Un modelo de hurón de lesión cerebral hipoxic-isquémica tardía con sensibilidad tardía

Resumen

El método describe la lesión cerebral hipoxic-isquémica e hiperoxica con sensibilidad a la inflamación-sensificada e hiperoxica en el hurón P17 para modelar la interacción compleja entre la inflamación prolongada y la lesión cerebral oxidativa experimentada en una serie de bebés prematuros tardíos.

Resumen

Existe una necesidad continua de modelos clínicamente relevantes de infección perinatal e hipoxia-isquemia (HI) en los que probar intervenciones terapéuticas para lactantes con la secuencia neurológica de prematuridad. Los hurones son candidatos ideales para modelar el cerebro humano prematuro, ya que nacen lissencéfalos y desarrollan cerebros gyrencéfalos postnatalmente. Al nacer, el desarrollo cerebral del hurón es similar a un feto humano de 13 semanas, con 17 kits del día postnatal (P) considerados equivalentes a un bebé a las 32-36 semanas de gestación. Describimos un modelo de lesión en el hurón P17, donde la administración de lipopolisacáridos es seguida por isquemia cerebral bilateral, hipoxia e hiperoxia. Esto simula la interacción compleja de inflamación prolongada, isquemia, hipoxia, y estrés oxidativo experimentado en un número de neonatos que desarrollan lesión cerebral. Los animales lesionados muestran una serie de gravedad grave de lesiones, con cambios morfológicos en el cerebro incluyendo el estrechamiento de múltiples gyri corticales y sulci asociados. Los animales lesionados también muestran un desarrollo reflejo lento, una velocidad de locomoción más lenta y variable en una pasarela automatizada, y una disminución de la exploración en un campo abierto. Este modelo proporciona una plataforma en la que probar terapias putativas para lactantes con encefalopatía neonatal asociada con inflamación e HI, estudiar mecanismos de lesión que afectan el desarrollo cortical e investigar vías que proporcionan resiliencia en animales no afectados.

Introducción

Existe una necesidad constante de modelos animales grandes que reflejen la fisiopatología de la prematuridad y la hipoxia-isquemia perinatal en las que se puedan probar intervenciones terapéuticas para lactantes. En 2017, el 9,93% de los 382.726 bebés nacidos en los Estados Unidos nacieron prematuros, y el 84% de estos bebés nacieron entre 32 y 36 semanas de gestación^1. En los bebés prematuros, la exposición perinatal a la infección o inflamación es común, donde la activación inmune materna debido a patógenos virales o bacterianos puede iniciar el trabajo de parto prematuro. Postnatalmente, los bebés prematuros corren un alto riesgo de padecer sepsis²de inicio temprano o tarde. Los bebés prematuros también experimentan con frecuencia períodos de hipoxia, hipotensión e hiperoxia debido a su sistema cardiorrespiratorio inmaduro, elevada tensión de oxígeno en la atmósfera en relación con las experimentadas en el útero, y exposiciones iatrogénicas. Además, en los bebés prematuros, las defensas antioxidantes son inmaduras³ y los factores pro-apoptóticos son naturalmente regulados⁴. El estrés oxidativo y la muerte celular conducen a la activación del sistema inmunológico y la neuroinflamación. Se cree que estos factores combinados contribuyen a la vulnerabilidad del cerebro en el desarrollo y fisiológica, y dan lugar o exacerban la encefalopatía asociada con resultados de desarrollo deficientes en los bebés prematuros^5,6,7.

Debido a las similitudes físicas y de desarrollo que el cerebro hurón comparte con el cerebro humano, el hurón es una especie atractiva en la que modelar lesión cerebral^8,9,10,11,12. Los hurones también son candidatos ideales para modelar el cerebro humano prematuro, ya que nacen lissencéfalos y desarrollan cerebros gyrencéfalos postnatalmente, lo que proporciona una ventana en la que exponer el cerebro en desarrollo a insultos que imitan a los experimentados por los bebés nacidos prematuros. Al nacer, el desarrollo cerebral del hurón es similar a un feto humano de 13 semanas, con 17 kits del día postnatal (P) considerados equivalentes a un bebé a las 32–36 semanas de gestación^13.

