Perfilado de Ubiquitina y Ubiquitina-como Modificaciones Post-traduccionales dependientes e Identificación de Alteraciones Significativas

Resumen

Este protocolo tiene como objetivo establecer proteomes específicos de ubiquitina (Ub) y ubiquitinas (Ubls) con el fin de identificar alteraciones de este tipo de modificaciones post-traduccionales (PtM), asociadas a una condición específica como un tratamiento o un fenotipo.

Resumen

Las modificaciones post-traduccionales dependientes de la ubiquitina (ub) y la ubiquitina (ubl) dependientes de las proteínas desempeñan un papel regulador biológico fundamental dentro de la célula mediante el control de la estabilidad de las proteínas, la actividad, las interacciones y la localización intracelular. Permiten a la célula responder a las señales y adaptarse a los cambios en su entorno. Las alteraciones dentro de estos mecanismos pueden conducir a situaciones patológicas graves como enfermedades neurodegenerativas y cánceres. El objetivo de la técnica descrita aquí es establecer perfiles de PTF dependientes de ub/ubls, de forma rápida y precisa, a partir de líneas celulares cultivadas. La comparación de diferentes perfiles obtenidos a partir de diferentes condiciones permite la identificación de alteraciones específicas, como las inducidas por un tratamiento, por ejemplo. La transducción celular mediada por Lentiviral se realiza para crear líneas celulares estables que expresan una versión de dos etiquetas (6His y Flag) del modificador (ubiquitina o ubl como SUMO1 o Nedd8). Estas etiquetas permiten la purificación de la ubiquitina y por lo tanto de proteínas ubiquitinadas de las células. Esto se hace a través de un proceso de purificación de dos pasos: El primero se realiza en condiciones de desnaturalización utilizando la etiqueta 6His, y el segundo en condiciones nativas usando la etiqueta Flag. Esto conduce a un aislamiento muy específico y puro de proteínas modificadas que posteriormente se identifican y semicuantifican mediante cromatografía líquida seguida de tecnología de espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). El fácil análisis informático de los datos de MS mediante el software Excel permite el establecimiento de perfiles PTM mediante la eliminación de señales de fondo. Estos perfiles se comparan entre cada condición con el fin de identificar alteraciones específicas que luego se estudiarán más específicamente, comenzando con su validación por técnicas de bioquímica estándar.

Introducción

El método propuesto aquí está dedicado a estudiar los PTM mediados por los miembros de la familia ubiquitina a partir de células de mamíferos cultivadas con el fin de identificar posibles alteraciones asociadas con una condición específica (tratamiento, diferenciación, etc.). Los PPT representan el último paso de regulación de las funciones de las proteínas¹. De hecho, una vez producidas por la maquinaria traslacional, la mayoría, si no todas las proteínas, se someten a diferentes tipos de MPT que modulan su actividad, interacciones moleculares y ubicación intracelular^1. Entre las plétolas de LOS PTM se encuentran las mediadas por la familia de proteínas ubiquitina, la ubiquitina en sí y todas las ubiquitinas, tienen el potencial de regular todas las proteínas intracelulares o parcialmente citoplasmáticas^2. Debido a que son en sí mismas proteínas, se pueden conjugar entre sí, formando cadenas homogéneas y heterogéneas de diversas topologías, cada una asociada con funciones reguladoras específicas^2. Se necesitan herramientas para tratar de descifrar y comprender esta compleja maquinaria. Muchos enfoques fueron desarrollados en todo el mundo, teniendo sus propias ventajas y desventajas, y aquí proponemos uno con alto rendimiento adecuado para células cultivadas.

