Aplicación de voltaje en el análisis de tamaño de partículas de dispersión de luz dinámica

Resumen

Aquí, se presenta un protocolo para aplicar voltaje a la solución durante las mediciones dinámicas de tamaño de partícula de dispersión de luz con la intención de explorar el efecto de los cambios de voltaje y temperatura en la agregación de polímeros.

Resumen

La dispersión dinámica de la luz (DLS) es un método común para caracterizar la distribución del tamaño de polímeros, proteínas y otras nanopartículas y micropartículas. La instrumentación moderna permite la medición del tamaño de las partículas en función del tiempo y/o la temperatura, pero actualmente no existe un método sencillo para realizar mediciones de distribución del tamaño de partícula DLS en presencia de voltaje aplicado. La capacidad de realizar este tipo de mediciones sería útil en el desarrollo de polímeros electroactivos sensibles a los estímulos para aplicaciones como la detección, la robótica blanda y el almacenamiento de energía. Aquí, se presenta una técnica que utiliza voltaje aplicado junto con DLS y una rampa de temperatura para observar cambios en la agregación y el tamaño de las partículas en polímeros termorresensibles con y sin monómeros electroactivos. Los cambios en el comportamiento de agregación observados en estos experimentos sólo fueron posibles a través de la aplicación combinada de control de voltaje y temperatura. Para obtener estos resultados, se conectó un potenciostato a una cubeta modificada para aplicar tensión a una solución. Los cambios en el tamaño de las partículas de polímero se monitorizaron utilizando DLS en presencia de voltaje constante. Simultáneamente, se produjeron datos actuales, que podrían compararse con los datos de tamaño de partícula, para comprender la relación entre el comportamiento actual y el de las partículas. El polímero poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAM) sirvió como polímero de prueba para esta técnica, ya que la respuesta de pNIPAM a la temperatura está bien estudiada. Se observan cambios en el comportamiento de agregación de la temperatura de la solución más baja crítica (LCST) de pNIPAM y poli(N-isopropylacrylamide)-bloque-poly(ferrocenylmethyl metacrilate), un bloque-copolímero electroquímicamente activo, en presencia de tensión aplicada. Comprender los mecanismos detrás de estos cambios será importante cuando se trata de lograr estructuras de polímeros reversibles en presencia de voltaje aplicado.

Introducción

La dispersión dinámica de la luz (DLS) es una técnica para determinar el tamaño de las partículas mediante el uso de cambios aleatorios en la intensidad de la luz dispersada a través de la solución^1. DLS es capaz de medir la agregación de polímeros mediante la determinación del tamaño de partícula. Para este experimento, DLS se combinó con cambios de temperatura controlados para observar cuando un polímero se agrega que es indicativo de exceder la temperatura crítica más baja de la solución (LCST)^2,3. Debajo del LCST, existe una fase líquida homogénea; por encima del LCST, el polímero se vuelve menos soluble, agrega y se condensa fuera de la solución. Se introdujo una tensión aplicada (es decir, un potencial aplicado o un campo eléctrico) en todo el campo de dispersión para observar los efectos del campo eléctrico en el comportamiento de la agregación y LCST. La aplicación de voltaje en mediciones de tamaño de partículas permite nuevos conocimientos sobre el comportamiento de las partículas y las aplicaciones posteriores en los campos de sensores, almacenamiento de energía, sistemas de suministro de fármacos, robótica suave y otros.