Nuestro grupo ha publicado recientemente un modelo de lesión cerebral extremadamente prematura (<28 semanas) en el hurón P10 combinando sensibilización inflamatoria con Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) con posterior exposición a la hipoxia y la hiperoxia^12. En el siguiente protocolo, ahora describimos un modelo prematuro tardío en el hurón P17, donde la sensibilización lpS es seguida por isquemia cerebral bilateral, hipoxia e hiperoxia. Esto resulta en lesiones más graves en un subconjunto de animales, y más de cerca modela la interacción compleja de inflamación prolongada, isquemia, hipoxia, y estrés oxidativo experimentado en un número de bebés prematuros que desarrollan lesión cerebral.

Protocolo

Los procedimientos se realizaron de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y como parte de un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Washington.

1. Preparación y Administración de LPS

NOTA: Refiera a la figura 1 para una línea de tiempo de los procedimientos.

1. Antes de iniciar el procedimiento, sellar, esterilizar y autoclave todos los instrumentos quirúrgicos y cortinas quirúrgicas. Preparar medicamentos preoperatorios en viales estériles. Calcule el caudal necesario para reemplazar el aire en la cámara de hipoxia/hiperoxia con el gas experimental en 8-10 min.
2. Preparar el lipopolisacárido (LPS de E. coli 055:B5) en solución salina estéril para producir una concentración de 1 mg/ml. Retire los kits de hurón P17 de sus jills. Pesar y numerarlos. Aleatorizar animales por basura y sexo a los grupos de control o lesionados (o tratamiento).
3. Utilizando una jeringa de insulina de 300 l, administre 3 mg/kg de LPS por vía intraperitoneal a kits del grupo de lesiones, y un volumen equivalente de vehículo salino estéril (3 l/g) para controlar a los animales.
4. Colocar animales en una cámara dentro de un baño de agua a 37-40 oC para mantener una temperatura rectal objetivo de 36-37 oC durante los procedimientos quirúrgicos.

2. Anestesia

1. Durante el procedimiento, controle continuamente la temperatura, la frecuencia de respiración y la frecuencia cardíaca del animal.
2. Administrar buprenorfina (0,05 mg/kg) por vía subcutánea 30 min antes del procedimiento quirúrgico. Inducir la anestesia en una mezcla de 3% de isoflurano equilibrado con 100% de oxígeno. Retire el kit de la cámara de inducción y colóquelo de forma supina en una manta de agua quirúrgica cubierta a 37 oC. Transfiera la anestesia al cono nasal y reduzca el nivel de isoflurano a 2-3%.

3. Preparación quirúrgica

1. Usando pequeños cortapapeles de animales, retire todo el cabello de la región del cuello ventral. Afeitarse en un patrón rectangular con cuidado para evitar que se ablase la piel o genere erupción cutánea. Administrar anestesia local en la zona arasda utilizando lidocaína intradérmica (4 mg/kg) y bupivacaína (2,5 mg/kg).
2. Preparar el cuello mediante la aplicación alterna de povidona-yodo y 70% exfoliante de etanol con hisopos de algodón estériles. Repite el exfoliante de forma que la povidona-yodo y el 70% de etanol se apliquen 3 veces de manera alterna.
3. Confirme la profundidad de la anestesia mediante la ausencia de reflejo de pellizco de los dedos de los dedos. Mantener el nivel de isoflurano en el porcentaje mínimo requerido para un plano quirúrgico de anestesia. Usando cortinas recortadas desechables estériles que exponen la región del cuello, cubran al animal.

4. Ligación Bilateral de la Arteria Carótida

1. Con una hoja de bisturí de #11 de un solo uso, haga una incisión de línea media de 1,5 cm en el centro del cuello. Usando hemostats finos y fórceps curvos, disecciona sin rodeos hasta la arteria carótida izquierda. Diseccionar la arteria lejos del haz neurovascular asociado.
2. Usando un par de fórceps finos curvos, pasa una longitud de 10 cm en bucle de sutura de seda estéril 5-0 debajo de la arteria. Corta la sutura por la mitad. Ligar la arteria mediante la atar de forma segura ambas longitudes de sutura, dejando al menos 2 mm entre los nudos. Transecte la arteria carótida izquierda entre las suturas, teniendo cuidado de dejar el nervio intacto.
3. Repita la disección en el lado derecho. Ligar reversiblemente la arteria carótida derecha con una sola corbata umbilical estéril de 1/8 pulgadas. Cierre la herida con clips quirúrgicos de la piel.
4. Deje que el animal se recupere en un baño de agua con temperatura controlada durante al menos 30 minutos antes de la hipoxia.
   NOTA: Si las arterias no están completamente aisladas del resto del haz neurovascular, se puede ver un aumento de la mortalidad antes o durante la hipoxia posterior.

