Investigaciones electrofisiológicas de la función de sinapsis de retinogeniculato y corticogeniculato

Resumen

Aquí, presentamos protocolos para la preparación de rebanadas cerebrales agudas que contienen el núcleo de geniculado lateral y la investigación electrofisiológica de la función de sinapsis retinogénica y corticogénica. Este protocolo proporciona una manera eficiente de estudiar las sinapsis con la probabilidad de alta y baja liberación en las mismas rebanadas cerebrales agudas.

Resumen

El núcleo de geniculado lateral es la primera estación de relé para la información visual. Las neuronas de retransmisión de este núcleo talámico integran la entrada de las células ganglionares de la retina y la proyectan a la corteza visual. Además, las neuronas de relé reciben excitación de arriba hacia abajo de la corteza. Las dos entradas principales excitatorias a las neuronas de relé difieren en varios aspectos. Cada neurona de relé recibe la entrada de sólo unas pocas sinapsis retinogénicas, que son terminales grandes con muchos sitios de liberación. Esto se refleja en la excitación comparativamente fuerte, las neuronas de relé reciben, de las células ganglionarias de la retina. Las sinapsis corticogénicas, en cambio, son más simples con pocos sitios de liberación y una fuerza sináptica más débil. Las dos sinapsis también difieren en su plasticidad sináptica a corto plazo. Las sinapsis retinogénicas tienen una alta probabilidad de liberación y, en consecuencia, muestran una depresión a corto plazo. Por el contrario, las sinapsis corticogénicas tienen una baja probabilidad de liberación. Las fibras corticogénicas atraviesan los núcleos talámicos reticulares antes de entrar en el núcleo de geniculado lateral. Las diferentes ubicaciones del núcleo talámico reticular (rostrally del núcleo de geniculado lateral) y del tracto óptico (ventro-lateralmente desde el núcleo de geniculado lateral) permiten estimular las sinapsis corticogénica o retinogénicadas por separado con electrodos de estimulación extracelular. Esto hace que el núcleo de geniculado lateral sea un área cerebral ideal donde dos sinapsis excitatorias con propiedades muy diferentes que afectan al mismo tipo de célula, se pueden estudiar simultáneamente. Aquí, describimos un método para investigar la grabación de las neuronas de relé y para realizar un análisis detallado de la función de la sinapsis de retinogeniculato y corticogeniculato en rodajas cerebrales agudas. El artículo contiene un protocolo paso a paso para la generación de rebanadas cerebrales agudas del núcleo de geniculado lateral y pasos para registrar la actividad de las neuronas de relé estimulando el tracto óptico y las fibras corticogénicas por separado.

Introducción

Las neuronas de retransmisión del núcleo de geniculado lateral integran y transmiten información visual a la corteza visual. Estas neuronas reciben la entrada excitatoria de las células ganglioneras a través de sinapsis retinogénicas, que proporcionan el principal impulso excitatorio para las neuronas de relé. Además, las neuronas de retransmisión reciben entradas excitatorias de las neuronas corticales a través de sinapsis corticogénicas. Además, las neuronas de retransmisión reciben insumos inhibitorios de interneuronas locales y neuronas GABAérgicas del núcleo reticularis thalami¹. El núcleo reticularis thalami está presente como un escudo entre el tálamo y la corteza de tal manera que las fibras quese proyectan desde la corteza hasta el tálamo y en la dirección opuesta deben pasar por el núcleo reticularis thalami 2.

Las entradas retinogénicas y las entradas de corticogeniculato muestran propiedades sinápticas distintas^3,4,5,6,7,8. Las entradas de retinogeniculato formanterminales grandes con múltiples sitios de liberación 9,¹⁰. Por el contrario, las entradas de corticogeniculato muestran terminales pequeños con sitios de liberación única⁷. Además, las sinapsis retinogénicas impulsan eficientemente los potenciales de acción de las neuronas de relé a pesar de constituir sólo el 5-10% de todas las sinapsis en las neuronas de relé^3,8,11. Las sinapsis corticogénicas, por otro lado, sirven como modulador de las transmisiones retinogénicas mediante el control del potencial de membrana de las neuronas de retransmisión^12,13.

