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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

La traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) permite un aislamiento rápido y eficiente del ARNm de traducción específico del tipo de célula. Aquí, demostramos un método que combina la inyección hidrodinámica de cola-vena en un modelo de ratón de repoblación hepática y TRAP para examinar el perfil de expresión de los hepatocitos repoblados.

Resumen

La repoblación hepática después de una lesión es una característica crucial de los mamíferos que evita la falla inmediata de los órganos y la muerte después de la exposición de toxinas ambientales. Una comprensión más profunda de los cambios en la expresión génica que se producen durante la repoblación podría ayudar a identificar dianas terapéuticas para promover la restauración de la función hepática en el entorno de lesiones. Sin embargo, los métodos para aislar específicamente los hepatocitos repobladores se ven inhibidos por la falta de marcadores celulares, números celulares limitados y la fragilidad de estas células. El desarrollo de la tecnología de traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) en conjunto con el modelo de ratón Fah-/- para recapitular la repoblación en el entorno de la lesión hepática permite el perfil de expresión génica de la repoblación Hepatocitos. Con TRAP, el ARNm de traducción específico del tipo de celda se aísla rápida y eficientemente. Desarrollamos un método que utiliza TRAP con aislamiento basado en afinidad de traducir mRNA de hepatocitos que expresan selectivamente la proteína fluorescente verde (GFP) con etiqueta de proteína ribosomal (RP), GFP:RPL10A. TRAP elude el largo período de tiempo requerido para la clasificación celular activada por fluorescencia que podría cambiar el perfil de expresión génica. Además, dado que sólo los hepatocitos repobladores expresan la proteína de fusión GFP:RPL10A, el ARNm aislado está desprovisto de contaminación de los hepatocitos heridos circundantes y otros tipos de células en el hígado. El ARNm purificado por afinidad es de alta calidad y permite el análisis basado en la secuenciación descendente de PCR o de alto rendimiento de la expresión génica.

Introducción

Como el principal órgano metabólico en vertebrados, el hígado es responsable de la homeostasis de glucosa, síntesis de proteínas séricas, secreción de ácido biliar, y metabolismo xenobiótico y desintoxicación. El hígado posee una capacidad extraordinaria para regenerar el parénquima lesionado al exponerse a toxinas para prevenir la insuficiencia hepática inmediata1. Sin embargo, el fracaso de la regeneración puede ocurrir en el entorno de paracetamol o consumo excesivo de alcohol, que puede conducir a insuficiencia hepática aguda2. Además, la lesión hepática crónica causada por la infección por hepatitis viral, la enfermedad del hígado graso y la esteatohepatitis puede causar fibrosis hepática, cirrosis y carcinoma hepatocelular3. El único tratamiento curativo disponible para la enfermedad hepática terminal es el trasplante, pero está limitado por la escasez de órganos, lo que impide un tratamiento eficiente para todos los pacientes4. Por lo tanto, una mejor comprensión del proceso de recuperación después de una lesión hepática tóxica es crucial para el desarrollo de tratamientos para estimular la regeneración suficiente para la función de rescate en el órgano enfermo.

El sistema modelo más ampliamente aplicado para el estudio de la regeneración hepática es la hepatectomía parcial en roedores, en la que una gran proporción del hígado se resecta para estimular la rápida expansión de los hepatocitos5. Sin embargo, la hepatoectomía parcial no recapitula la expansión de los hepatocitos después de una lesión hepática tóxica debido a la falta de infiltración de células inmunitarias y necrosis celular de hepatocitos a menudo observada en el entorno de lesión hepática aguda en humanos6. Un sistema más adecuado para modelar esta forma de renovación de órganos es el ratón Fah-/-, que carece de fumarylacetoacetato hidrolasa funcional (FAH) necesario para el metabolismo adecuado de la tirosina y desarrolla daño hepático grave que conduce a la muerte7. Estos ratones se pueden mantener en un estado saludable indefinidamente por el tratamiento con el medicamento nitisinona en el agua potable. Alternativamente, la expresión DE FAH se puede restaurar mediante la entrega transgénica a un subconjunto de hepatocitos, que se expandirán para repoblar el hígado tras la eliminación de nitisinona8.