5. Hipoxia secuencial, hiperoxia e hipoxia

1. Durante la hipoxia y la hiperoxia, altere la temperatura del baño de agua según sea necesario para mantener la temperatura rectal durante la hipoxia a 37 oC en los animales centinelas.
2. Coloque a los animales en el grupo de lesiones en una cámara hermética dentro de un baño de agua. Controle continuamente la concentración de oxígeno dentro de la cámara, así como la temperatura rectal en al menos un animal centinela. Lavar la cámara con un 9% de oxígeno humidificado (91% de nitrógeno) y mantener un caudal de 3-5 L/min, dependiendo del tamaño de la cámara. Una vez que la concentración de oxígeno en la cámara ha alcanzado el 9%, continuar durante 30 minutos.
3. Después de 30 minutos, cambie el suministro de gas al 80% de oxígeno humidificado (20% de nitrógeno) y permita que la cámara alcance la concentración objetivo en función del caudal y el tamaño de la cámara. Continúe durante 30 min de hiperoxia. Abra la cámara para permitir que llegue más rápidamente a normoxia equilibrando con el aire de la habitación.
4. Sellar la cámara y lavar con un 9% de oxígeno humidificado. Monitoree continuamente todos los animales visualmente, tomando nota de los animales que muestran bradipnea. Una vez que la concentración de oxígeno en la cámara ha alcanzado el 9%, continuar durante 30 minutos. Si se observa mortalidad intrahipóxica (paro respiratorio) en cualquiera de los animales antes del final del período de 30 minutos, termine la hipoxia inmediatamente.

6. Reversión de la ligadura de la arteria carótida derecha

1. Devolver animales a la zona quirúrgica, e inducir anestesia en una mezcla de 3% de isoflurano equilibrado con 100% de oxígeno. Transfiera la anestesia al cono nasal y reduzca el nivel de isoflurano a 2-3%. Retire los clips quirúrgicos de la herida y vuelva a preparar el área de la herida con povidona-yodo. Confirme la profundidad de la anestesia mediante la ausencia de reflejo de pellizco de los dedos de los dedos. Mantener el nivel de isoflurano en el porcentaje mínimo requerido para un plano quirúrgico de anestesia. Usando cortinas recortadas desechables estériles que exponen la región del cuello, cubran al animal.
2. Con fórceps curvos, identifique y desate la cinta umbilical de la arteria carótida derecha. Cierre la herida con clips quirúrgicos de la piel.

7. Recuperación y gestión de la temperatura

1. Devolver todos los kits a sus jills durante 60 minutos, para la lactancia y la recuperación. Después de 60 minutos, devolver a los animales heridos a los baños de agua a 37-40 oC durante 6 h, ajustando la temperatura del agua según sea necesario para mantener la temperatura rectal a 36-37 oC. Devolverles los kits a sus jills.
2. Retire los clips quirúrgicos de 10 a 14 días después de la cirugía (P27–P31).

