vascularizados expresan muchas peroxidasas endógenas, lo que puede conducir a manchas inespecíficos intensos y niveles de fondo. El tratamiento con 0,75% H2O2 calma la peroxidasa endógena y reduce significativamente el fondo inespecífico.
  8. Bloqueo de inespecíficos bindi ng sitios y permeabilización de tejidos
    1. Incubar las secciones tisulares con el tampón de bloqueo TBS/0.4% Tritón (TBS-T), que contiene el antisuero primario (NRS), durante 30 minutos a RT para bloquear sitios de unión inespecíficos.
      1. Preparar 0.4% Tritón disolviendo 0.4 mL de Triton X-100 en 100 mL de TBS.
      2. Preparar la solución TBS-T del tampón de bloqueo disolviendo un 1% de suero normal en TBS que contenga 0,4% de Tritón X-100 (1 ml de suero normal + 8,2 ml de TBS + 0,8 ml de 0,48 tritón X-100).
        NOTA: Seleccione las especies del suero animal dependiendo del huésped del anticuerpo secundario (por ejemplo, cuando utilice un anticuerpo secundario anticonejo de cabra, utilice suero de cabra normal).
  9. Incubación de tejido con anticuerpo primario
    1. Incubar las secciones durante la noche en una caja húmeda a RT con anticuerpos primarios diluidos en TBS-T. Manchar las secciones con el siguiente anticuerpo primario:
      1. Anticuerpo de cabra contra OX-2R diluido 1:200, que reconoce el Terminal C de la proteína.
      2. Anticuerpo de cabra contra OX-A diluido 1:200 [orexin-A (C-19)], que reconoce el Terminal C de la proteína.
        NOTA: Asegúrese de que el anticuerpo primario reaccione con la biomolécula de interés. Definir con qué epítopo de la biomolécula reacciona el anticuerpo primario utilizando la alineación genética. Por ejemplo, el epítopo OX-A se ha mapeado entre el aa 50-100 de OX-A humano (O43612) mientras que el epítopo OX-2R se ha mapeado cerca de los últimos 50 aa en el Terminal C del humano.
  10. Incubación de tejido con anticuerpo secundario
    1. Enjuague las secciones 3x durante 5 min cada una, con 0,1 M TBS (pH 7,3).
    2. Incubar las secciones durante 1,5 h a RT con anticuerpo secundario biotinilado e inmunoglobulina anticabra de conejo (H+L) conjugada con biotina, luego diluir 1:100 en TBS-T.
      NOTA: Pruebe y encuentre las diferentes diluciones de anticuerpos primarios y secundarios para encontrar la dilución óptima que permita reducir el fondo.
  11. Reacción de peroxidasa
    1. Enjuague las secciones 3x durante 5 min cada una, con 0,1 M TBS (pH 7,3).
    2. Incubar las secciones con complejo de avidina-biotina (ABC) durante 1 h.
      1. Prepare la solución ABC añadiendo dos gotas del componente A seguidas de dos gotas del componente B en 5 ml de TBS.
    3. Enjuague las secciones 3x durante 5 min cada una, con 0,1 M TBS (pH 7,3).
    4. Tratar las secciones con el sustrato de cromógeno 3,3'-diaminobenzidina-4 (DAB).
      1. Preparar la solución DAB añadiendo una gota (aproximadamente 30 l) de concentrado de cromógeno DAB a 1 ml de diluyente DAB, y mezclar bien antes de usar.
        NOTA: Prepare la solución ABC al menos 30 minutos antes de su uso y mantenga el complejo a 4 oC hasta que se utilice para permitir una unión estable de avidina/biotina. Preparar la nueva solución de trabajo DAB, aplicar a las secciones de tejido, y desarrollar hasta que el color sea apropiado. Cuando la reacción cromogénica convierte los sitios del epítopo en un color marrón y la intensidad de la señal es adecuada para la toma de imágenes, continúe con el siguiente paso. El tiempo de desarrollo de DAB puede variar de unos segundos a 10 min. Para OX-A y OX-2R 1, 2 min es suficiente. Manipule DAB con cuidado, ya que es cancerígeno.