La principal ventaja de este método es su precisión. De hecho, la pureza de las proteínas modificadas aisladas se ve muy mejorada por el uso combinatorio de las dos etiquetas (6His y Flag) y los dos pasos-procedimiento y por lo tanto es mucho más selectivo que una sola fusión de etiqueta Ub/Ubl^3,4. La presencia de la etiqueta 6His permite un primer paso de purificación en una condición de desnaturalización completa evitando así cualquier co-purificación de proteínas que contengan dominios de unión a ubiquitina u otras proteínas que se unen a los ubiquitinados. Este es un problema técnico encontrado por varios otros enfoques basados en la purificación de afinidad de proteomes ubiquitinados utilizando anticuerpos específicos⁵ o elementos de unión de ubiquitina en tándem (TUBEs)⁶. Es importante destacar que esta técnica no está sesgada a favor de la purificación de un determinado tipo de ubiquitinación, como podría ser el caso de algunos otros enfoques, ya que se identificaron tanto mono como diferentes tipos de poliubiquitinaciones⁷. En consecuencia, una vez que se encuentre, una alteración de la ubiquitinación tendrá que ser estudiada en más detalle por enfoques bioquímicos estándar con el fin de identificar el tipo exacto de ubiquitinación involucrada.

Por último, otra ventaja técnica de este protocolo es el uso de lentivirus, que crea fácil y rápidamente líneas celulares de expresión estables con un nivel razonable de expresiones de modificador etiquetado sin interferir con el comportamiento celular normal.

Mientras que un papel importante de la ubiquitinación es apuntar a las proteínas para la degradación proteasomal, ahora se sabe que tiene muchas otras propiedades reguladoras para potencialmente la mayoría de las proteínas intracelulares o parcialmente intracelulares¹. El número de estas funciones se incrementa aún más por la existencia de muchas ubiquitinas como proteínas, formando una familia de proteínas que regulan casi todos los mecanismos celulares¹. Sus alteraciones pueden tener un impacto drástico en la biología celular y pueden conducir o participar en situaciones patológicas^8,como el cáncer^9. Por lo tanto, se necesitan herramientas para explorar este vasto paisaje e identificar las alteraciones asociadas con una condición patológica que podría servir como nuevas dianas terapéuticas.

Este protocolo está dedicado a las células en el cultivo ya que necesitan ser transducidas para expresar exógena etiquetada Ub/Ubl. Una vez creadas, estas líneas celulares estables se pueden utilizar para generar perfiles Ubl a partir de cultivos en 2D o 3D o xenoinjertos, extendiendo así el horizonte de los diferentes modelos experimentales que se pueden aplicar para estudiar perfiles de PTM.

Protocolo

1. Generación de líneas celulares estables que expresan 6His-Flag-Ubl

NOTA: Co-transfección de células HEK-293T con pCCL-6HF-Ubl, pVSVG y delta-Helper.

1. Día 0: Seed 293T células en una placa de 6 pocillos para obtener 50-70% de confluencia al día siguiente.
2. Día 1: Células co-transfectas 50-70% de confluente con una mezcla de 1 g de pCCL-6HF-Ubl o pCCL-GFP, 1 g de pVSVG y 1 g de vectores delta-Helper, utilizando un reactivo de transfección y un protocolo para la producción de lentivirus. Después de 6 h de transfección, cambie el medio a uno fresco correspondiente a las células a transducir. Sembrar las células a transdujer en una placa de 6 pocillos con el fin de obtener una confluencia del 10-20% al día siguiente (el día de inicio de la transducción).
3. Día 2: 24 h después de la transfección, recuperar el medio que contiene partículas lentivirales y filtrar utilizando filtros de 0,45 m. Si es necesario, agregue un medio fresco en este punto para producir un segundo lote de lentivirus. Reemplace el medio de las células a transdujer (10-20% de confluencia) por la que contiene lentivirus.
   NOTA: El medio lentiviral puede mantenerse a +4 oC durante varios días antes de la transducción o almacenarse a -80 oC durante meses.
4. Incubar las células con lentivirus entre 24 h y 72 h en una incubadora estándar (37 oC, 5% CO₂), y luego cambiar el medio para uno estándar fresco. Si es posible, compruebe la expresión GFP utilizando un microscopio fluorescente invertido para evaluar la eficiencia de la transducción: porcentaje de células que expresan y nivel relativo de expresión por célula. Si no se detecta fluorescencia, espere 2-3 días adicionales, ya que la expresión puede tardar más tiempo dependiendo del tipo de células que se transduzca.
5. Si el control GFP es positivo, crezca todas las células hasta tener suficiente para realizar un control de expresión de 6HF-Ubl por inmunofluorescencia y western blot usando anticuerpos anti-Flag.