Para perfilar los cambios en la expresión génica de los hepatocitos repoblados, se requiere una herramienta para aislar específicamente los hepatocitos replicantes en el ratón Fah-/- sin contaminación de los hepatocitos heridos vecinas y otros tipos de células. Desafortunadamente, la clasificación celular asistida por fluorescencia (FACS) de hepatocitos es difícil ya que (1) la fragilidad de repoblar hepatocitos conduce a una mala recuperación después de la perfusión hepática, (2) replicar hepatocitos son muy variables en tamaño, haciendo que el aislamiento de una población pura por FACS difícil, y (3) el tiempo de procedimiento de la perfusión hepática al aislamiento de ARN es mayor que 2 h, por lo tanto los perfiles de expresión génica pueden sufrir cambios artificiales sustanciales antes de que se adquieran muestras9.

Alternativamente, la expresión de ribosomas etiquetados con epítopos específicamente en la repoblación de hepatocitos permite el aislamiento rápido de traducir activamente el ARNm unido por ribosomas utilizando la purificación de afinidad inmediatamente después de la cosecha de órganos, con hígado a granel tejidos. Aquí, describimos un protocolo para realizar la purificación de afinidad de traducción-ribosoma (TRAP)10 seguido de la secuenciación de ARN de alto rendimiento (TRAP-seq), para aislar y perfilar específicamente el ARNm en la repoblación de hepatocitos en el Fah-/- ratón9. La coexpresión de proteína ribosomal con etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP:RPL10A) con FAH permite la purificación de afinidad de la traducción de ARNm unido por polisomas que contienen GFP:RPL10A. Este método evita cualquier paso de disociación celular, como la perfusión hepática para aislar los hepatocitos repobladores frágiles. En su lugar, utiliza lisis de tejido de órganoentero y anticuerpos para extraer rápidamente el ARN específicamente de las células diana. Por último, el aislamiento de ARNm abundante y de alta calidad a través de TRAP-seq permite que las aplicaciones posteriores, como el análisis de secuenciación, perfilen el cambio dinámico de la expresión génica durante el proceso de repoblación.

Protocolo

Todos los métodos que implican el uso de ratones son consistentes con las pautas proporcionadas por la IACUC de la Oficina Penn de Bienestar Animal de la Universidad de Pensilvania.

1. Preparación de reactivos

  1. Cicloheximida
    1. Para hacer 500 ml de 0,1 g/mL de cicloheximida, suspenda 50 mg de cicloheximida en 500 ml de metanol.
      PRECAUCION: La cicloheximida es extremadamente tóxica para el medio ambiente y puede causar malformación congénita. Todos los desechos y tampones que contengan cicloheximida deben recogerse para su eliminación adecuada.
      NOTA: La cicloheximida se puede almacenar a 4oC durante un máximo de 1 día. La cicloheximida inhibe la traducción.
  2. Ditiothreitol (TDT)
    1. Para hacer 1 ml de TDT de 1 M, suspenda 0,15 g de polvo de TDT en agua libre de RNase.
      PRECAUCION: La TDT puede causar irritación en la piel, los ojos y las vías respiratorias.
      NOTA: La TDT es un detergente. La TDT se puede almacenar a -20 oC. Se recomienda almacenar 1 M TDT en alícuotas de un solo uso de 50 l.
  3. Desoxicolato (DOC)
    1. Para hacer 10% DOC, suspenda 1 g de DOC en un tubo cónico de 50 ml y agregue agua libre de RNase hasta 10 ml. Agitar vigorosamente hasta que el polvo se disuelva.
      NOTA: La solución 10% DOC es ligeramente amarilla y se puede almacenar a temperatura ambiente (RT) durante un máximo de 1 año. Doc se utiliza para la lisis nuclear.
  4. Anticuerpos GFP
    1. Anticuerpos Aliquot GFP cuando se usa por primera vez. Congele las alícuotas y guárdelas a -80 oC.
      NOTA: Se recomienda almacenar 50 g de anticuerpos GFP en alícuotas de un solo uso.
  5. Proteína biotinilada B L
    1. Resuspenda la proteína biotinilada L en 1 solución salina tamponada con fosfato (PBS) para realizar la concentración final de 1 g/l.
      NOTA: La solución resuspendida se puede almacenar a -20 oC durante un máximo de 6 meses.

