Protocolos de Bioimpresión 3D de Bioinks basados en Gelatin Methacryloyl Hydrogel

Resumen

Aquí se presenta un método para la bioimpresión 3D de gelatina metacriloyl.

Resumen

Gelatin methacryloyl (GelMA) se ha convertido en un biomaterial popular en el campo de la bioimpresión. La derivación de este material es gelatina, que se hidroliza a partir de colágeno de mamíferos. Por lo tanto, las secuencias de ácido arginina-glicina-aspártico (RGD) y los motivos diana de la matriz metaloproteinasa (MMP) permanecen en las cadenas moleculares, que ayudan a lograr la unión celular y la degradación. Además, las propiedades de formación de GelMA son versátiles. Los grupos de metacrilamida permiten que un material se retrete rápidamente bajo la irradiación de luz en presencia de un fotoiniciador. Por lo tanto, tiene mucho sentido establecer métodos adecuados para sintetizar estructuras tridimensionales (3D) con este material prometedor. Sin embargo, su baja viscosidad restringe la imprimibilidad de GelMA. Aquí se presentan métodos para llevar a cabo la bioimpresión 3D de hidrogeles GelMA, a saber, la fabricación de microesferas GelMA, fibras GelMA, estructuras complejas GelMA y chips microfluídicos basados en GelMA. Se discuten las estructuras resultantes y la biocompatibilidad de los materiales, así como los métodos de impresión. Se cree que este protocolo puede servir de puente entre los biomateriales aplicados previamente y GelMA, así como contribuir al establecimiento de arquitecturas 3D basadas en GelMA para aplicaciones biomédicas.

Introducción

Se cree que los hidrogeles son un material adecuado en el campo de la biofabricación^1,2,3,4. Entre ellos, la gelatina de metacriloyl (GelMA) se ha convertido en uno de los biomateriales más versátiles, propuesto inicialmente en 2000 por Van Den Bulcke et al.⁵. GelMA se sintetiza por la reacción directa de gelatina con anhídrido metacrílico (MA). La gelatina, hidrolizada por el colágeno mamífero, se compone de motivos diana de la matriz metaloproteinasa (MMP). Por lo tanto, los modelos de tejido tridimensional in vitro (3D) establecidos por GelMA pueden imitar idealmente las interacciones entre las células y la matriz extracelular (ECM) in vivo. Además, secuencias de ácido arginina-glicina-aspártico (RGD), que están ausentes en algunos otros hidrogeles como alginatos, permanecen en las cadenas moleculares de GelMA. Esto hace posible la fijación de células encapsuladas dentro de las redes de hidrogel⁶. Además, la capacidad de formación de GelMA es prometedora. Los grupos de metacrilamida en las cadenas moleculares GelMA reaccionan con el fotoiniciador en condiciones de reacción leves y forman enlaces covalentes al exponerse a la irradiación de luz. Por lo tanto, las estructuras impresas se pueden recruzar rápidamente para mantener las formas diseñadas de una manera sencilla.

Sobre la base de estas propiedades, una serie de campos utilizan GelMA para llevar a cabo diversas aplicaciones, tales como ingeniería de tejidos, análisis de citología básica, detección de drogas, y el bioensing. En consecuencia, también se han demostrado varias estrategias de fabricación^{7,8,9,10,11,12,13,14}. Sin embargo, sigue siendo difícil llevar a cabo la bioimpresión 3D basada en GelMA, que se debe a sus propiedades fundamentales. GelMA es un material sensible a la temperatura. Durante el proceso de impresión, la temperatura de la atmósfera de impresión debe ser estrictamente controlada para mantener el estado físico del biotinta. Además, la viscosidad de GelMA es generalmente menor que otros hidrogeles comunes (es decir, alginato, quitosano, ácido hialurónico, etc.). Sin embargo, otros obstáculos se enfrentan al construir arquitecturas 3D con este material¹⁵.