Estas dos entradas principales excitatorias para transmitir neuronas también son funcionalmente diferentes. Una diferencia prominente es la depresión a corto plazo de las sinapsis retinogénicas y la facilitación a corto plazo de las sinapsis de corticogeniculato^3,5,8. La plasticidad a corto plazo se refiere a un fenómeno en el que la fuerza sináptica cambia cuando la sinapsis está repetidamente activa en un período de tiempo de pocos milisegundos a varios segundos. La probabilidad de liberación sináptica es un factor importante que subyace a la plasticidad a corto plazo. Las sinapsis, con una baja probabilidad de liberación inicial, muestran una facilitación a corto plazo debido a la acumulación de Ca²⁺ en la presinapvez y, en consecuencia, se observa un aumento en la probabilidad de liberación en la actividad repetida. Por el contrario, las sinapsis con alta probabilidad de liberación suelen mostrar depresión a corto plazo debido al agotamiento de las vesículas ya liberables^14. Además, la desensibilización de los receptores postsinápticos contribuye a la plasticidad a corto plazo en algunas sinapsis de probabilidad de alta liberación^8,15. Alta probabilidad de liberación y desensibilización de los receptores de ácido isozolapropionico (AMPA) de alta liberación contribuyen a la depresión prominente a corto plazo de las sinapsis retinogénicadas. Por el contrario, la probabilidad de baja liberación subyace a la facilitación a corto plazo de las sinapsis corticogénicas.

En ratones, el tracto óptico entra en el núcleo de geniculado lateral dorsal (dLGN) desde el sitio caudolateral, mientras que las fibras corticogénicas entran en el rostro dLGNventrally. La distancia entre las dos entradas permite la investigación de las propiedades individuales de dos entradas excitatorias muy diferentes que afectan a la misma celda. Aquí, nos basamos y mejoramos un método de disección descrito previamente en el que las fibras de retinogeniculato y corticogenicullato se conservan en rebanadas cerebrales agudas³. Nosotros, entonces, describimos la investigación electrofisiológica de las neuronas de relé y la estimulación de las fibras de retinogeniculato y corticogeniculato con electrodos de estimulación extracelular. Finalmente, proporcionamos un protocolo para el llenado de neuronas de relé con biocitetina y posterior análisis anatómico.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por el Panel de Supervisión Gubernamental sobre Experimentos Animales de Renania-Palatinado.

1. Soluciones

1. Solución de disección
   1. Para reducir la excitotoxicidad, preparar una solución a base de colina para ser utilizado durante la disección como se presenta aquí (en mM): 87 NaCl, 2.5 KCl, 37.5 cloruro de colina, 25 NaHCO₃, 1.25 NaH₂PO₄, 0.5 CaCl₂, 7 MgCl_2, y ₂₅ glucosa. Prepare la solución de disección menos de 1 semana antes del experimento.
2. Solución de grabación
   1. Preparar una solución de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) que contenga (en mM): 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 1.25 NaH₂PO4, 2.5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂y 25 glucosa. Añadir 50 M D-APV y 10 M SR 95531 hidrobromuro para bloquear N-metil-D-aspartato (NMDA) y GABA_A receptores, respectivamente.
3. Solución intracelular
   1. Preparar una solución intracelular que contenga (en mM): 35 Cs-gluconato, 100 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA y 0.1 D-600 (clorhidrato de metoxiverapamilo). Ajuste el pH a 7.3 con CsOH. Filtrar, alícuota, y almacenar la solución de stock a -20 oC hasta su uso.