En este protocolo, se utilizaron dos polímeros de ejemplo. Poly(N-isopropylacrylamide), o pNIPAM, es un polímero sensible térmicamente, que contiene tanto un grupo de amida hidrófilo como un grupo isopropílico hidrófobo en la cadena macromolecular^4,5. Materiales de polímeros sensibles térmicamente como pNIPAM han sido ampliamente utilizados en la liberación controlada de fármacos, separación bioquímica, y sensores químicos en los últimos años^3,4. El valor bibliográfico de LCST de pNIPAM es de alrededor de 30-35 oC⁴. pNIPAM no suele ser electroquímicamente activo. Por lo tanto, como un segundo polímero de muestra se añadió un bloque electroquímicamente activo al polímero. Específicamente, se utilizó el metacrilato de ferrocenilmetilpara para crear unbloquede poli(N-isopropylacrilamide)- poli(ferrocenylmethyl metacrilate) o p(NIPAM-b-FMMA)^6,7. Ambos polímeros de ejemplo fueron sintetizados por la polimerización reversible de transferencia de cadena de fragmentación de adición con longitud de cadena controlada^8,9,10. El polímero no electroquímicomente activo, pNIPAM, fue sintetizado como 100 mer pNIPAM puro. El polímero electroquímicamente activo, p(NIPAM-b-FMMA), también tenía una longitud de cadena de 100 mer, que contiene 4% de metacrilato ferrocenylmetil (FMMA) y 96% NIPAM.

En este artículo, se demuestra un protocolo y una metodología para estudiar el efecto de la tensión aplicada en la agregación de polímeros. Este método también podría extenderse a otras aplicaciones de DLS, como el análisis de plegado/desdoblamiento de proteínas, interacciones proteína-proteína y aglomeración de partículas cargadas electrostáticamente por nombrar algunas. La muestra se calentó de 20 oC a 40 oC para identificar el LCST en ausencia y presencia de un campo aplicado de 1 V. A continuación, la muestra se enfrió de 40 oC a 20 oC sin interrumpir el campo aplicado para estudiar los efectos histéreticos o de equilibrio.