Este artículo resume varios enfoques para la bioimpresión 3D de GelMA propuestos por nuestro laboratorio y describe las muestras impresas (es decir, la síntesis de microesferas GelMA, fibras GelMA, estructuras complejas de GelMA y chips microfluídicos basados en GelMA). Cada método tiene funciones especializadas y se puede adoptar en diferentes situaciones con diferentes requisitos. Las microesferas GelMA son generadas por un módulo electroasistido, que forma una fuerza eléctrica externa adicional para reducir el tamaño de las gotas. En términos de fibras GelMA, son extruidas por una boquilla de bioimpresión coaxial con la ayuda de alginato de sodio viscoso. Además, el establecimiento de estructuras 3D complejas se logra con una bioimpresora de procesamiento de luz digital (DLP). Por último, se propone una estrategia de reticulación dos veces para construir chips microfluídicos basados en GelMA, combinando hidrogel GelMA y chips microfluídicos tradicionales. Se cree que este protocolo es un resumen significativo de las estrategias de bioimpresión GelMA utilizadas en nuestro laboratorio y puede inspirar a otros investigadores en campos relativos.

Protocolo

1. Cultivo celular

1. Preparar el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM), complementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% penicilina/estreptomicina, utilizado para cultivar líneas de células de cáncer de mama humana (MDA-MB-231) y líneas de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC).
2. Preparar DMEM con L-glutamina (DMEM/F-12), complementado con 10% FBS y 1% penicilina/estreptomicina, utilizado para cultivar líneas de células madre mesenquimales de médula ósea (BMSC).
3. Establezca el entorno de cultivo en 37 oC y 5% de CO_2. Cultivo MDA-MB-231, HUVEC y BMSC, y pasaje las celdas en una proporción de 1:2 cuando se alcanza la confluencia del 90%.

2. Fabricación de microesferas GelMA

1. Imprima el accesorio como Figura 1A con ácido poliláctico (PLA) en una impresora de modelado de deposición fusionada (FDM). Coloque dos electrodos de anillo metálico en el accesorio.
2. Conecte los dos electrodos de anillo metálico con polos de tierra y positivos, respectivamente. Coloque la placa de metal conectada con el alto voltaje por debajo del electrodo de anillo y coloque una placa Petri con aceite de silicio en la placa de metal como receptor de gotas.
3. Disolver GelMA liofilizado (5% p/v) y litio fenilo-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP, 0,5% p/v) en la solución salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS) como biotinta (10 ml). Filtrar el biotinta a través de un filtro de 0,22 m para la esterilidad y calentarlo en un baño de agua de 37 oC durante 15 minutos.
4. Separe las células MDA-MB-231 con 3 ml de solución EDTA de trippsina al 0,25% al 0,02% durante 3 min a 37 oC. Células centrífugas en un tubo centrífugo de 15 ml a 100 x g durante 5 min para obtener un pellet celular.
5. Retire el sobrenadante. Mezclar el pellet celular con 1 ml de biotinta preparada pipetándolo lentamente para evitar la producción de burbujas.
6. Coloque 1 ml de biotinta (MDA-MB-231) en una jeringa estéril de 3 ml. Alimentar el bioink por la fuerza del aire comprimido (0,5 kPa). Coloque la jeringa en el aparato.
   NOTA: El entorno de impresión debe controlarse estrictamente a una temperatura de 30 oC y una humedad del 50%.
7. Encienda la potencia de alta tensión y ajuste la tensión como 0 x 4 kV. Simultáneamente, encienda la luz de longitud de onda de 405 nm para retiquejar las gotas GelMA en 5 ml de aceite de silicio.
8. Vierta la mayor parte del aceite de silicio decantar el plato Petri. Transfiera el aceite de silicio restante y las microesferas GelMA en un tubo centrífugo de 15 ml usando una cuchara.
9. Añadir 5 ml de DPBS y agitar la mezcla uniformemente. Centrifugar el tubo a 100 x g durante 5 min y retirar el líquido sobrenadante.
10. Repita el paso 2.9 3x.
11. Saca las microesferas GelMA con una cuchara y enmócelas en DMEM en un plato de Petri a 37oC y 5% co₂ durante 3 días.
12. Deseche el medio y lave las microesferas con DPBS. Arreglo con 2 ml de 4% de paraformaldehído (PFA) durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
13. Deseche el PFA y lave las microesferas con DPBS. Permeabilizar con 2 ml de tensioactivo no iónico 0,5% (es decir, Tritón X-100) durante 5 min a RT.
14. Deseche el tensioactivo no iónico y lave las microesferas con DPBS. Mancharlos con 2 ml de tetrametilrhodamina (TRITC) faloideibida durante 30 minutos en oscuridad en RT.
15. Deseche el TRITC y lave las microesferas con DPBS. Estañégalos con 2 ml de 4–,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) durante 10 minutos en oscuridad en RT.
16. Deseche la DAPI y lave las microesferas con DPBS. Capture la morfología con un microscopio de fluorescencia confocal.