2. Disección

1. Preparar dos cámaras de corte, de las cuales una está llena con 100 ml de la solución de disección y la otra con 100 ml de solución de grabación. Colocar los dos vasos en un baño de agua (37 oC) y burbujear las soluciones con carbogen durante al menos 15 minutos antes de la disección.
2. Llene un vaso de precipitados de plástico con 250 ml de solución de disección casi fría (pero no congelada). Burbuja con carbogen al menos 15 min antes de su uso.
3. Llenar una placa de plástico Petri (100 mm x 20 mm), en la que se realizará la disección cerebral, con la solución de disección fría. Coloque un pedazo de papel de filtro en la tapa de la placa Petri.
4. Enfríe la cámara de disección del vibratome.
5. Anestetizar un ratón con 2,5% de isoflurano, por ejemplo, en la jaula del ratón. Tan pronto como el ratón no responda a un pellizco de cola, descante el ratón cerca de la médula cervical y sumerja la cabeza en la solución de disección helada en la base de la placa Petri.
6. Corta la piel de la cabeza de caudal a nasal y mantenla lateralmente con los dedos para exponer el cráneo. Para sacar el antecebra, primero corte el cráneo junto con la línea media posterior-anterior, y luego corte dos veces más a través de la sutura coronal y la sutura lambdoide (Figura1A).
7. Retire el cráneo entre la sutura coronal y la sutura lambdoid de tal forma que el cerebrum esté expuesto. Cortar la bombilla olfativa y separar el cerebro de frente del cerebro medio con una cuchilla fina (Figura1B). Retire el cerebro del cráneo con una espátula delgada y colóquelo sobre el papel de filtro en la tapa de la placa Petri.
   NOTA: Los pasos 2.6 y 2.7 deben realizarse lo más rápido posible para reducir la muerte celular.
8. Para preservar la integridad de las entradas sensoriales y corticales a la dLGN en la rebanada cerebral, separe los dos hemisferios con un corte parasagital con un ángulo de 3 x 5o (Figura1C,D). Secar los planos mediolaterales de los dos hemisferios colocándolos en el papel de filtro y luego pegarlos en la etapa de corte con un ángulo de 10 a 25o desde el plano horizontal (Figura1E).
9. Coloque el escenario en el centro de la bandeja tampón de metal y vierta suavemente el resto de la solución de disección helada en la bandeja tampón. Realice este paso con cuidado ya que un vertido fuerte podría eliminar el cerebro pegado (Figura1F).
10. Coloque la bandeja tampón en la bandeja llena de hielo, lo que ayuda a mantener la baja temperatura durante la disección. Corte las rodajas de 250 m con una cuchilla de afeitar a una velocidad de 0,1 mm/s y una amplitud de 1 mm.
11. Mantenga las rodajas en la cámara de retención llenas de solución de disección oxigenada a 34 oC durante unos 30 minutos y, a continuación, permita que las rodajas se recuperen en la solución de grabación a 34 oC durante otros 30 minutos.
12. Después de la recuperación, retire la cámara de retención de rodajas del baño de agua y mantenga las rodajas a temperatura ambiente (RT) hasta que se utilicen en experimentos.