Protocolo

1. Ejemplo de preparaciones de polímeros

1. Síntesis de polímeros pNIPAM
   NOTA: Esta preparación produce 10 ml de solución de 1 g/L, lo que es suficiente para 3-4 experimentos.
   1. Preparen el aparato de la línea Schlenk. Asegúrese de que el matraz Dewar de la trampa fría esté lleno de una mezcla de hielo seco y acetona, o si se utiliza una trampa de refrigeración mecánica, asegúrese de que la trampa ha alcanzado una temperatura adecuada.
   2. En un matraz de fondo redondo de 50 ml, añadir 0.566 g de N-isopropylacrilamida (NIPAM) monómero, 0.016 g de polimerización de transferencia de cadena de fragmentación de adición reversible (RAFT) agente (tritiocarbonato de butilo phthalimidomethyl), 0.0008 g de 2,2-azobis(2-metilpropionitrilo) (AIBN) y 10 mL de 1,4 dioxane. Ponga una barra de agitación en el matraz. Selle el matraz con un tabique de goma, envuelva con cinta adhesiva y disuelva los monómeros en 1,4-dioxano.
   3. Realice la desgasificación de congelación-bomba-desgasificación de la siguiente manera: Congele la solución sumergiendo el matraz de fondo redondo en un matraz Dewar que contenga una mezcla de hielo seco y metanol. Una vez que todo el material esté congelado, utilice el colector de vacío de la línea Schlenk para evacuar el matraz a una presión interna inferior a 100 kPa. Aísle el matraz y descontese bajo vacío estático, utilizando agua tibia. Devuelva el matraz a la presión atmosférica utilizando el colector de nitrógeno de la línea Schlenk.
   4. Repita el paso 1.1.3 tres veces para minimizar la concentración interna de oxígeno.
   5. Sparge la solución con nitrógeno para equilibrar la presión a la atmósfera. Calentar la mezcla a 85oC con un baño de aceite y remover a 200 rpm durante 36 h.
   6. A un vaso de precipitados de 50 ml, añadir 40 ml de hexano. A continuación, agregue la mezcla de polímero según la gota de hexano. El pNIPAM debe precipitarse como flocula blanca.
      NOTA: El monómero NIPAM es soluble en hexano, pero el pNIPAM tiene una baja solubilidad en el hexano.
   7. Vierta la mezcla turbia en un embudo de B-chner para recoger el polvo blanco de pNIPAM. Transfiera el polvo a un vial de 20 ml y colóquelo en un horno al vacío durante la noche para eliminar el disolvente sobrante. Conservar en un recipiente sellado a temperatura ambiente hasta que sea necesario.
2. pNIPAM-bloque-poli(ferrocenylmethyl metacrylate) bloque-copolímero (p(NIPAM-b-FMMA)) síntesis
   NOTA: Esta preparación produce 10 ml de solución de 1 g/L, lo que es suficiente para 3-4 experimentos.
   1. Preparen el aparato de la línea Schlenk. Asegúrese de que el matraz Dewar de la trampa fría esté lleno de una mezcla de hielo seco y acetona, o si se utiliza una trampa de refrigeración mecánica, asegúrese de que la trampa ha alcanzado una temperatura adecuada.
   2. En un matraz de fondo redondo de 50 ml, añadir 0,057 g de metacrilato de ferrocenylmetil (FMMA) monómero, 0,016 g de agente RAFT, 0,0008 g de AIBN y 10 ml de 1,4 dioxanos. Ponga una barra de agitación en el matraz. Selle el matraz con un tabique de goma, envuelva con cinta adhesiva y disuelva los monómeros en 1,4-dioxano.
   3. Realice la desgasificación de congelación-bomba-desgasificación de la siguiente manera: Congele la solución sumergiendo el matraz de fondo redondo en un matraz Dewar que contenga una mezcla de hielo seco y metanol. Una vez que todo el material esté congelado, utilice el colector de vacío de la línea Schlenk para evacuar el matraz a una presión interna inferior a 100 kPa. Aísle el matraz y descontese bajo vacío estático, utilizando agua tibia. Devuelva el matraz a la presión atmosférica utilizando el colector de nitrógeno de la línea Schlenk.
   4. Repita el paso 1.2.3 tres veces para minimizar la concentración interna de oxígeno.
   5. Sparge la solución con nitrógeno para equilibrar la presión a la atmósfera. Calentar la mezcla a 85oC con un baño de aceite y revolverla durante 10 h.
   6. Disolver 0,543 g de NIPAM y 0,0002 g de AIBN en 3 ml de 1,4 dioxanos. Añadir la solución en el matraz bajo nitrógeno y esparcer durante 30 min. Calentar la mezcla a 85oC con un baño de aceite y agitarla a 200 rpm durante otras 36 h.
   7. Añadir 40 ml de hexano a un vaso de precipitados de 50 ml. A continuación, agregue la mezcla de polímero según la gota de hexano. El p(NIPAM-b-FMMA) debe precipitarse como polvo marrón porque el monómero FMMA tiene un color amarillo oscuro.
      NOTA: Los monómeros NIPAM y FMMA son solubles en hexano, pero p(NIPAM-b-FMMA) tiene baja solubilidad en el hexano.
   8. Vierta la mezcla morena amarilla en un embudo de B-chner para recoger el polvo marrón p(NIPAM-b-FMMA). Transfiera el polvo a un vial de 20 ml y colóquelo en el horno al vacío durante la noche para eliminar el disolvente sobrante. Conservar en un recipiente sellado a temperatura ambiente hasta que sea necesario.

2. Preparación de la muestra Y la cubeta DLS

NOTA: Esta sección prepara la cubeta para la tensión aplicada y la muestra para las mediciones DLS.