  12. Deshidratación y montaje de tejidos
    1. Enjuague todas las secciones 3x durante 5 min cada una, con 0,1 M TBS (pH 7.3) para detener la reacción DAB.
    2. Deshidratar las secciones por posteriorinmersión de diapositivas en alcohol 50% (2 min), 75% (2 min), 95% (2 min), 100% I (2 min), 100% II (2 min).
    3. Aclarar las rodajas por inmersión 2x en xileno 10 min cada uno.
    4. Monte las secciones con el montante DPX (dibutilo ftalato xileno) para histología, añadiendo dos gotas de medios de montaje a los portaobjetos y rematando lentamente con los labios de cubierta.
      NOTA: Dado que la inmersión del tejido en el aumento de las concentraciones de alcohol durante la deshidratación da como resultado la penetración alcohólica del tejido y la sustitución del agua por alcohol, determinar un tiempo de deshidratación preciso y no deshidratar en exceso los tejidos. Realizar la inmersión en xileno después de la deshidratación para aclarar el tejido y eliminar cualquier exceso o alcohol restante.
  13. Controles
    1. Repita las secciones 1.1–1.12, omitiendo el anticuerpo primario y/o sustituyendo el anticuerpo primario o el anticuerpo secundario IgG por TBS (controles negativos).
    2. Repita las secciones 1.1–1.12 preabsorbiendo cada anticuerpo primario con un exceso del péptido relativo (100 mg de péptido/1 ml de antisuero diluido).
    3. Repita las secciones 1.1–1.12 utilizando diferentes tejidos como control positivo (por ejemplo, tejido del ratón).
      NOTA: Prepare todos los búferes frescos, poco antes de empezar. Retire con cuidado el exceso de líquido en cada paso con una pipeta o papel de filtro alrededor de las secciones, manteniendo siempre las secciones húmedas.
  14. Adquisición y análisis de imágenes
    1. Adquiera imágenes digitales bajo una iluminación luminosa constante y con el mismo aumento utilizando un microscopio equipado con una cámara digital.
    2. Realizar un análisis semicuantitativo de la intensidad de las manchas utilizando un software de imágenes (ver Tabla de Materiales).
      1. Abra las imágenes capturadas, en formato de archivo .lif o .tiff, para evaluar índices de positividad OX-A o OX2-R.
      2. Seleccione el botón en Medir y haga clic en Recuento manual. Cuente el número de perfiles de celda manchados directamente desde la pantalla colocando una marca en celdas positivas haciendo clic con el ratón.
      3. Seleccione un área de región de interés (ROI) (3 x 103 m2) para cuantificar la densidad inmunoseñal (densidad óptica, DO).
      4. Determinar el píxel con la intensidad más alta (alta positiva) y la menor intensidad (negativa) dentro de la imagen analizada para asignar el cero como el valor del fondo (es decir, una porción de tejido desprovisto de células manchadas).
      5. Evalúe la DoC trabajando en una escala logarítmica de absorbancia. En el análisis de imágenes digitales, la intensidad de píxeles DAB oscila entre el tono más oscuro (0 valor) y el más claro (255 valores).
      6. Determine OD trazando un histograma de lo siguiente: log10(255/I), donde "I" es el valor de intensidad de píxel dado por el programa y determinado restando el fondo.
        NOTA: La reacción de inmunoperoxidasa permanente y estable se puede analizar bajo un microscopio de campo brillante en cualquier momento. Realice el recuento de celdas etiquetadas en la sección alternativa para evitar el doble recuento de la misma celda de secciones adyacentes.