3. Fabricación de fibras GelMA

1. Prepare una boquilla coaxial como se muestra en la Figura 2A. Fijar una boquilla interna (25 G, OD a 510 m, ID a 250 m) y una boquilla exterior (18 G, OD a 1200 m, ID a 900 m) con soldadura. Conecte un tubo de vidrio (longitud de 50 mm, diámetro interior a 1,2 mm) al extremo de la boquilla coaxial.
2. Disolver el polvo de alginato de sodio (Na-Alg) esterilizado bajo luz ultravioleta (UV) durante 30 minutos en agua desionizada al 2% (p/v).
3. Prepare una solución de biotinta estéril siguiendo el paso 2.3. Calentar el bioink GelMA y la solución Na-Alg en un baño de agua de 37oC durante 15 min.
4. Separe las células BMSC s con 3 ml de 0.25% de solución EDTA de trippsina-0.02% durante 3 min a 37 oC. Células centrífugas en un tubo centrífugo de 15 ml a 100 x g durante 5 min para obtener un pellet celular.
5. Retire el líquido sobrenadante. Mezclar el pellet celular con 2 ml de biotinta GelMA preparada pipetándolo lentamente para evitar la producción de burbujas.
6. Coloque 2 ml de biotinta (Bmc) en una jeringa de 10 ml. Coloque 2 ml de solución de Na-Alg en otra jeringa (10 ml). Alimentarlos con dos bombas de jeringa, respectivamente (aquí, biotinta a 50 m/min y solución de Na-Alg a 350 m/min).
   NOTA: El entorno de impresión debe controlarse estrictamente a una temperatura de 30 oC y una humedad del 50%.
7. Encienda la luz de longitud de onda de 405 nm para irradiar el tubo transparente para retifichar las fibras GelMA. Utilice un plato de Petri con DPBS para recibir las fibras.
8. Saque las fibras GelMA con una cuchara de DPBS y escenifique durante 3 días en el DMEM/F-12 preparado a 37oC y 5% CO_2.
9. Siga los pasos 2.12-2.16 para preparar las fibras GelMA para la observación morfológica con un microscopio de fluorescencia confocal.

4. Fabricación de estructuras complejas 3D GelMA

NOTA: La Figura 3A muestra el boceto de fabricación de las complejas estructuras 3D GelMA.

1. Limpie la bioimpresora DLP(Figura 3E)con 75% de alcohol y expongala a la irradiación UV durante 30 minutos para la esterilidad.
2. Disolver el GelMA liofilizado (10% p/v) y el REVESTIMIENTO (0,5% p/v) en DPBS. Añadir pigmento comestible magenta en la solución (3% v/v) para mejorar la precisión de impresión.
3. Filtrar la solución a través de un filtro de 0,22 m para la esterilidad y calentarla en un baño de agua de 37 oC durante 15 minutos.
4. Construya los modelos 3D con el software de diseño asistido por ordenador (CAD). Importe los documentos del modelo al software superior (EFL) de la bioimpresora DLP aplicada.
5. Añadir 10 ml de biotinta preparada en la vaguada de la bioimpresora DLP.
6. Establezca los parámetros de impresión en el software superior de la siguiente manera: intensidad de la luz: 12 mW/cm², duración de la irradiación a 30 s y altura de la rebanada a 100 m. Comience a imprimir.
7. Retire la estructura impresa de la bioimpresora y sumerjala en DPBS en una placa Petri.
8. Separe las células MDA-MB-231s con 3 ml de solución EDTA de trippsina al 0,25% al 0,02% durante 3 min a 37 oC. Células centrífugas a 100 x g durante 5 min en un tubo de 15 ml para obtener un pellet celular.
9. Retire el líquido sobrenadante y mezcle el pellet celular con 2 ml de DMEM.
10. Añadir 100 l de suspensión celular en las estructuras impresas. Cultivarlos durante 3 días en el DMEM preparado a 37oC y 5% CO_2.
11. Siga los pasos 2.12-2.16 para preparar las complejas estructuras 3D para la observación morfológica con un microscopio de fluorescencia confocal.