3. Electrofisiología

1. Tire de pipetas utilizando capilares de vidrio borosilicato y un tirador de filamento. Mantenga la resistencia de las pipetas de grabación a 3 x 4 M. Tire de pipetas estimulantes utilizando el mismo protocolo pero rompa la punta ligeramente después de tirar para aumentar el diámetro. Llene las pipetas de grabación con la solución intracelular y la biocitetina, mientras llena las pipetas estimulantes con la solución de grabación.
2. Coloque las rodajas en la cámara de grabación y perfore continuamente las rebanadas con la solución de grabación oxigenada en RT. Compruebe todas las rebanadas y seleccione las que muestran un tracto óptico intacto.
3. Visualice la rebanada y las células con un microscopio vertical equipado con microscopía de vídeo de contraste de interferencia diferencial infrarroja (IR-DIC).
   NOTA: Las neuronas de relé se diferencian de las interneuronas por su mayor tamaño de soma y más dendritas primarias (ramas que emergen del soma). Las interneuronas muestran morfología bipolar con un soma más pequeño.
4. Coloque la pipeta estimulante en la rebanada antes de parchear la celda con la pipeta de grabación. Para investigar las sinapsis retinogénicas, coloque la pipeta estimulante directamente en el tracto óptico, donde se agrupan las fibras de axón de las células ganglionares retinianas (Figura2A). Para analizar las sinapsis corticogénicas, coloque el electrodo estimulante en el núcleo reticularis thalami, que es rostroventrally adyacente al dLGN (Figura2B).
5. Una vez que la pipeta de grabación esté sumergida en la solución de grabación, aplique un paso de voltaje de 5 mV para supervisar la resistencia de la pipeta. Establezca el potencial de retención en 0 mV y cancele el potencial de desplazamiento de modo que la corriente de retención sea 0 pA.
6. Acérquese a la celda con la pipeta de grabación mientras aplica presión positiva. Cuando la pipeta esté en contacto directo con la membrana celular, suelte la presión positiva y establezca el potencial de retención en -70 mV. Aplique una ligera presión negativa para permitir que la membrana celular se adhiera a la pipeta de vidrio de tal forma que se forme un sello gigaohm (resistencia >1 G). Compensar la capacitancia de la pipeta y abrir la célula mediante la aplicación de pulsos de presión negativa.
7. Para investigar la función sináptica, aplique pulsos de corriente de 0,1 ms (ca. 30 oA) a través de la pipeta de estimulación. Si no se observan respuestas sinápticas, es posible que deban sustituirse las pipetas estimulantes. Tenga cuidado al colocar las pipetas estimulantes en una posición diferente, de modo que la célula registrada no se pierda.
   NOTA: En las grabaciones de ejemplo que se muestran en la Figura2, se investigó la plasticidad sináptica a corto plazo estimulando el tracto óptico o las fibras corticogénicas dos veces con intervalos interestímulos de 30 ms. La relación de pulso emparejado (PPR) se calculó dividiendo la amplitud de la segunda corriente postsináptica excitatoria (EPSC) por la del primer EPSC (EPSC₂/EPSC₁). Cada protocolo de estimulación se repitió 20 veces. La amplitud EPSC se midió a partir de las corrientes medias de los 20 barridos. El intervalo de tiempo entre cada repetición fue de al menos 5 s para evitar la plasticidad a corto plazo inducida por las repeticiones.
8. Supervise la resistencia de la serie continuamente aplicando un paso de voltaje de 5 mV. Utilice únicamente las células con una resistencia en serie inferior a 20 M para el análisis.

4. Etiquetado de biocitotina

1. Mantener la configuración de células enteras durante al menos 5 minutos para permitir la difusión de biocitina en las dendritas distrales.
2. Después de la grabación, retire suavemente la pipeta de la célula para que el soma no se destruya.
   NOTA: Si se registra más de una celda en un sector, sus somas deben estar lo suficientemente lejos de sus celdas vecinas. Asegúrese de que las dendritas de diferentes células no interfieran entre sí durante la toma de imágenes.
3. Prepare una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Llene cada pozo con 300 s de 4% de paraformaldehida (PFA). Tenga cuidado de no contaminar nada con PFA que esté en contacto con las rodajas a registrar.
4. Transfiera las rodajas de la cámara de grabación a la placa que contiene PFA con una pipeta de goma y fije las rodajas durante la noche. Asegúrese de que la pipeta siempre se previene de la contaminación por PFA.
   ADVERTENCIA: Use siempre guantes y una capucha química al manipular PFA.
5. Después de fijar las rodajas durante la noche en PFA, reemplace el PFA por una solución salina con búfer de fosfato (PBS). Almacene las rebanadas en PBS a 4 oC para su procesamiento futuro (menos de 2 semanas).
6. Lave las rodajas con PBS fresco 3 veces (10 min cada lavado).
7. Bloquear sitios de unión inespecíficos incubando las rodajas en la solución de bloqueo (0,2% tensioactivo no iónico y albúmina sérica del 5% en PBS) durante 2 h en RT en un agitador orbital.
8. Deseche la solución de bloqueo. Incubar las rodajas con streptavidina-Alexa 568 diluida en la solución de bloqueo (1:1.000) a 4oC durante la noche en un agitador orbital.
9. Deseche la solución de anticuerpos y lave las rodajas 3 veces con PBS durante 10 minutos a RT en un agitador orbital. Lave las rodajas con agua del grifo antes de montarlas.
10. Coloque las rodajas de un ratón en una diapositiva de vidrio. Asegúrese de que las celdas teñidas estén presentes en la superficie superior de las rebanadas. Absorba el agua alrededor de las rodajas con pañuelos de papel y luego deja que las rodajas se sequen durante aproximadamente 15 minutos.
11. Aplique dos gotas de medio de montaje en cada rodaja. Monte un cubreobjetos en el portaobjetos sin producir burbujas de aire.
12. Almacene las rodajas etiquetadas a 4 oC después de la visualización con un microscopio confocal.