2. Protocolo de inmunofluorescencia

  1. Disección de tejidos
    1. Sacrificar y diseccionar los animales como se describe en la sección 1.1.
  2. Fijación de tejido
    1. Fijar el intestino y el cerebro por inmersión durante 3 h en 4% PFA a 4 oC.
      1. Prepare PB y 4% PFA como en la sección 1.2.1.
        NOTA: El tiempo de fijación depende del tamaño del tejido. La fijación de tejido durante más de 4-6 h puede conducir a una sobrefijación, que enmascara los antígenos y limita la unión entre anticuerpos y epítopos.
  3. Incorporación de tejidos
    1. Enjuagar los tejidos 3 veces durante 5 min cada uno, con 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Para la crioprotección, transfiera los tejidos a una sacarosa del 20% en PB (0,1 M, pH 7,4) y manténgalos durante la noche a 4 oC. A continuación, transfiera los tejidos a 30% de sacarosa en 0,1 M PB (pH 7,4) y guárdelos durante una noche adicional a 4 oC.
    3. Incrustar los tejidos en un bloque de temperatura de corte óptima (OCT) compuesto. Para ello, preparar una pequeña dewar de nitrógeno líquido, tomar papel de aluminio, y cortar por la mitad para crear una sartén. La sartén que contiene los tejidos llenos con el compuesto OCT debe sumergirse en el nitrógeno líquido hasta que se enfríe el compuesto OCT. Los tejidos congelados se pueden almacenar a -80 oC hasta el ensección.
  4. Corte de tejidos
    1. Transfiera los bloques de tejido congelado a un criostato a -20 oC y corte en secciones coronales o sagitales de 10 m.
    2. Recoger los tejidos en secciones seriales alternativas en diapositivas de vidrio adhesivo adecuadas para la inmunohistoquímica y almacenarlos a -20 oC hasta su uso.
      NOTA: Almacene las diapositivas entre -20 oC y 4 oC en una caja de diapositivas oscura o en una libreta de diapositivas.
  5. Bloqueo de sitios de unión inespecíficos y permeabilizzación de tejidos
    1. Desmarca el área de tejido en el portaobjetos con una pluma resistente a disolventes.
    2. Enjuague las secciones 3x durante 5 min cada una, con 0,1 M PB (pH 7,4).
    3. Incubar las secciones con 1% de suero burro normal disuelto en el tampón de permeabilización PB-Triton X-100 0.3% (PB-T) durante 30 minutos a RT para permeabilizar la membrana celular y bloquear los sitios de unión inespecíficos.
      1. Preparar Triton X-100 0.3% disolviendo 0.3 mL de Triton X-100 en 100 mL de 0.1 M PB (pH 7.4).
      2. Preparar la solución de bloqueo disolviendo 1% de suero de burro normal en PB que contiene 0.3% TritonX-100.
        NOTA: Las especies animales del suero utilizado en los tampones de permeabilización y bloqueo dependen del huésped del anticuerpo secundario.
  6. Incubación con mezcla de anticuerpos primarios
    1. Enjuague las secciones 3x durante 5 min cada una, con 0,1 M PB (pH 7,4).
      1. Incubar las secciones durante la noche en una caja húmeda a RT con una mezcla de anticuerpos primarios diluidos en PB-T. Se pueden utilizar las siguientes mezclas de anticuerpos primarios: anticuerpo de cabra contra el anticuerpo DILUido OX-2R 1:100/conejo contra CB1R diluido 1:100, o anticuerpo de cabra contra el anticuerpo DILUido OX-A 1:100/conejo contra CB1R diluido 1:100.
  7. Incubación con mezcla de anticuerpos secundarios
    1. Enjuague las secciones 3x durante 5 min cada una, con 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Incubar las secciones durante 2 horas en RT con 1) una mezcla de anticuerpo secundario conjugado con jugando a La tecla burro Anticonejo Alexa Fluor 488 y anticuerpo secundario conjugado con el burro Alexa Fluor 594 diluido 1:100 en PB-T; o 2) una mezcla de anticuerpo secundario conjugado con jugando a Alexa Fluor 488 y anticuerpo secundario conjugado con jugando a La tecla burro anti-conejo Alexa Fluor 594 diluido 1:100 en PB-T.
      NOTA: Utilice anticuerpos secundarios desarrollados en el mismo huésped animal. El suero normal debe pertenecer a la misma especie del anticuerpo secundario (por ejemplo, utilizar anticuerpos secundarios desarrollados en burro y un suero normal de burro). Diluir los anticuerpos primarios y secundarios con tampón de bloqueo que contiene el detergente para aumentar la permeabilización celular y reducir el fondo.
  8. Montaje de tejido
    1. Enjuague las secciones 3x durante 5 min cada una, con 0,1 M PB (pH 7,4).
    2. Contravasina las secciones con tinte nuclear DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) preparado disolviendo 1,5 l de DAPI (1 mg/ml) en 3 ml de PB.