8. Pruebas de reflejos

1. Realice todas las pruebas de reflejos diariamente a partir de P21–P28, y al menos 3 veces por semana desde P28–P42, sin dejar de estar ciego al grupo de exposición (o tratamiento). Antes de realizar pruebas de reflejos, coloque los kits en una cámara con asistencia térmica (baño de agua de 37 oC, almohadilla de calor, etc.) durante 1 h. Para cada prueba, complete todas las pruebas por kit antes de probar el siguiente kit.
2. Geotaxis negativos (25o)
   1. Coloque una placa plana (16 1/2 pulg. x 12 pulg.) envuelta en un protector absorbente de sobremesa contra un objeto para que la placa forme un ángulo de 25o con la mesa. Coloque un kit en el tablero propenso y mirando hacia abajo, aproximadamente el 75% del camino hacia arriba del tablero.
   2. Asegúrese de que el cuerpo del kit esté recto y de que tenga las cuatro patas agarradas contra el tablero antes de soltarlo. Tan pronto como se coloque el kit, comience la evaluación de la hora.
   3. Registre el tiempo en el que el kit logra girar su cuerpo 90o en relación con su posición inicial. Registre el tiempo a la que el kit gira su cuerpo 180o y da un paso completo hacia la parte superior de la placa. Realice 3 ensayos en la inclinación de 25o antes de pasar a la siguiente prueba.
3. Geotaxis negativos (45o)
   1. Realice 3 pruebas de la prueba de geotaxis negativa descrita anteriormente de nuevo, esta vez con la placa establecida en un ángulo de 45o.
4. Aversión de Cliff
   1. Coloque una plataforma acolchada alrededor de 1 pie por debajo de la repisa para minimizar las lesiones en los kits si caen.
   2. Coloque un kit orientado y perpendicular al borde del banco de laboratorio. Asegúrese de que el cuerpo del kit esté recto, con sus patas delanteras al ras con el borde. Comience la evaluación de la hora desde el momento en que se coloca el kit. Tenga cuidado de diferenciar entre el movimiento consciente lejos del acantilado y otros movimientos espontáneos que no implican caminar coordinado.
   3. Registre el momento en que el kit aleja su cuerpo del borde (definido como el kit hacia arriba, girando su cuerpo o moviendo sus extremidades delanteras lejos del borde). Registre el tiempo que el kit completa su primer paso en la dirección opuesta de la arista (definida como cualquier dirección o ángulo más allá de una rotación de 90o desde su posición inicial frente al borde).
   4. Realice 3 pruebas de aversión a acantilados por kit antes de pasar a la siguiente prueba.
5. Reflejo de derecha
   1. Coloque un kit supino en el banco, manteniéndolo suavemente en esa posición antes de soltarlo y al mismo tiempo iniciar el cronómetro. Registre el tiempo que el kit se detiene con las cuatro patas al mismo tiempo planas contra el banco en posiciones de soporte de peso. Registre el tiempo en el que el kit da un paso completo en cualquier dirección (definida como la colocación de las cuatro patas para lograr el progreso en una dirección dada sin girar o arrastrar el cuerpo).
   2. Realizar 5 pruebas de la prueba de reflejo de enderedo por animal.
   3. Después de que cada kit haya completado las 5 pruebas de reflejo sorteo, devuelva la camada a la jill.

9. Pruebas de pasarela

1. En P42, retire los kits de la jill. Coloque los kits en jaulas de plástico aproximadamente 10 minutos antes de la prueba, para que puedan aclimatarse al medio ambiente. Apague las luces en la sala de pruebas para garantizar que la luz ambiental no afecte a la función de la pasarela.
2. Cree un nuevo experimento en el software correspondiente. Ajuste los ajustes experimentales para que la duración máxima de la ejecución no supere los 10,00 s y la duración mínima de la ejecución no sea inferior a 1,50 s. Establezca la variación de velocidad máxima para que no supere el 60%. Establezca un requisito mínimo de tres corridas compatibles para cada animal.
3. Ajuste la anchura de la pasarela en relación con el tamaño del animal para que pueda sobredecirlo libremente sin tocar las paredes mientras permanece lo suficientemente estrecho como para desalentar el giro. Agregue una nueva configuración de detección en la pestaña Perfiles de configuración de detección mediante detección automática. Utilice los mismos ajustes de detección para todas las camadas y animales a una edad determinada.
4. Limpie a fondo la pasarela con un tejido de papel con poca pelusa y un 70% de etanol antes y después de cada animal. Limpie las patas del hurón regularmente para mejorar la precisión de la detección y clasificación. Una vez que la pasarela y el animal estén preparados, comience la adquisición del ensayo.
5. Pausa la adquisición para limpiar la pasarela si se acumulan huellas en el vaso, o si los animales pasan orina o heces. Detenga la adquisición una vez que el software de pasarela haya reconocido tres ejecuciones compatibles en función de la configuración predeterminada del experimento.

10. Pruebas de campo abierto (P42)

1. Utilice una caja de acrílico no porosa (55 cm x 55 cm x 40 cm de alto) pintada de blanco mate. Coloque la cámara de modo que esté centrada directamente encima de la caja y se capturen las cuatro paredes. Limpie la arena de ensayo con 70% de etanol antes del primer uso y entre animales.
2. En el software correspondiente, seleccione Nuevo de plantilla y Aplicar una plantilla predefinida. Continúe el procedimiento de configuración seleccionando secuencialmente Tipo de sujeto:Otro; Plantilla de arena:Campo abierto, cuadrado; Plantilla de zona:Centro, borde, esquinas; Características a rastrear: Punto central.
3. Abre Arena Settings y toma la imagen de fondo de la entrada de la cámara, asegurándote de que las paredes superiores de la arena estén visibles. Calibrar las dimensiones de la arena utilizando la herramienta de escala.
4. Ajuste las zonas de arena predefinidas cambiando el tamaño de los contornos para que se ajusten a las zonas de pared (NW, NE, SW, SE) y las zonas de suelo (parte superior izquierda, parte superior media, superior derecha, centro izquierdo, centro, centro derecho, inferior izquierdo, parte inferior media, inferior derecha). Valide la configuración para confirmar que no hay zonas superpuestas.
5. Abra la ventana Adquisición y pulse Iniciar adquisición. Coloque el hurón en el centro de la arena de pruebas orientado de tal manera que sea consistente para cada sujeto de prueba. Permita que el hurón se mueva libremente por toda la arena durante un período de 5 min. Al final del período de prueba, pulse Detener adquisición. Repita el procedimiento con el siguiente hurón.
   NOTA: Todos los experimentadores de la sala deben posicionarse para ser inobservables por el hurón y permanecer en silencio durante el período de prueba.