5. Imágenes celulares y reconstrucción

1. Escanee los cortes con un microscopio confocal y utilice el software asociado para el análisis.
2. Emocione la fluorescencia a 561 nm.
3. Imagen de las rebanadas con 0,7 apertura numérica (NA), objetivo de inmersión en aceite.
4. Ajuste la celda de destino en el centro de la vista y aplique una ampliación de 2,5 veces.
5. Renderice los datasets de la pila Z para escanear toda la neurona con los siguientes parámetros: formato de 2.550 x 2.550 píxeles, frecuencia de escaneado a 400 Hz, número z a 40.Voxel el tamaño era de alrededor de 0.1211 x 0.1211 x 1.8463 ám3.
6. Rastreo semi-automáticamente de las neuronas utilizando un software de reconstrucción neuronal (por ejemplo, NeuronStudio). Un ejemplo de una neurona de relé rastreado 3D se muestra en la Figura 3B.

Resultados

La preparación de la rebanada de dLGN que contiene las vías de retinogeniculato y corticogeniculato se muestra bajo un objetivo 4x (Figura2). Los axónes de las células ganglioneras de la retina se agrupan en el tracto óptico (Figura 2). La pipeta estimulante se colocó en el tracto óptico para inducir la corriente mediada por la sinapsis retinogénica (Figura2A)y en el núcleo reticularis thala...

Discusión

Describimos un protocolo mejorado basado en un método publicado previamente³, que permite la investigación de la alta probabilidad de liberación de sinapsis retinogénicados y baja probabilidad de liberación de sinapsis corticogénicas de la misma rebanada. Esto es de gran importancia ya que estas dos entradas interactúan entre sí para modular la transmisión de la señal visual: las entradas retinogénicas son el principal impulsor excitatorio de las neuronas de relé, mientras que las entr...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifier	HEKA Elektronik	EPC 10 USB Double patch clamp amplifier
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261-250MG
CaCl2	EMSURE	1.02382.1000
choline chloride	Sigma-Aldrich	C1879-1KG
Confocal Laser Scanning Microscope	Leica Microsystems	TCS SP5
CsCl	EMSURE	1.02038.0100
Cs-gluconate	Self-prepared		Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves
D-600	Sigma-Aldrich	M5644-50MG	methoxyverapamil hydrochloride
D-APV	Biotrend	BN0085-100	NMDA-receptor antagonist
Digital camera for microscope	Olympus	XM10
EGTA	SERVA	11290.02
Forene	Abbvie	2594.00.00	isoflurane
Glucose	Sigma-Aldrich	49159-1KG
HEPES	ROTH	9105.2
High Current Stimulus Isolator	World Precision Instruments	A385
KCl	EMSURE	1.04936.1000
MgCl2	EMSURE	1.05833.0250
Micromanipulators	Luigs & Neumann	SM7
Miroscope	Olympus	BX51
mounting medium	ThermoFisher Scientific	P36930	Prolong Gold Invitrogen
NaCl	ROTH	3957.1
NaH2PO4	EMSURE	1.06346.1000
NaHCO3	EMSURE	1.06329.1000
Pipette	Hilgenberg	1807502
Puller	Sutter	P-1000
razor blade	Personna	60-0138
Semiautomatic Vibratome	Leica  Biosystems	VT1200S
SR 95531 hydrobromide	Biotrend	AOB5680-10	GABAA-receptor antagonist