2. Preparación del tampón

  1. búfer de albúmina sérica bovina (BSA)
    1. Para hacer 50 ml de 3% de bsa bSA, agregue 1,5 g de polvo de BSA libre de IgG y proteasa en 40 ml de PBS seguido de vórtice. Después de disolver el BSA, agregue PBS a un volumen final de 50 ml.
      NOTA: El búfer de BSA se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de seis meses.
  2. Búfer de disección
    1. Para hacer 50 ml de tampón de disección, combine 5 ml de solución salina equilibrada (HBSS) de 10x Hank, 125 ml de 1 M 4-(2-hidroxietilo)-1-piperazineethanesulfónico ácido (HEPES), 1.750 ml de glucosa de 1 M y 200 ol de 1 M NaHCO3. Añadir agua libre de RNase a un volumen final de 50 ml.
      NOTA: El stock tampón de disección se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de seis meses.
    2. Inmediatamente antes de su uso, añadir 100 g/ml de 0,1 g/ml de cicloheximida y mantener en hielo.
  3. Tampón de alta sal
    1. Para hacer 50 ml de tampón de alta sal, añadir 1 ml de 1 M HEPES, 8,75 mL de 2 M KCl, 500 ml de 1 M MgCl2y 500 ml de 100% de polietilenglicol de no yelfenilo(Tabla de materiales)al agua libre de RNase.
      NOTA: El stock de tampón de alta sal se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de seis meses.
    2. Inmediatamente antes de su uso, añadir 0,5 l/ml de TDT de 1 M y 1 l/ml de cicloheximida de 0,1 g/ml. Mantenga el amortiguador fresco de alta sal en hielo.
  4. Tampón de baja sal
    1. Para hacer 50 ml de tampón de sal baja, añadir 1 ml de 1 M HEPES, 3,75 ml de 2 M KCl, 500 ml de 1 M MgCl2y 500 ml de 100% de polietilenglicol de no yelfenilo a 44,25 ml de agua libre de RNase.
      NOTA: El stock de tampón de sal baja se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de seis meses.
    2. Añadir 0,5 l/ml de TDT de 1 M y 1 l/ml de cicloheximida de 0,1 g/ml antes de su uso. Mantenga el tampón fresco bajo en sal en hielo.
  5. Tampón de lisis tisular de tejido
    1. Para hacer 50 ml de tampón de lisis tisular, combinar 1 mL de 1 M HEPES, 3,75 ml de 2 M KCl y 500 ml de 1 M MgCl2. Añadir agua libre de RNase a una final de 50 ml.
      NOTA: El stock tampón de disección se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de seis meses.
    2. Añadir 1 comprimido/10 ml de inhibidor de la proteasa libre de EDTA, 1 l/ml de 0,1 g/ml de cicloheximida, 10 ml/ml de inhibidores de la RNase cada uno inmediatamente antes de su uso. Mantenga el tampón de lisis de tejido fresco en hielo.