11. Fijación-perfusión

1. En P42, anestetiza profundamente los kits con 5% de isoflurano. Administrar una sobredosis de pentobarbital (120–150 mg/kg i.p.). Asegurar la anestesia profunda por falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo del dedo del dedo del día y pérdida de los movimientos respiratorios.
2. Transfiera al animal a una capucha de humo. Abra el tórax y sujete la aorta descendente usando hemostats finos. Corta la aurícula derecha. Usando una bomba de perfusión, perfundir el ventrículo izquierdo con 60 ml de solución salina estéril a una velocidad de 30 ml/min. Perfuse con 60 ml de formalina (10% formaldehído) a una velocidad de 30 ml/min.
3. Decapita el cadáver y retira el cerebro del cráneo usando tijeras, fórceps, rongeurs y una espátula. Tome fotografías de alta resolución de los aspectos dorsales, ventrales y laterales de cada cerebro. Post-arreglar el cerebro en forcina durante al menos 48 h.

12. Medición cerebral Ex Vivo

1. Retire el cerebro de la formalina (paso 11.3) y colóquelo sobre una toalla de papel para absorber el exceso de líquido.
2. Usando una pinza electrónica, mide la altura del cerebro colocando las puntas de la pinza en los aspectos dorsales y ventrales del cerebro. Mida la longitud del cerebro colocando las puntas de la pinza en la bombilla olfativa y el borde más posterior del lóbulo occipital. Mida el ancho del cerebro colocando las puntas de la pinza en las partes más laterales de los lóbulos temporales. Pesa el cerebro.
3. Medir la fisura longitudinal (anterior y posterior al sulcus cruciato), sulci lateral, suprasylvian sulci, coronal sulci, pseudosylvian sulci, ansinate sulci, cruciate sulci, presylvian sulci, gyri lateral, suprasylvian gyri, sigmoide gyri ( anterior y posterior), gyri coronal, ectosilvan gyri (anterior y posterior), y gyri orbital. Mida todos los sulci desde el principio y el final de la porción más distinta del sulcus correspondiente. Mida todos los gyri desde el aspecto más amplio de cada gyrus correspondiente.
4. Mida la cantidad de cerebelo expuesta colocando una punta de la pinza en el punto más posterior de la fisura longitudinal y colocando la otra punta de la pinza en la parte más posterior del cerebelo.
   NOTA: El atlas cerebral hurón, como se encuentra en Biología y Enfermedades del Hurón^14,se utilizó para desarrollar las mediciones cerebrales ex vivo hurón.

13. Puntuación de lesiones brutas

1. Usando las fotografías tomadas en el paso 11.3., aplique los criterios de puntuación en los pasos 13.2–13.4 para evaluar la lesión cerebral grave (escala 0-9) mientras permanece cegado a los grupos de exposición (o tratamiento).
2. Evalúe la fisura longitudinal. Si parece normal, asigne una puntuación de 0. Si se ensancha ligeramente (aproximadamente 2x ancho normal), pero el aumento de ancho es incompleto a lo largo de la longitud de la fisura, asigne una puntuación de 1. Si se ensancha moderadamente (aproximadamente 2-3x normal), asigne una puntuación de 2. Si se ensancha notablemente, con un espacio visible >3x de anchura normal a lo largo de la mayor parte de la longitud de la fisura, aplique una puntuación de 3.
3. Evalúe el sulci lateral. Si muestran una definición normal, con la separación del gyri lateral y el gyri suprasylvian, asigne una puntuación de 0. Si se ve una definición leve unilateral o bilateral reducida de sulcus, particularmente en la porción caudal, con un estrechamiento mínimo de los lóbulos frontales y temporales en relación con los lóbulos occipitales, asigne una puntuación de 1.
   1. Si se ve una definición moderadamente reducida de los sulci, con depresión del gyri suprasilvano, estrechamiento del gyri coronal y ectosilvano, y estrechamiento leve de los lóbulos frontales y temporales en relación con los lóbulos occipitales, asigne una puntuación de 2. Si se ve degeneración quística unilateral, con un cambio mínimo del hemisferio contralateral, asigne una puntuación de 3. Si hay una mala definición del sulci lateral, con degeneración quística bilateral o grave de los lóbulos occipital y temporal, asigne una puntuación de 4.
4. Evaluar la parte visible del cerebelo. Si parece normal, con (<75% de los vermis y <66% de los hemisferios visibles, asigne una puntuación de 0. Si el 75–90% de los vermis y el 66% de los hemisferios son visibles, asigne una puntuación de 1. Si la mayor parte del cerebelo es visible, mostrando todos los vermis y el 66% de los hemisferios, asigne una puntuación de 2.

