Análisis citométrico de flujo de especies de oxígeno reactivo mitocondrial en células hematopoyéticas de la muriña y células progenitoras y leucemia impulsada por MLL-AF9

Resumen

Describimos un método para utilizar citometría de flujo multiparámetro para detectar especies de oxígeno reactivo mitocondrial (ROS) en células hematopoyéticas sanas murinas (HSCCP) y células de leucemia a partir de un modelo de ratón de leucemia mieloide aguda (LMA) impulsada por MLL-AF9.

Resumen

Presentamos un enfoque citométrico de flujo para analizar la ROS mitocondrial en varias poblaciones de células madre y progenitoras derivadas de médula ósea viva (BM) de ratones sanos, así como ratones con LMA impulsados por MLL-AF9. Específicamente, describimos un proceso de tinción celular de dos pasos, por el que las células BM sanas o leucemias se tiñen primero con un tinte fluorogénico que detecta superóxidos mitocondriales, seguido de la tinción con anticuerpos monoclonales vinculados al fluorocromo que se utilizan para distinguir varias poblaciones de progenitores hematopoyéticos sanos y malignos. También proporcionamos una estrategia para adquirir y analizar las muestras por citometría de flujo. Todo el protocolo se puede llevar a cabo en un período de tiempo tan corto como 3-4 h. También destacamos las variables clave a tener en cuenta, así como las ventajas y limitaciones de la monitorización de la producción de ROS en el compartimiento mitocondrial de las subpoblaciones de tallo y progenitores hematopoyéticos vivos y de leucemia utilizando colorantes fluorogénicos por citometría de flujo . Además, presentamos datos de que la abundancia de ROS mitocondrial varía entre subpoblaciones de HSPC sanas distintas y progenitores de leucemia y analizamos las posibles aplicaciones de esta técnica en la investigación hematológica.

Introducción

Las Especies Reactivas de Oxígeno (ROS) son moléculas altamente reactivas derivadas del oxígeno molecular. La ubicación celular más bien definida de la producción de ROS es las mitocondrias, donde los electrones que pasan a través de la cadena de transporte de electrones (ETC) durante la fosforilación oxidativa (OXPHOS) son absorbidos por el oxígeno molecular que conduce a la formación de un específico tipo de ROS llamado superóxidos¹. A través de las acciones de una serie de enzimas, llamadas dismutas de superóxido o SOD, los superóxidos se convierten en peróxidos de hidrógeno, que posteriormente son neutralizados en agua por enzimas como la catalasa o glutatión peroxidasas (GPX). Las perturbaciones en los mecanismos reguladores de ROS pueden conducir al exceso de producción de ROS, a menudo conocido como estrés oxidativo, que tienen consecuencias celulares dañinas y potencialmente letales como daño a macromoléculas (es decir, ADN, proteínas, lípidos). Además, el estrés oxidativo está relacionado con varias patologías, como diabetes, enfermedades inflamatorias, envejecimiento y tumores^2,3,4. Para mantener la homeostasis redox y prevenir el estrés oxidativo, las células poseen una variedad de mecanismos reguladores de ROS⁵.

Los niveles fisiológicos de ciertos ROS son necesarios para la hematopoyesis embrionica y adulta adecuada⁶. Sin embargo, el exceso de ROS se asocia con daño al ADN, diferenciación celular y agotamiento del tallo hematopoyético y la piscina de progenitoras. También hay evidencia de que las alteraciones en la biología redox pueden diferir entre la leucemia y las células sanas. Por ejemplo, los niveles de ROS tienden a ser más altos en las células de leucemia mieloide aguda (LMA) en relación con sus contrapartes sanas y otros estudios han sugerido que las células madre de la leucemia mantienen un bajo nivel de estado estacionario de ROS para la supervivencia^7,8. Es importante destacar que las estrategias para capitalizar terapéuticamente estas diferencias redox han demostrado ser prometedoras en varios entornos de cáncer humano^9,10. Por lo tanto, los ensayos que permiten la evaluación de los niveles de ROS en los modelos de ratón pueden mejorar nuestra comprensión de cómo estas especies contribuyen a la fisiología celular y la patogénesis de la enfermedad, así como potencialmente proporcionar una plataforma para evaluar la eficacia de nuevas terapias contra el cáncer dirigidas al redox.

Protocolo

Todos los procedimientos animales descritos en este protocolo han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal (IACUC) en Fox Chase Cancer Center.

NOTA: El flujo de trabajo del protocolo se divide en 4 partes como se presenta en la Figura 1 y los reactivos necesarios se enumeran en la Tabla de materiales.

1. Aislamiento de médula ósea (BM)

NOTA: Se generaron ratones de leucemia MLL-AF9 como se describió anteriormente¹¹.