3. Conjugación de anticuerpos con cuentas magnéticas

  1. Anticuerpos
    1. Calcular la cantidad de anticuerpos GFP necesarios para todas las muestras y prepararse para una muestra adicional.
      NOTA: Para cada muestra, se requieren 50 g de cada anticuerpo GFP.
    2. Descongelar los anticuerpos GFP sobre hielo y girar a la velocidad máxima (>13.000 x g) durante 10 min a 4oC y transferir sobrenadores a un nuevo tubo de microcentrífuga.
      NOTA: El paso de preparación de anticuerpos se puede realizar antes de la preparación del cordón y los anticuerpos desconesdados se pueden mantener en hielo. Alternativamente, esta parte se puede realizar durante la incubación del cordón magnético y la proteína biotinilada L.
  2. Resuspender perlas magnéticas
    1. Resuspenda los perlas magnéticas(Tabla de Materiales)mediante pipeteo suave.
    2. Para cada muestra, utilice 150 s de perla magnética. Calcule el volumen de perlas magnéticas necesarias para todas las muestras y prepare una extra. Transfiera las perlas magnéticas resuspendidas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml o 2 ml. Si se requiere más de 1 ml para un experimento, divida la cantidad total en volúmenes iguales.
    3. Recoger cuentas en un soporte magnético durante >1 min y quitar el sobrenadante. Retire el tubo de microcentrífuga del soporte magnético y añada 1 ml de PBS seguido de pipeteo hacia arriba y hacia abajo para lavar las perlas. Recoger perlas en un soporte magnético durante >1 min y eliminar PBS.
  3. Preparación de perlas recubiertas de proteína En
    1. Para cada muestra, utilice 60 ml de proteína biotinilada L. Si la proteína L se resuspende previamente y se almacena a -20 oC, desconde la proteína L sobre hielo. Si la proteína L se resuspende antes de su uso, tome la cantidad necesaria para todas las muestras y prepare una adicional.
    2. Añadir el volumen calculado de proteína biotinilada L a las cuentas magnéticas resuspendidas y lavadas. Añadir 1x PBS para hacer el volumen final 1 mL si utiliza un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, o 1,5 ml si utiliza un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Incubar perlas magnéticas con proteína biotinilada L durante 35 minutos a RT en un rotatorio de tubo.
      NOTA: Los anticuerpos se pueden preparar en este paso mientras las cuentas se incuban con proteína biotinilada L.
    3. Recoger las cuentas recubiertas de proteína En L en un soporte magnético durante >1 min y eliminar el sobrenadante. Retire el tubo de microcentrífuga del soporte magnético y añada 1 ml de tampón BSA al 3% seguido de un suave pipeteo durante al menos 5 veces para lavar las perlas recubiertas de proteína En.
    4. Recoger las cuentas recubiertas en un soporte magnético durante >1 min y quitar el sobrenadante. Repita los pasos de lavado con 3% de BSA para otras 4 veces (un total de 5 veces).
  4. Encuadernación de anticuerpos
    1. Añadir la cantidad calculada de anticuerpos GFP en las cuentas recubiertas de proteína L e incubar durante 1 h a 4 oC en un rotator de tubo.
      NOTA: Después de la incubación de anticuerpos, tenga especial cuidado de no vórtice la matriz de afinidad.
    2. Durante la incubación, prepare el tampón bajo en sal calculando el volumen total requerido para todas las muestras y agregue 0,5 l/ml de TDT de 1 M y 1 L/ml de cicloheximida de 0,1 g/ml a un tampón de sal baja antes de su uso.
      NOTA: Se requieren 3 ml de tampón de sal baja para el lavado de cada tubo de perlas conjugadas con GFP y 200 l/muestra para la resuspensión de las perlas conjugadas con GFP. El tampón fresco bajo en sal se puede mantener en hielo durante un par de horas.
    3. Recoger la matriz de afinidad en un soporte magnético durante >1 min y quitar el sobrenadante. Agregue 1 ml de tampón de sal baja y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para lavar la matriz de afinidad. Recoja la matriz de afinidad en un soporte magnético durante >1 min y elimine el búfer de baja sal. Repita los pasos de lavado con tampón bajo en sal por otras 2 veces (un total de 3 veces).
    4. Resuspenda las perlas en el búfer de baja sal para que cada muestra tenga 200 ml de matriz de afinidad.
      NOTA: La matriz de afinidad se puede almacenar en 0.02% NaN3 a 4 oC durante un máximo de 2 semanas. La matriz de afinidad debe lavarse rápidamente en tampón de sal baja 3 veces y resuspenderse suavemente en un rotador de tubo a 4 oC durante al menos 10 minutos si la matriz de afinidad se prepara dentro de 1 semana o durante la noche si la matriz de afinidad se almacena durante más de 1 semana. El protocolo se puede pausar después de este paso.
      PRECAUCION: La azida sódica es extremadamente tóxica para el medio ambiente. El contacto con ácidos produce gas tóxico. Todos los desechos deben ser recogidos para su correcta eliminación.