14. Análisis de datos

1. Para los datos de pruebas de reflejos, asigne a los errores una puntuación de 61 s para permitir que se comparen con los éxitos al final de los tiempos (60 s), pero con una peor clasificación en el análisis estadístico. Calcular un área debajo de la curva para cada animal a lo largo del tiempo en cada una de las pruebas de reflejo.
2. Ajuste los datos de la pasarela que implican el tamaño de la pata de la presión por el peso del animal.
3. Analice los datos utilizando métodos estadísticos no paramétricos, describiendo los datos utilizando la mediana y el rango intercuartil (IQR).

Resultados

De 34 animales (no 18 machos, no 16 hembras) de seis camadas expuestas al insulto, ocho animales (24%; n 4 machos, no 4 hembras) en el grupo lesionado murieron durante el segundo período de hipoxia (n x 5), durante el manejo de la temperatura (n x 2), o durante la noche después del insulto (n x 1). En el grupo de lesionados, nueve de los 26 supervivientes (35%) tenía una lesión grave visible. Cinco animales (n 5 machos) tenían lesiones moderadas, y cuatro animales (n 2 machos, no 2 hembras) tenían lesiones graves, ...

Discusión

Debido a las similitudes físicas y de desarrollo compartidas entre el cerebro hurón y el cerebro humano, el hurón se utiliza cada vez más para modelar lesiones cerebrales adultas y del desarrollo. ^8,9,10,11,12. Sin embargo, la investigación hasta la fecha sugiere que el cerebro hurón es a la vez resistente a la lesión inicial, así como altamente plást...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
80% Oxygen	Praxair
9% Oxygen	Praxair
Absorbent benchtop protector	Kimtech	7546
Automated catwalk	Noldus
Betadine surgical scrub
Bupivacaine	Patterson Veterinary	07-888-9382
Buprenorphine
Calipers	SRA Measurement Products	ME-CAL-FP-200	200 mm range, 0.01 mm resolution
Cotton Gauze Sponge	Fisher Scientific	22028556
Curved fine hemostat	Roboz	RS-7101
Curved forceps	World Precision Instruments	501215
Curved suture-tying hemostat	Roboz	RS-7111
Ethovision tracking software	Noldus
Eye Lubricant	Rugby	NDC 0536-1970-72
Ferrets (Mustela putorius furo)	Marshall Biosciences		Outbred (no specific strain)
Formalin	Fisher Scientific	SF100-4	10% (Phosphate Buffer/Certified)
Hair Clippers	Conair	GMT175N
Insulin Syringes	BD	329461	0.3 cc 3 mm 31 G
Isoflurane	Piramal	66794-017-25
Lidocaine	Patterson Veterinary	07-808-8202
LPS	List Biological	LPS Ultrapure #423
Oxygen sensor	BW Gas Alert	GAXT-X-DL-2
Pentobarbital
Plastic chamber	Tellfresh	1960	10 L; 373 x 270 x 135 mm3
Saline Solution, 0.9%	Hospira	RL-4492
Scalpel blade	Integra Miltex	297
Scalpel handle	World Precision Instruments	500236	#3, 13 cm
Sterile suture	Fine Science Tools	18020-50	Braided Silk, 5/0
Surgical clip applicator	Fine Science Tools	12020-09
Surgical clip remover	Fine Science Tools	12023-00
Surgical drapes	Medline Unidrape	VET3000
Surgical gloves	Ansell Perry Inc	5785004
Surigical clips	Fine Science Tools	12022-09
Thermometer (rectal)	YSI	Precision 4000A
Thermometer (water)	Fisher Scientific	14-648-26
Umbilical tape	Grafco	3031	Sterile
Water bath	Thermo Scientific	TSCOL19	19 L