1. Recuperar células de médula ósea mononuclear, como se describió anteriormente^12,13,14,15, de ratones salvajes tipo C57.Bl6 (que expresan el marcador congénico CD45.2) así como de C57. Ratones Bl6-SJL (que expresan el marcador congénico CD45.1) que han sido trasplantados con células de leucemia mLL-AF9 que expresan (CD45.2⁺).
   NOTA: BM se puede recuperar de ratones ya sea triturando^12,13 o mediante el lavado de huesos^14,15. Para los experimentos presentados aquí, BM se recuperó de ratones sanos y de leucemia a través del lavado.

2. Estaño de tinte fluorogénico ROS mitocondrial

1. Una vez que las células de médula ósea mononuclear es recuperadas de ratones sanos y/o leucemia, manchan una alícuota de células con Trypan Blue y cuentan usando un hemocitómetro para determinar el número inicial de células BM totales.
2. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en F-PBS (PBS complementado con 2% de suero bovino fetal y un cóctel de penicilina/estreptomicina al 1%) a una concentración de 2 x 10⁶ células/ml.
3. Aliquot 200 l de suspensión celular por tubo en 9 tubos de control monocolor etiquetados de la siguiente manera:
   Sin manchas, B220-Cy5-PE, cKit-Cy7-APC, Sca1-PacBlue, CD150-APC (solo para HSCCP sanos), CD45.2-APC (solo para células de leucemia), CD34-FITC, tinte ROS mitocondrial y mancha de células vivas/muertas.
   NOTA: (Opcional) Se puede preparar un control positivo para la inducción de ROS mitocondrial mediante el tratamiento de 2 x 10⁵ células en 200 ol con 20 m de bisulfito de sodio de menadiona (MSB) durante 1 h a 37 oC en una incubadora de CO₂ al 5%. Se puede preparar un segundo control para revertir la inducción mediada por MSB de ROS mitocondrial mediante el tratamiento de 2 x 10⁵ células en 200 oL con 20 m de MSB más 100 m de N-acetil-L-cisteína (NAC) durante 1 h a 37 oC en una incubadora de CO₂ al 5%.
4. Alícuota las células restantes en un tubo (tubo experimental) y centrífuga a 300 x g durante 5 min.
5. Resuspenda las células en F-PBS con una mancha de células vivas/muertas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Incubar sobre hielo durante 30 minutos. Asegúrese de añadir una mancha viva/muerta al tubo de control de un solo color.
6. Añadir 1,0 ml de temperatura ambiente (RT) F-PBS a tubos de un solo color y experimentales teñidos con el tinte vivo/muerto. Centrífuga 5 min a 300 x g en RT.
7. Resuspenda 50 g del tinte ROS mitocondrial en 13 sulfóxido de dimetil (DMSO) para obtener una solución de stock de 5 mM.
8. Diluir el tinte ROS mitocondrial a una concentración final de 5 m en RT F-PBS con o sin Verapamil (50 oM).
9. Aspirar el lavado de la mancha de células vivas/muertas. Añadir 200 l de mancha de tinte ROS mitocondrial que contiene Verapamil a cada tubo experimental, así como el tubo de control mitocondrial ROS de un solo color.
10. Vórtice para mezclar e incubar durante 10 min a 37oC en la oscuridad.
11. Añadir 1,0 ml de RT F-PBS al control mitocondrial de un solo color teñido de ROS y tubos experimentales. Centrífuga 5 min a 300 x g en RT.
12. Aspirar el sobrenadante y lavar las células con 1,0 ml adicionales de RT F-PBS. Centrífuga 5 min a 300 x g en RT.

3. Lineage Anticuerpo Staining

1. Preparar los cócteles de anticuerpos enumerados en la Tabla 1.
   NOTA: Estos cócteles antianticuerpos han sido optimizados anteriormente^14,15,16.
2. Aspirar el sobrenadante del lavado final de tinte ROS mitocondrial de los tubos experimentales que contienen BM saludable y añadir 200 l de cóctel de anticuerpos #1 a cada tubo. Vórtice para mezclar. También prepare los tubos de control de un solo color. Incubar durante 60 minutos sobre hielo en la oscuridad.
3. Aspirar el sobrenadante del lavado final de tinte ROS mitocondrial de los tubos experimentales que contienen leucemia BM y añadir 200 l del cóctel de anticuerpos #2 a cada tubo. Vórtice para mezclar. Incubar durante 60 minutos sobre hielo en la oscuridad.
4. Lavar con 1,0 ml de F-PBS frío y centrífuga 5 min a 300 x g a RT.
5. Resuspenda las células en 500 ml de F-PBS frío y filtre las células en un tubo de citómetro de flujo utilizando un filtro de 40 m para excluir agregados.