    3. Diapositivas de encubrimiento con medio de montaje (ver Tabla de Materiales). Este medio de montaje acuoso estabiliza la muestra de tejido y las manchas para su uso a largo plazo. Las muestras fluorescentes se pueden almacenar en la oscuridad a 4 oC. Para prolongar la vida útil de los fluoroforos, utilice un medio de montaje antialimentado.
      NOTA: Elija un buen medio de montaje. Uno de los parámetros más importantes de los agentes de montaje es el índice de refracción (nD), que debe ser alrededor de 1,5, el índice de refracción del vidrio. El medio de montaje utilizado aquí se puede utilizar especialmente con muestras preparadas para determinaciones de enzimas y lípidos (es decir, muestras que no deben deshidratarse con una serie ascendente de alcohol).
  9. Controles
    1. Repita las secciones 2.1–2.8, omitiendo el anticuerpo primario o secundario, o sustituyendo en el paso específico el antisuero primario o secundario por PB (control negativo).
    2. Repita las secciones 2.1–2.8, preabsorbiendo cada anticuerpo primario con un exceso del péptido relativo (100 mg de péptido/1 ml de antisuero diluido).
    3. Repita las secciones 2.1–2.8 en rebanadas de cerebro del ratón (control positivo).
      NOTA: Prepare todos los búferes frescos, poco antes de empezar. Retire el exceso de líquido cuidadosamente en cada paso con una pipeta o papel de filtro alrededor de las secciones, manteniendo siempre la sección húmeda.
  10. Adquisición de imágenes
    1. Utilice un microscopio confocal equipado con una etapa motorizada x-y-z, una cámara digital y un software de adquisición y análisis de imágenes como NIS-Elements C para observar y analizar las secciones inmunomanchadas. Adquiere imágenes digitales utilizando los objetivos 5-20-40x.
    2. Tomar las imágenes de cada sección con bajo aumento (objetivo 10x o 20x) en cada uno de los canales disponibles para componer un montaje de bajo aumento, proporcionando una visión general de toda la región para facilitar la localización y documentación de OX-2R/CB1R coexpresión anatómica. Normalice las imágenes de fluorescencia al máximo contraste y superposición antes del análisis.
    3. Recopile pilas En Z serie de imágenes en toda el área de interés. Adquiera las imágenes a través de seis planos focales (paso Z) con pasos focales de 1-1,8 m para cubrir el volumen de tejido en el que la coexpresión OX-2R/CB1R se visualiza como puncta amarilla. Para hacer esta colección para cada canal (rojo, verde, azul) por separado, mediante el uso de un microscopio motorizado Z.
    4. Utilice un software de desconvolución de imágenes para desconvenir imágenes mediante la aplicación de diez iteraciones y contraer las imágenes en serie Z en una sola imagen de proyección máxima.
    5. Ajuste las micrografías para la luz y el contraste con Adobe Photoshop 6.01 (Adobe Systems, San Jose, CA).
      NOTA: Realice el paso de desconvolución durante la observación para disminuir aún más el fondo. Limite la exposición de la diapositiva a la luz para evitar el fotoblanqueo.
  11. Análisis de imágenes
    1. Realizar un análisis cuantitativo de la coexpresión de OX-2R/CB1R en secciones alternadas de 10 m de espesor (n a 5 animales por grupo) cubriendo toda la región de interés de cada animal.
    2. Cuantifique la coexpresión OX-2R/CB1R como número de puncta positiva amarilla con un sistema semiautomático de análisis de imágenes. El software Imagins puede proporcionar un mayor nivel de detalle, con datos cuantitativos sobre las regiones de superposición entre diferentes sondas fluorescentes.
    3. Cuantifique el puncta utilizando herramientas de umbral para la intensidad de la señal en los dos canales. Abra el archivo de imágenes .liff, .tiff o .jpg y seleccione Imagen–Umbral. Seleccione Configuración automática o Método manual y regule Umbral hasta que se seleccione toda la puncta manchada. Analizar la distribución de las intensidades de píxeles en un área de la imagen que no contiene ningún objeto inmunoetiquetado para obtener el umbral de fondo. Determine este fondo individualmente para cada imagen. A continuación, el programa elimina el umbral de fondo estableciendo la línea base de las intensidades de píxeles en el valor de fondo.
    4. Seleccione Analizar–Medir y elija los parámetros a medir (puncta intensity-minimum, maximum and mean values; number/density of the immunolabelled puncta).
    5. Cuente la puncta amarilla a lo largo del volumen del tejido en 4 pilas Z para cada sección, utilizando las pilas inmediatamente por encima o por debajo del mejor plano de enfoque. Excluya las regiones desenfocadas del análisis.
      NOTA: Realice el recuento de celdas etiquetadas en la sección alternativa para evitar el recuento doble de las mismas celdas de secciones adyacentes.