1. Mida 10 mg de polímero en polvo y disolver en 10 ml de agua desionizada filtrada (DI). Ponga la mezcla en un refrigerador durante la noche. Cuando esté listo para comenzar el experimento, mantenga la muestra en hielo.
   NOTA: La concentración de polímeros utilizada en estos experimentos fue de 1 g/L, pero el rango óptimo de concentraciones para cada muestra será único. Además, la mejor práctica es mantener el polímero por debajo del LCST hasta que esté listo para la prueba.
2. Cortar dos piezas de cinta de cobre de una sola cara de 6,3 mm x 7 cm(Figura 1). Utilice pinzas para pegar cada pieza a lados opuestos del interior de la cubeta de muestra DLS, perpendicular a la trayectoria de luz. La parte inferior de la cinta debe llegar cerca de la parte inferior de la cubeta. Doble los bordes de la cinta de cobre sobre la parte superior de la cubeta. Asegúrese de que la cinta de cobre esté cerca/envuelta en la parte superior de la cubeta de muestra para garantizar un buen contacto eléctrico. Asegúrese también de que la cinta de cobre no se conecte con los contactos metálicos asociados con el equipo DLS utilizado para las mediciones potenciales de Zeta.
3. Lave la cubeta con agua DI tres veces, luego quita el exceso de agua con un Kimwipe.

3. Controles de instrumentos DLS y configuración

NOTA: Se recomienda completar tres controles antes de ejecutar cada experimento DLS: (1) solución de agua en blanco; (2) un estándar de tamaño; (3) medición del polímero antes del inicio de una rampa de temperatura o tensión aplicada. Consulte el manual del instrumento antes de operar para obtener instrucciones sobre cómo preparar una muestra, elegir la configuración y evaluar la calidad de la muestra y los datos.

1. Transfiera 1,5 ml de disolvente filtrado a la cubeta. Use agua DI.
2. Inserte la cubeta en el soporte de la cubeta, asegurando que la pequeña flecha en la parte superior de la cubeta esté alineada con el soporte de la cubeta. Cierre la tapa.
3. En el software Zetasizer, seleccione Medir en la barra de herramientas. Se configuraron mediciones manuales para los controles. Establezca la Temperatura en el punto de partida experimental. Seleccione 20 oC para este experimento.
4. Una vez que el texto en la parte inferior de la ventana dice, Insertar celda y presione iniciar cuando esté listo,presione el botón de inicio del triángulo verde en la parte superior de la pantalla. Esto inicia el experimento, y el soporte de la cubeta no debe abrirse después de esto.
5. Haga clic en la pestaña Multi-view para observar los resultados en tiempo real. Supervise continuamente la calidad de la muestra y los datos observando la tasa de recuento y la función de correlación. Debido a que esta muestra es sólo disolvente, no se debe observar ninguna señal clara correspondiente a la presencia de partículas.
6. Agregue dos gotas de una solución estándar a la cubeta o simplemente utilice el control de agua, y repita los pasos 3.2-3.6. Utilice un estándar de 20 nm de poliestireno trazable en el NIST para este experimento.
   NOTA: Si las ejecuciones de control de agua o solución estándar muestran datos que son incoherentes con los resultados esperados, solucione el error y repita hasta que los controles se lean según lo esperado.
7. Enjuague la cubeta y añada la solución de polímero/prueba filtrada. Repita los pasos 3.2-3.5. Debe observarse una medición clara de la solución de ensayo inicial. Se recomienda hacer esto antes de cualquier rampa de temperatura o voltaje aplicado para una medición de línea base.

4. Configuración de DLS SOP

NOTA: Esta sección se refiere específicamente a la operación de rampa de temperatura de un instrumento Malvern Zetasizer NanoZS DLS. Antes de iniciar los experimentos, se recomienda encarecidamente consultar el manual del instrumento ampliamente para obtener orientación sobre cómo seleccionar una celda, preparar una muestra, elegir la configuración de medición y evaluar la calidad de la muestra y los datos.