4. Adquisición y Análisis de Citometría de Flujo

NOTA: Varios subconjuntos hematopoyéticos del tallo y del progenitor son raros, como las células madre hematopoyéticas a largo plazo. Por lo tanto, idealmente se deben recolectar 3-5 millones de eventos para cada tubo experimental durante la adquisición de citometría de flujo para un análisis suficiente de ROS mitocondrial en los diversos subconjuntos de HSPC.

1. Utilice el tubo de control sin manchas para establecer las gráficas de dispersión hacia adelante (FSC-A) y lateral (SSC-A) en función del tamaño y la complejidad de la población celular analizada.
2. Utilice los tubos de control sin manchas y de un solo color para compensar el citómetro de flujo.
3. Salida de escombros extraños de la gráfica de dispersión hacia adelante y lateral(Figura 2A,B,primer panel desde la izquierda).
4. Salida de dobletes utilizando un doble discriminador como el discriminador hacia adelante(Figura 2A,B, segundo panel de la izquierda).
5. Siga la estrategia de gating propuesta en la Figura 2A,B para seleccionar células vivas, linaje de células bajas y los diversos subconjuntos de HSPC y leucemia.
6. Para cada población de interés, analice la intensidad media de fluorescencia (IMF) del canal TRPE (eje X) en una gráfica de histograma para evaluar las diferencias en la señal ROS mitocondrial(Figura 3A-C,paneles izquierdos). Los niveles de ROS mitocondrial se pueden evaluar a nivel de una sola célula comparando la tinción de ROS mitocondrial frente a marcadores de linaje específicos en una gráfica de dispersión.

Resultados

Presentado es un método para analizar la ROS en las mitocondrias de múltiples poblaciones de progenitores de leucemia sanas y mLL-AF9. La Figura 1 muestra una vista esquemática del flujo de trabajo del protocolo, que consta de 4 pasos principales: 1) aislamiento BM de ratones; 2) Manchación de células BM con un tinte fluorogénico que reconoce ROS mitocondrial, particularmente superóxidos; 3) Tinción de anticuerpos de marcador de superficie para delinear varias poblaciones hematopoyé...

Discusión

Los colorantes fluorogénicos que se han desarrollado para la detección de ROS se evalúan con frecuencia en células fijas mediante microscopía o en células vivas mediante citometría de flujo^22. La evaluación citométrica de flujo de ROS mitocondrial en células BM utilizando colorantes fluorogénicos MItocondrial es ROS tiene dos ventajas principales: 1) Es una técnica rápida y sencilla que es adecuada para el análisis de células vivas y 2) permite distinguir y analizar raras poblacione...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Heat inactivated FBS	VWR Seradigm LIFE SCIENCE	97068-085	Media
Penicillin Streptomycin	Corning	30-002-CI	Media
PBS	Fisher Scientific	BP399-20	Buffer
15 mL conical tube	BD falcon	352096	Tissue Culture Supplies
50 mL conical tube	BD falcon	352098	Tissue Culture Supplies
40 μm cell strainers	Fisher Scientific	22-363-547	Tissue Culture Supplies
RBC Lysis Buffer	Fisher Scientific	50-112-9751	Tissue Culture Supplies
Menadione sodium Bisulfite	Sigma aldrich	M5750	Pro-oxidant
NAC	Sigma aldrich	A7250	Anti-oxidant
CD3 PE-Cy5 clone 145-2c11	Biolegend	100310	Antibody
CD4 PE-Cy5 clone RM4-5	eBioscience	15-0041-81	Antibody
CD8 PE-Cy5 clone 53-6.7	eBioscience	15-0081-81	Antibody
CD19 PE-Cy5 clone 6D5	Biolegend	115510	Antibody
B220 PE-Cy5 clone RA3-6B2	Biolegend	103210	Antibody
Gr1 PE-Cy5 clone RB6-8C5	Biolegend	108410	Antibody
Ter119 PE-Cy5 clone Ter-119	Biolegend	116210	Antibody
CD48 PE-Cy5 clone HM48-1	Biolegend	103420	Antibody
CD117  APC-Cy7 clone 2B8	Biolegend	105825	Antibody
Sca1 peacific Blue clone D7	Biolegend	108120	Antibody
CD150 APC clone TC15-12F12.2	Biolegend	115909	Antibody
CD34 FITC clone RAM34	BD Bioscience	553733	Antibody
CD45.2 APC clone 104	Biolegend	1098313	Antibody
MitoSOX Red	ThermoFisher Scientific	M36008	Dye
Mitotracker Green	ThermoFisher Scientific	M7514	Dye
Live/dead Yellow Dye	ThermoFisher Scientific	L34967	Dye