Resultados

Los datos representativos de la tinción de la inmunoperoxidasa se muestran en la Figura 1 y la Figura 2. El análisis inmunohistoquímico de la distribución ox-A y OX-2R en el intestino del pez cebra adulto mostró diferentes sitios de localización de OX-A y OX-2R y sus aumentos en la expresión en las células intestinales del pez cebra DIO. Se observó una tinción marrón intensa para OX-A en las células del intestino medial y anterior (Figura

Discusión

Preparación de muestras

La preparación de muestras es el primer paso crítico en IHC. Un protocolo fiable permite el mantenimiento de la morfología celular, la arquitectura de los tejidos y la antigenicidad. Este paso requiere la correcta recolección de tejido, fijación y sección22,23. El propósito de la fijación es preservar el tejido y reducir la acción de las enzimas tisulares o microorganismos. En p...

Divulgaciones

Los autores no declaran conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por Fondi Ricerca di Ateneo (FRA)2015-2016, Universidad de Sannio.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti CB1Abcamab23703
Anti OX-2RSanta Cruzsc-8074
Anti-OXASanta Cruzsc8070
AquatexMerck1,085,620,050
Biotinylated rabbit anti-goatVector LabBA-5000
citric acidSigma Aldrich251275
Confocal microscopeNikonNikon Eclipse Ti2
CryostatLeica BiosystemCM3050S
DAPISigma Aldrich32670
Digital CameraLeica BiosystemDFC320
Digital Camera for confocal microscopeNikonDS-Qi2
Donkey anti goat Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodiesThermo FisherA11055
Donkey anti goat Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodiesThermo FisherA11058
Donkey anti rabbit Alexa fluor 488-conjugated secondary antibodiesThermo FisherA21206
Donkey anti rabbit Alexa fluor 594-conjugated secondary antibodiesThermo FisherA21207
Ethanol absoluteVWR20,821,330
Frozen section compoundLeica BiosystemFSC 22 Frozen Section Media
H2O2Sigma Aldrich31642
HClVWR20,252,290
ImmPACT DABVector labSK4105
MicroscopeLeica BiosystemDMI6000
MicrotomeLeica BiosystemRM2125RT
Na2HPO4Sigma AldrichS9763
NaClSigma AldrichS7653
NaH2PO4H2OSigma AldrichS9638
NaOHSigma AldrichS8045
Normal Donkey SerumSigma AldrichD9663
Normal Rabbit SerumVector labS-5000
paraffin waxCarlo Erba46793801
ParaphormaldeydeSigma AldrichP6148
sodium citrate dihydrateSigma AldrichW302600
Triton X-100Fluka Analytical93420
TrizmaSigma AldrichT1503
VectaStain Elite ABC KitVector labPK6100
Xylene PureCarlo Erba392603

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