1. En el software Zetasizer (versión 7.11), elija File (Archivo)y, a continuación, haga clic en New (Nuevo) para configurar un nuevo SOP(Figura 2).
2. Haga clic en Tipo de medida para seleccionar Tendencia > Temperatura > Tamaño.
3. En Material, elija el material adecuado y el índice de refracción. Elija Protein y el índice de refracción (RI) de 1.450 para este experimento. Si se desean valores exactos para el índice de refracción para un cálculo más preciso de la distribución del volumen, el experimentador debe determinar el índice de refracción de su muestra experimentalmente.
4. En Dispersant, elija el disolvente adecuado. Elija Agua como disolvente en este experimento.
5. En Cell, elija la cubeta que se está utilizando. Utilice cubetas desechables (DTS0012) para este experimento.
6. En Secuencia, establezca Temperatura de inicio y Temperatura final. Para los experimentos de calentamiento, ajuste la temperatura de inicio a 20 oC y establezca la temperatura de finalización en 40 oC. Para los experimentos de enfriamiento, elija lo contrario. Desmarque la casilla Volver a la temperatura de arranque.
7. Seleccione un intervalo para cada cambio de paso de temperatura. Para estos experimentos, seleccione 1,5 oC.
8. En Medición de tamaño, establezca Tiempo de equilibrio. Para estos experimentos, establezca la duración en 120 s. Elija el número de mediciones. Elija 3 medidas y Automático para la duración de la medición.
9. Guarde SOP y, a continuación, cierre el archivo.
10. Si se va a utilizar la tensión aplicada, configure el potenciostato (Sección 5) antes de continuar.
11. Una vez configurado el potenciostato, o si no se utiliza el voltaje aplicado, vuelva al software Zetasizer y haga clic en Medir en la barra de herramientas y, a continuación, haga clic en Iniciar SOP.
12. Una vez que el texto en la parte inferior de la ventana SOP dice, Insertar celda y presione iniciar cuando esté listo,presione el botón de inicio del triángulo verde en la parte superior de la pantalla. Esto inicia el experimento, y el soporte de la cubeta no debe abrirse después de esto.
13. Haga clic en la pestaña Multi-view para observar los resultados en tiempo real. Supervise continuamente la calidad de la muestra y los datos observando la tasa de recuento y la función de correlación. Vea las figuras 3-5 para obtener resultados experimentales representativos.

5. Configuración de potenciostato

NOTA: Se recomienda utilizar el mismo ordenador para el tamaño de partícula y las operaciones de voltaje aplicado para sincronizar el tiempo de los datos y así facilitar su evaluación posterior. Consulte los manuales de instrumentos de voltaje aplicados para obtener orientación sobre la configuración del cableado, la consulta de software y la elección de los parámetros adecuados. En estos experimentos se utilizó un potenciostato Gamry.

1. Prepare dos cables que sean lo suficientemente delgados como para caber a través de la pequeña grieta en el borde superior derecho del área del soporte de la cubeta DLS(Figura 6). En un extremo del cable preparado, quite el aislamiento para permitir una conexión con el potenciostato. En el extremo opuesto, soldar una abrazadera de caimán corto al cable y conectar a la cubeta. Asegúrese de que la tapa de la muestra DLS esté cerrada.
2. Sujete el cable de potenciostato de referencia blanco y el potenteatosta de contador rojo que conducen a uno de los cables preparados. Sujete el cable de potenciostato de trabajo verde y el potenciostato de sentido de trabajo azul conducen al otro cable preparado. Para este experimento, no utilice el sentido del contador naranja y los cables de potenciostato de tierra negro y déjelos flotando. Para asegurarse de que el circuito no se cortocircuita, estos cables no deben tocar ningún otro plomo o superficie conductora.
   NOTA: No importa a qué lado esté conectado cada cable.
3. En la barra de herramientas del software, haga clic en Experimentary, a continuación, haga clic en la opción E Electroquímica físicay seleccione Cronoamperometría. Para los fines de este protocolo, utilice un voltaje aplicado simple aplicando un solo voltaje con respuesta de corriente medida en el tiempo (es decir, cronoamperometría). Independientemente de la metodología electroquímica específica, se recomienda monitorear la respuesta del sistema a lo largo del tiempo.
   1. Establezca Prepaso, Paso 1y Paso 2 Voltaje vs Referencia. Esta será la tensión aplicada en todo el campo / cubeta. Establezca Voltaje en 1 V vs Referencia para los tres pasos.
   2. Establezca Tiempo de retardo prepaso. Para estos experimentos, ajuste a 0,5 s para asegurarse de que el sistema es estable en el voltaje deseado antes de grabar una señal.
   3. Establezca la hora para el paso 1 y el paso 2 tiempo. Esto controla cuánto tiempo se aplicará la tensión. Establezca ambos en 14.400 s para asegurarse de que el voltaje aplicado continuará a lo largo del experimento DLS.
   4. Establezca Período de muestra. Esta es la frecuencia con la que el gráfico leerá y registrará los valores de corriente y voltaje. Utilice 10.0 s en este experimento.
      NOTA: Los demás ajustes no son significativos para los datos que se presentan aquí. Se utilizaron los valores predeterminados en el sistema.
4. Haga clic en Aceptar. La barra de herramientas superior mostrará un signo activo, que indica que se está aplicando tensión. La corriente debe dar una respuesta moderada (A), y no sobrecargar el potenciostato. Si no se observa ninguna señal o señal excesiva, el sistema podría estar conectado incorrectamente y, por lo tanto, solucionar el error y repetir hasta que se observe la corriente esperada.
5. Vuelva al paso 4.10 para iniciar el SOP DE DLS.