4. Lisis de tejido hepático

  1. Preparación del búfer y configuración del equipo
    1. Calcule el número de tubos de microcentrífuga necesarios, etiquete y enfríe en hielo.
      NOTA: Por lo general, se requieren siete tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para cada muestra: 1 para el hígado diseccionado restante, 4 para 4 ml de lisato hepático homogeneizado y 2 para transferir supernatantes.
    2. Prepare un nuevo tampón de disección calculando el volumen total necesario para todas las muestras y añada 1 l/ml de cicloheximida de 0,1 g/ml. Coloque el tampón de disección fresco en hielo para mantener el frío durante todo el experimento.
      NOTA: Para cada muestra, se requieren 10 ml de búfer de disección.
    3. Prepare el tampón de lisis fresca calculando el volumen total requerido para todas las muestras y agregue 1 comprimido/10 ml de inhibidor de la proteasa libre de EDTA, 1 L/ml de 0,1 g/ml de cicloheximida y 10 ml/ml de inhibidores de la rnalosa cada una. Mantenga el tampón de lisis en hielo durante todo el experimento.
      NOTA: Para cada muestra, se requieren 4 ml de tampón de lisis.
    4. Configure la trituradora de tejido(Tabla de Materiales)para que los tubos de vidrio de politetrafluoroetileno (PTFE) se puedan colocar en hielo durante la homogeneización de piezas hepáticas. Ponga 4 ml de tampón de lisis fría en los tubos de vidrio PTFE.
  2. Repoblación de homogeneización hepática
    1. Eutanasia un ratón Fah-/- de 8 a 12 semanas de edad inyectado con el vector TRAP y repoblado durante 1 x 4 semanas con anestesia y luxación cervical de acuerdo con las pautas experimentales de animales aprobadas.
    2. Coloque el ratón sobre una placa de disección y rocíe el abdomen con 70% de etanol. Tienda de la piel y peritoneo bajo en el abdomen usando fórceps y utilizar tijeras para hacer una incisión transversal. Continúe cortando con las tijeras para hacer una solapa peritoneal ancha en forma de U, con cuidado de no cortar las vísceras. Voltee la solapa peritoneal sobre el esternón para exponer el hígado.
    3. Retire cuidadosamente el hígado con tijeras finas y fórceps y coloque rápidamente el tejido en tampón de disección fría para enjuagar. Para homogeneizar los tejidos congelados, mueva rápidamente la cantidad deseada de tejido hepático en tubos de vidrio PTFE con tampón de lisis fría sin descongelar el tejido.
      NOTA: El tejido diseccionado puede congelarse con flash y almacenarse a -80 oC después de lavarse con tampón de disección. El protocolo se puede pausar después de este paso.
    4. Pesar el hígado en una placa de Petri y aislar 200-500 mg de piezas de hígado y pasar a los tubos de vidrio PTFE. Coloque el tejido hepático restante en un tubo de microcentrífuga preenfriado y congele el flash.
    5. Homogeneizar las muestras en un homogeneizador motorizado a partir de 300 rpm para disociar los hepatocitos de la estructura hepática durante al menos 5 golpes. Baje el tubo de vidrio cada vez, pero tenga cuidado de no dejar que el pestillo se eleve por encima de la solución para evitar la aireación que podría causar desnaturalización de proteínas.
    6. Eleva la velocidad a 900 rpm para homogeneizar completamente los tejidos hepáticos durante al menos 12 golpes completos.
    7. Transfiera el lisado a los tubos etiquetados y preenfriados, con no más de 1 ml de lisado por tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Si se utilizan 4 ml de tampón de lisis, mantenga 1 tubo y flash congele los 3 tubos restantes.
      NOTA: Los lysates se pueden mantener en hielo hasta 1 h mientras se disección el siguiente animal y preparando lisados frescos. El hígado homogeneizado puede congelarse después de la etapa de lisis y almacenarse a -80 oC. Podría haber una disminución del 50% en el ARN aislado si se utilizan lisados congelados. El protocolo se puede pausar después de este paso.
  3. Lisis nuclear
    1. Centrifugar el lisado hepático a 2.000 x g a 4 oC durante 10 min y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga pretallado en hielo.
    2. Añadir 1/9 del volumen sobrenadante de 10% de polietilenglicol sin yellfenilo para hacer la concentración final 1% polietilenglicol de no yelfenilo y mezclar invirtiendo suavemente los tubos de microcentrífuga.
    3. Gire rápidamente los tubos de microcentrífuga y agregue 1/9 del volumen de la muestra de 10% DOC para hacer la concentración final 1% DOC y mezclar invirtiendo suavemente los tubos de microcentrífuga. Gire rápidamente por los tubos de microcentrífuga e incubar en hielo durante 5 min.
    4. Centrifugar el lisado nuclear a 20.000 x g a 4 oC durante 10 minutos y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrípicos pretallado sobre hielo.
      NOTA: El sobrenadante agotante agotado en las mitocondrias se puede colocar en hielo durante un par de horas mientras se recogen las muestras restantes.