2. Doble purificación de proteínas modificadas

NOTA: Tampón 1: 6 M Guanidinium-HCl, 0.1 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 8.0, 0.5% Triton X-100.
Tampón 2: 50 mM NaH₂PO₄, 150 mM NaCl, 1% Tween20, 5% Glicerol, pH 8.0.
Zona de influencia 3: 100 mM NH₄HCO₃, pH 8,0.

1. Lisis celular: Una vez listo, lave los platos de cultivo al menos una vez con solución salina con fosfato (PBS) a temperatura ambiente (RT) y proceda a la lisis celular o, alternativamente, a la congelación del flash en líquido N₂ y guárdelos a -80 oC. Para la lisis, agregue 2 ml de tampón 1 por una placa de 15 cm en RT. Utilice un rascador de células para recuperar todos los lysates en tubos centrífugos cónicos de 50 ml (volumen final de unos 20 ml).
2. Sonicar los lysates tres veces durante 30 s separados por una pausa de 1 min.
3. Centrifugar los líticos sonicados a 15.000 x g durante 15 min.
4. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo usando un colador de células (40 m).
5. Determinar la concentración de las muestras y ajustar, si es necesario, para obtener la misma cantidad de proteínas y el mismo volumen. Utilizar una cantidad total de proteína entre 50 y 100 mg (10 platos con 15 cm de diámetro para las células MiaPaCa-2).
6. Añadir las perlas Ni²⁺-NTA, utilizando 2 l de perlas por cada 1 mg de proteína.
7. Gire a 30 rpm durante 2,5 h a RT.
8. Peletizar las perlas a 500 x g durante 5 min.
9. Lavar las perlas con 1 ml de Tampón 1, transfiriendo las muestras a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y, a continuación, transferir los tubos sobre hielo. Realice todos los siguientes pasos sobre hielo o a 4 oC.
10. Lavar dos veces con 1 ml de tampón de hielo 2 que contiene 10 mM de imidazol.
11. Para eluir proteínas unidas, añadir 600 ml de tampón 2 que contenga 250 mM de imidazol y girar durante 2 h a 4 oC.
12. Reventar las perlas por centrifugación a 500 x g durante 1 min. Transfiera los sobrenatantes a nuevos tubos conjugados de 1,5 ml preenfriados y añada 50 ml de perlas conjugadas con anticuerpos anti-Bandera M2.
13. Gire a 30 rpm durante 2,5 h a 4 oC y, a continuación, lave 2 veces con 500 ml de tampón 2 y, a continuación, 2 veces con 500 oC de tampón 3.
14. Para la elución final, agregue 100 ml de Tampón 3 que contenga un péptido de bandera a 0,1 g/l y gire a 4 oC durante 1,5 h.
15. Centrifugar a 500 x g durante 1 min y transferir los sobrenatantes a nuevos tubos preenfriados.
16. Tomar 10% (10 l) para cargar en SDS-PAGE y realizar una tinción de plata del gel para controlar la calidad de purificación. Si la purificación se ve bien, analice el 90% dejado por LC-MS/MS.

3. Procesamiento de datos de espectrometría de masas para generar perfiles de LOS PPT de Ub/Ubls e identificar diferencias significativas entre ellos

NOTA: Los resultados del análisis de LA MS contienen mucha información, incluyendo el número total de péptidos, así como los valores de área pico (media del área del péptido TOP 3¹⁰⁾para cada proteína identificada en cada muestra. Estos datos se pueden procesar utilizando los números de recuento de péptidos o los valores de área pico, o ambos. Para el cálculo con áreas pico, ya que estos valores están generalmente en el rango de 10⁶, es necesario dividirlos por este orden antes de aplicar las mismas fórmulas como las siguientes. Los resultados obtenidos con ambas metodologías de conteo deben mostrar una fuerte correlación como suele hacer. Para cada proteína identificada, utilice las siguientes fórmulas cuando:
v1 valores de péptidos en la muestra de ubiquitina no tratada (por ejemplo, Ub - fármaco)
v2 valores de péptidos en la muestra de ubiquitina tratada con Gemcitabina (por ejemplo, Ub + medicamento)
valores de péptidos k1 en la muestra de GFP de control no tratada (por ejemplo, GFP - medicamento)
valores de péptidos k2 en la muestra de GFP de control tratada con Gemcitabina (por ejemplo, GFP + medicamento).