6. Análisis de datos

NOTA: Esta sección detalla el análisis preliminar para comprender los datos obtenidos.

1. Importe datos al software de análisis y gráficos preferido.
2. Para cada ejecución dentro de un conjunto de mediciones a una temperatura determinada, determine el tamaño del volumen de partículas del pico con el porcentaje de volumen más grande.
3. Calcule la desviación media y estándar del tamaño del volumen sobre las tres mediciones registradas a una temperatura determinada.
4. Para cada experimento, el tamaño medio de la gráfica es la desviación estándar en el eje Y (escala de registro) frente a la temperatura en el eje X (escala lineal).
5. Importe los datos actuales de Gamry para su análisis. Trazar datos actuales con el tiempo en el eje X y la corriente (en microamperios) en el eje Y.
6. Para relacionar los datos actuales con los datos de tamaño de partícula, compare la marca de tiempo de los datos del Zetasizer con la marca de tiempo actual de Gamry. Esto es posible si los dos tipos de datos se recopilan desde el mismo equipo. De lo contrario, haga coincidir los tiempos registrados de la mejor manera posible.

Resultados

La salida de archivo en tiempo real de cada carrera en la rampa de temperatura se presenta como una tabla, como se ve en la Figura 3. Cada registro se puede elegir de forma independiente para ver el tamaño del volumen (Figura 4) y el coeficiente de correlación (Figura 5). La distribución del tamaño de partícula de volumen (PSD) es el dato más preciso para interpretar la distribución general y ...

Discusión

La aplicación de voltaje a soluciones pNIPAM o p(NIPAM-b-FMMA) cambió el comportamiento de agregación de polímeros en respuesta a la temperatura. Con ambos materiales, cuando había una tensión aplicada, el tamaño del volumen de los polímeros se mantuvo alto incluso cuando las soluciones se enfriaban por debajo de su LCST. Este fue un resultado inesperado, ya que los ensayos sin tensión mostraron que los polímeros regresaban a sus tamaños originales. Estos experimentos nos permiten concluir que para nu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-Isopropylacrylamide	Tokyo Chemical Industry CO., LTD	I0401-500G
1,4-Dioxane	Alfa Aesar	39118
2,2"-Azobis(2-methylpropionitrile)	SIGMA-ALDRICH	441090-100G
Cuvette	Malvern	DTS0012
Dynamic Light Scattering	Malvern	Zetasizer NanoZS
Ferrocenylmethyl methacrylate	ASTATECH	FD13136-1G
Phthalimidomethyl butyl trithiocarbonate	SIGMA-ALDRICH	777072-1G
Potentiostat	Gamry	Reference 600