5. Inmunoprecipitación

  1. Para cada tubo, saque el 1% del volumen total del sobrenadante como control previo a la inmunoprecipitación para comparar el enriquecimiento objetivo después de la incubación con la matriz de afinidad. Colocar los controles de preinmunoprecipitación en un rotatorio de tubo a 4 oC durante la noche, de la misma manera que se procesan las muestras inmunopreciadas.
  2. Agregue 200 s de matriz de afinidad a cada muestra. Tenga especial cuidado de resuspender las cuentas mediante pipeteo suave antes de agregar la matriz de afinidad a cada muestra. Incubar los lysates con matriz de afinidad a 4oC durante la noche con una mezcla suave en un rotator de tubo.
    NOTA: El protocolo se puede pausar hasta un día después de este paso.

6. Aislamiento de ARN

  1. Preparación del búfer y configuración del equipo
    1. Coloque el estante magnético a 4 oC durante al menos 30 minutos para que se enfríe previamente y mantenga el estante en hielo durante todo el experimento.
    2. Calcular el número de tubos de microcentrífuga necesarios y pre-enfriar en hielo o a 4 oC.
      NOTA: Por lo general, cada muestra requiere 1 tubo de microcentrífuga para el ARN purificado final.
    3. Gire rápidamente por los tubos del paso 5.2 y recoja las perlas colocando en el bastidor magnético durante al menos 1 min. Recoger o desechar el sobrenadante en tubos de microcentrífuga adicionales.
      NOTA: El sobrenadante recogido que contiene fracción no enlazada puede congelarse y almacenarse a -80 oC para compararlo con la fracción enlazada para el enriquecimiento de transcripciones después de la purificación. El protocolo se puede pausar después de este paso.
    4. Prepare el tampón de alta sal añadiendo 0,5 l/ml de TDT de 1 M y 1 l/ml de cicloheximida de 0,1 g/ml a la culata de alta sal.
      NOTA: Para cada muestra, se requieren 5 ml de tampón de alta sal.
  2. Aislamiento de ARN
    1. Añadir 1 ml de tampón fresco de alta sal a cada tubo seguido de pipeteo suave durante al menos 5 veces sin introducir burbujas.
      NOTA: Un lavado insuficiente podría introducir antecedentes de transcripciones no enlazadas, mientras que la introducción de burbujas podría acelerar la degradación del ARN.
    2. Recoger cuentas en un soporte magnético durante >1 min y quitar el sobrenadante. Repita los pasos de lavado con tampón de alta sal por otras 4 veces (un total de 5 veces).
    3. Retire el tampón de alta sal restante y retire los tubos de microcentrífuga del soporte magnético y colóquelos en RT durante 5 minutos para calentarlos.
    4. Resuspenda las perlas en 100 ml de tampón de lisis (proporcionado en el kit de aislamiento de ARN) con el mercaptoetanol.
      NOTA: Cualquier kit de aislamiento y purificación de ARN que contenga el tiocianato de guanidina desnaturalizante se puede utilizar como un tampón de lisis para liberar el ARN enlazado de la matriz de afinidad. La extracción de ARN debe procesarse en RT ya que el tiocianato de guanidina puede cristalizarse a bajas temperaturas.
    5. Vortex las perlas y el tampón durante al menos 5 s a la velocidad más alta, gire rápidamente hacia abajo para recoger el tampón en el lado del tubo de microcentrífuga e incubar las perlas con el tampón en RT durante 10 minutos para liberar el ARN enlazado al cordón en el búfer de lisis.
    6. Recoger perlas en un soporte magnético durante >1 min y recoger el sobrenadante para proceder inmediatamente a la limpieza del ARN de acuerdo con el protocolo de purificación de ARN como se especifica en el kit(Tabla de materiales).
      NOTA: El sobrenadante que contiene el ARN eludido en el tampón de lisis también se puede almacenar a -80 oC durante un máximo de 1 mes antes de la limpieza calentando hasta RT al descongelarse.
    7. Para lograr la máxima calidad del ARN aislado, realice todos los pasos opcionales, incluyendo la digestión DNase y todos los pasos de elución de ARN. Caliente el tampón de elución proporcionado por el kit de aislamiento de ARN o agua libre de RNase a 60 oC para una recuperación máxima del ARN.
      NOTA: El ARN aislado se puede almacenar a -20 oC durante un máximo de 1 mes o -80 oC durante varios años. El protocolo se puede pausar después de este paso.