1. Normalización: Normalizar los valores entre las células tratadas con fármacos y las células no tratadas para Ubiquitina y GFP utilizando las siguientes fórmulas. Normalizado v a V y k normalizado a K.
   V1-v1. (v1+ v2) / (2. v1) ; V2-v2. (v1+ v2) / (2. v2)
   K1-k1. (k1+ k2) / (2. k1) ; K2-k2. (k1+ k2) / (2. k2)
2. Eliminación del fondo: Utilizando las siguientes fórmulas, restar valores en la muestra de control (GFP) de los valores de la muestra de ubiquitina para obtener valores específicos (V'1 y V'2) para cada proteína identificada en ambas condiciones.
   V'1-V1-K1 si V1-K1-0 ; V'1-0 si V1-K1<0
   V'2-V2-K2 si V2-K2-0 ; V'2 s 0 si V2-K2<0
3. Variación (Var) de ubiquitinación. Para obtener una puntuación (entre -100 y +100) para las variaciones positivas y negativas de los MPT inducidas por un medicamento, utilice la siguiente fórmula en la que la diferencia entre los valores específicos de las muestras tratadas y no tratadas se divida por la suma de todos los valores, incluidos los de (para penalizar las proteínas también identificadas en el control de la PTF) y multiplicar por 100.
   Var (V'2-V'1)/(V1+K1+V2+K2)*100 ; -100Las variaciones por debajo de -50 (represión de La PTM) o superiores a 50 (inducción de La PTM) generalmente se consideran significativas.
4. Confianza (Conf). Utilice la siguiente fórmula para obtener un valor de confianza entre 0 y 100%,:
   Conf ((V1+V2)²/(1+V1+V2+K1+K2)²)*100 - 100/(1+V'1+V'2) ; 0 si <0
   Los valores superiores a 50 generalmente se consideran seguros.
5. Para obtener una distribución mejor de los valores de inducción/represión y tener en cuenta los parámetros de variación y confianza, multiplique los valores Var y Conf utilizando la siguiente fórmula donde V Var y C Conf
   SI (V2>0;((V2*C2)-2)/(10-6);-((V2*C2)-2)/(10-6))
   NOTA: Como los valores de área pico suelen ser más precisos que el recuento de péptidos, es posible utilizar software específico que se dedica a la interpretación de este tipo de datos como Perseo (https://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus), recomendaciones de uso.

Resultados

Transducción de células de mamíferos de cultivo para crear células de expresión de GFP y 6HF-Ub
Para producir lentivirus que se utilizarán más adelante para transducir las células MiaPaCa-2, las células HEK-293T confluentes del 70% se co-transtan con la misma cantidad de los tres vectores, pCCL-6HF-Ubiquitin o GFP/Delta-Helper/pvSvG. Después de 24 h de producción, el medio que contiene partículas lentivirales se recupera y filtra. Es posible en este punto c...

Discusión

Hemos desarrollado una metodología robusta y fiable para generar perfiles de proteínas modificados por los principales miembros de la familia ubiquitina. De hecho, hemos aplicado con éxito este protocolo para generar perfiles de PTM según ubiquitina, y también por SUMO y Nedd8, y para detectar alteraciones asociadas con un tratamiento^7,en respuesta a la sobreexpresión o derribo de un determinado gen (datos no y en las células que adquirieron un fenotipo resistente a diversos fármacos quimi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	Sigma-Aldrich	A2220-5ML	binds all Flag tagged proteins
anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165	to detect 6His-Flag tagged expression of ub/ubl
Cell strainer 40 µm	Falcon	352350	to remove floating pellet from guanidine lysed cells
Flag peptide	Sigma-Aldrich	F3290	elute flag tagged proteins from anti-flag beads
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	50933	chaotropic agent used to denature all proteins in cell lysate
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513	eluates 6His bond proteins from Ni-NTA beads
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	to transfect HEK-293T cells to produce lentiviruses
Lobind tubes	Sigma-Aldrich	Z666491	avoids absorption of precious material
Membrane Filter, 0.45 µm	Millipore	HAWP04700F1	to filter the lentiviral supernantant
Ni-NTA	Qiagen	30210	purification of the 6His tag