5. Fabricación de chips microfluídicos basados en GelMA

NOTA: La Figura 4A muestra el boceto de fabricación del chip microfluídico basado en GelMA.

1. Disolver el GelMA liofilizado 10% (p/v) y la LAP (0,5% p/v) en DPBS. Filtrar la solución gelMA a través de un filtro de 0,22 m para la esterilidad.
2. Esterilice el polvo de gelatina bajo luz UV durante 30 min y agréguelo a la solución GelMA-LAP preparada en el paso 5.1 a una concentración final de gelatina del 5% (p/v). Calentar la mezcla en un baño de agua de 37oC durante 15 min.
3. Diseñe un grupo de moldes(Figura 4B,C)con software CAD y fíjelos con resina de fotopolímero en una impresora DLP.
4. Llene completamente los moldes con el biotinta preparado.
5. Poner los moldes en un refrigerador de 4 oC para recruzar la gelatina durante 30 minutos.
6. Retire los moldes y desmoldcon una cuchilla de las láminas de hidrogel reticuladas parcialmente (físicamente) de los moldes.
7. Combine las dos láminas de hidrogel desmoldeadas y atérelas con la ayuda de GelMA irradiando a 405 nm durante 1 min.
8. Separe las células HUVECs con 3 ml de solución EDTA de trippsina al 0,25% de trippsina-0,02% durante 3 min a 37 oC. Células centrífugas en un tubo centrífugo de 15 ml para obtener un pellet celular a 100 x g durante 5 min.
9. Retire el líquido sobrenadante y mezcle el pellet celular con 2 ml de DMEM.
10. Llene completamente el microcanal inyectando la suspensión celular con una boquilla y una jeringa.
11. Voltee el chip al revés cada 15 minutos durante las siguientes 3 h para lograr una sembración de celda uniforme y completa. Cultivo de las patatas fritas en el plato Petri durante 3 días en el DMEM preparado a 37oC y 5% CO_2.
12. Siga los pasos 2.12-2.16 para preparar los chips microfluídicos para la observación morfológica con un microscopio de fluorescencia confocal.

Resultados

Durante la fabricación de microesferas GelMA, las gotas GelMA fueron separadas por la fuerza de campo eléctrico externa. Cuando las gotas cayeron en el aceite de silicio receptor, permanecieron en forma de esferoides estándar sin colas. Esto se debe a que las gotas GelMA estaban en una fase acuosa, mientras que el aceite de silicio estaba en una fase de aceite. La tensión superficial que se formó entre las dos fases hizo que las gotas GelMA mantuvieran una forma esferoide estándar. En cuanto a las microesferas carg...

Discusión

Este artículo describe varias estrategias para fabricar estructuras GelMA 3D, a saber, microesferas GelMA, fibras GelMA, estructuras complejas GelMA y chips microfluídicos basados en GelMA. GelMA tiene una capacidad de biocompatibilidad y formación prometedora y es ampliamente utilizado en el campo de la biofabricación. Las estructuras de la microesfera son adecuadas para la liberación controlada de fármacos, el cultivo de tejidos y la inyección en organismos para la terapia posterior^21,

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter membrane	Millipore
2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride (DAPI)	Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China
3D bioprinter	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
405nm wavelength light	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
co-axial nozzle	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
confocal fluorescence microscope	OLYMPUS FV3000
digital light processing (DLP) bioprinter	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
DLP printer	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
Dulbecco's Modified Eagle Medium with L-glutamine (DMEM/F-12)	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
EFL Software	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
fetal bovine serum (FBS)	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
gelatin	Sigma-Aldrich, Shanghai, China
gelatin methacryloyl (GelMA)	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
high voltage power	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
lithium phenyl-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	SuZhou Intelligent Manufacturing Research Institute, SuZhou, China
paraformaldehyde	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
penicillin/streptomycin	Tangpu Biological Technology Co., Ltd., Hangzhou, China
sodium alginate (Na-Alg)	Sigma-Aldrich, Shanghai, China
TRITC phalloidin	Yeasen Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China
Triton X-100	Solarbio Co., Ltd., Shanghai, China