7. Análisis opcional de la calidad del ARN (recomendado)

  1. Evalúe la calidad del ARN utilizando un bioanalizador11 y la cantidad con un espectrofotómetro12 para determinar si es necesario repetir el proceso de inmunoprecipitación para obtener un ARN amplio y de alta calidad.
    NOTA: La calidad óptima del ARN para la secuenciación de alto rendimiento debe seguir los protocolos especificados por los kits de preparación de bibliotecas y las plataformas de secuenciación.

8. Aplicaciones posteriores

NOTA: El ARN total aislado por el protocolo TRAP se puede utilizar en una serie de aplicaciones descendentes estándar, incluyendo RNA-seq (TRAP-seq). La transcripción inversa estándar y los protocolos PCR cuantitativos también se pueden utilizar siguiendo trap.

  1. Para TRAP-seq, realice la preparación de la biblioteca RNA-seq de acuerdo con los métodos estándar13.
  2. Para RNA-seq, prepare bibliotecas de secuenciación de ADNc utilizando kits comerciales de ARN-seq con enriquecimiento basado en oligo d(T) de transcripciones poliadeniladas de poliadenilados. Alternativamente, si la calidad total del ARN es menor que la recomendada para el enriquecimiento de poli(A), utilice módulos de agotamiento de rRNA. Sin embargo, espere ver más alineación rRNA después de la secuenciación.

Resultados

Para perfilar la expresión génica en la repoblación de hepatocitos del ratón Fah-/-, la fusión Gfp:Rpl10a y los transgenes de Fah se entregan conjuntamente dentro de un plásmido que contiene transposón8 (vector TRAP) a los hígados por inyección hidrodinámica(Figura 1A). La eliminación de la nitisinona induce una lesión hepática tóxica que crea una presión de selecci?...

Discusión

TRAP-seq es una técnica para el aislamiento específico del tipo de celda de la traducción de ARNm a través de ribosomas etiquetados con epítopos y presenta una alternativa a los enfoques FACS, ya que elude limitaciones como los requisitos de tiempo de FACS9. En su lugar, TRAP permite el aislamiento rápido y eficiente del ARN directamente de los tejidos a granel, ayudando a evitar cualquier alteración en la expresión génica. TRAP-seq es especialmente adecuado para su uso en el repoblado h?...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW) y P30-DK050306 (Subvención piloto a KJW).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, CoatedDWK Life Sciences (Wheaton)358007
Absolutely RNA Miniprep KitAgilent400800
Anti-GFP antibodiesMemorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource CoreGFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7
Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-FreeJackson ImmunoResearch001-000-162
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche11836170001
CycloheximideMillipore SigmaC7698
Deoxycholic acid, DOCMillipore SigmaD2510
D-Glucose, DextroseFisher ScientificD16
DL-DithiothreitolMillipore SigmaD9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1Thermo Fisher Scientific65602
Fisherbrand Petri Dishes with Clear LidFisher ScientificFB0875712
HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol redThermo Fisher Scientific14065-056
HEPES, 1 M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo ScientificThermo Fisher ScientificAAJ16924AE
Magnesium chloride, MgCl2 Millipore SigmaM8266
MethanolFisher ScientificA452
NanoDrop 2000/2000c SpectrophotometerThermo Fisher ScientificVV-83061-00
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation ModuleNew England BioLabsE7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for IlluminaNew England BioLabsE7530S
Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630Millipore SigmaI8896
Nuclease-Free Water, not DEPC-TreatedAmbionAM9932
Overhead StirrerDWK Life Sciences (Wheaton)903475
PBS Buffer (10x), pH 7.4AmbionAM9625
Pierce Recombinant Protein L, BiotinylatedThermo Fisher Scientific29997
Potassium chloride, KClMillipore SigmaP4504
RNA 6000 Pico Kit & ReagentsAgilent5067-1513
RNaseZap RNase Decontamination SolutionInvitrogenAM9780
RNasin Ribonuclease InhibitorsPromegaN2515
Sodium azide, NaN3Millipore SigmaS2002
Sodium bicarbonate, NaHCO3Millipore SigmaS6297
SUPERase·In RNase InhibitorInvitrogenAM2694

Referencias

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