Un enfoque basado en microscopía intravital para evaluar la permeabilidad intestinal y el rendimiento del desprendimiento de células epiteliales

Resumen

Aprovechando la microscopía intravital, el método presentado aquí permite la visualización en tiempo real del desprendimiento de células epiteliales intestinales en animales vivos. Por lo tanto, la mucosa intestinal teñida tópicamente (acriflavina y rhodamineB-dextran) de ratones anestesiados se compara hasta una sola célula mediante microscopía confocal.

Resumen

La microscopía intravital del intestino mediante imágenes confocales permite la observación en tiempo real del desprendimiento de células epiteliales y la fuga de barreras en animales vivos. Por lo tanto, la mucosa intestinal de los ratones anestesiados se tiñe tópicamente con tinción inespecífica (acriflavina) y un marcador fluorescente (dextrano rhodamine-B), montado en una placa enjuacida con solución salina e imágenes directamente con un microscopio confocal. Esta técnica puede complementar otras técnicas no invasivas para identificar fugas de permeabilidad intestinal, como el paso transmucoso de trazados administrados por vía oral. Además de esto, el enfoque presentado aquí permite la observación directa de eventos de desprendimiento de células en tiempo real. En combinación con ratones reportero fluorescentes apropiados, este enfoque es adecuado para arrojar luz en mecanismos celulares y moleculares que controlan la extrusión de células epiteliales intestinales, así como a otros procesos biológicos. En las últimas décadas, interesantes estudios con microscopía intravital han contribuido al conocimiento sobre permeabilidad endotelial, localización del intestino de las células inmunitarias, comunicación inmune-epitelial e invasión de componentes luminales, entre otros. Juntos, el protocolo presentado aquí no sólo ayudaría a aumentar la comprensión de los mecanismos que controlan la extrusión de células epiteliales, sino que también podría ser la base para el desarrollo de otros enfoques que se utilizarán como instrumentos para visualizar otros procesos celulares altamente dinámicos, incluso en otros tejidos. Entre las limitaciones técnicas, las propiedades ópticas del tejido específico, así como la tecnología de imagen seleccionada y la configuración del microscopio, a su vez, determinarían la distancia de trabajo de la imagen y la resolución de las imágenes adquiridas.

Introducción

El intestino es un órgano altamente especializado con una función estrechamente regulada que permite procesos contradictorios, a saber, nutrición y protección contra sustancias luminales nocivas. Revestimiento entre el cuerpo humano y el medio ambiente, el epitelio intestinal actúa como una barrera física e inmunológica y contribuye al mantenimiento de la homeostasis mucosa en el intestino^1,2. La pérdida de integridad epitelial y el aumento de la permeabilidad de la unión estrecha es bien conocido por estar asociado con la Enfermedad inflamatoria intestinal (IBD)^3,4,5,6. Las alteraciones epiteliales se consideran causas y amplificadores secundarios para la inflamación intestinal crónica en la EII. Por lo tanto, una mejor comprensión de las alteraciones epiteliales tempranas en el intestino de los pacientes con EII sería de gran valor para el desarrollo de nuevas estrategias para restaurar la integridad epitelial para una predicción fiable y la posterior prevención de las recaídas de la EII.

El epitelio intestinal sigue un proceso de rotación complejo y estrictamente regulado. Desde el fondo de la cripta, las células epiteliales intestinales diferenciadas terminalmente (CI) derivadas de células madre pluripotentes migran hacia arriba hasta la punta del villus, donde las células envejecidas/dañadas se arrojan en el lumen^7. El equilibrio entre la división y la extrusión celular permite el mantenimiento de números de células epiteliales intestinales, evitando la formación de huecos y fugas, así como la acumulación de células epiteliales que potencialmente conducen a masas celulares y tumorigenesis^8,,9,,10. A pesar del papel clave del desprendimiento de células epiteliales en la renovación fisiológica del epitelio intestinal, el conocimiento sobre los mecanismos moleculares que impulsan la extrusión de células en la punta del villus es limitado. Por lo tanto, es necesario realizar investigaciones básicas que proporcionen una descripción precisa de la secuencia de eventos moleculares implicados en el desprendimiento de células epiteliales.

Interacciones complejas entre diferentes tipos celulares dentro de la mucosa intestinal son clave para entender los mecanismos moleculares que regulan la rotación epitelial y la homeostasis intestinal. Por lo tanto, los estudios in vivo ofrecen grandes ventajas sobre los enfoques in vitro y ex vivo en este contexto. Además, las técnicas de imagen en tiempo real permiten la descripción de la secuencia de eventos que controlan fenómenos específicos. En este contexto, el estudio de procesos altamente dinámicos exige el uso de técnicas optimizadas de alta resolución para la observación directa del tejido. Las técnicas de imagen intravital aparecen como herramientas únicas adecuadas para el estudio del desprendimiento de células epiteliales en el intestino.

El término "microscopía intravital" se refiere a enfoques experimentales aprovechando las técnicas de imagen de alta resolución (multifotón o microscopía confocal) para visualizar directamente las células y tejidos en sus entornos nativos dentro de un animal vivo¹¹. Permite la adquisición en tiempo real de información in vivo hasta resolución de una sola célula, y implica claras ventajas sobre los métodos estáticos o de baja resolución. La microscopía intravital proporciona información complementaria y supera algunas limitaciones de las técnicas clásicas y/o de alta gama, como los artefactos debido al procesamiento de tejidos. Por el contrario, la principal limitación de la microscopía intravital es que el tejido debe estar expuesto directamente al microscopio, que en la mayoría de los casos requiere cirugía. Aunque los enfoques sofisticados preservan la vitalidad y minimizan el impacto del tejido fotografiado (cámaras de piel y ventanas de imágenes)^12,13, en la mayoría de los casos se realiza una simple incisión cutánea para la externalización del tejido (colgajos de la piel)¹⁴. En la última década, estos enfoques han aportado pruebas clave sobre procesos altamente dinámicos, que antes eran inescrutables. Traslacionalmente, las imágenes en tiempo real proporcionaron nuevos conocimientos biológicos sobre células madre y leucocitos homing¹⁵, así como la diseminación del cáncer y la formación de metástasis^13,16. En el contexto clínico, la endomicroscopía se explota actualmente como una herramienta de diagnóstico del cáncer¹⁷ y enfermedades gastrointestinales, como la EII^18,19; mientras que la microscopía de mosaico confocal se convirtió en una herramienta de patología rápida durante la cirugía²⁰. Juntos, la microscopía intravital ha surgido últimamente como una herramienta valiosa y versátil para la investigación biomédica y la aplicación futura en la clínica.

La microscopía intravital se implementa aquí para la visualización en tiempo real de la fuga epitelial intestinal y la observación de eventos de desprendimiento de células epiteliales. La fuga de permeabilidad intestinal se puede identificar mediante otras técnicas no invasivas in vivo, como la cuantificación de la administración oral de trazadores fluorescentes en el suero^21. Sin embargo, esta técnica no permite la observación directa del rendimiento de desprendimiento ni la segregación entre la permeabilidad para- y transcelular. La combinación de experimentos de trazador estándar y microscopía intravital representa un enfoque adecuado para: i) identificar alteraciones en la permeabilidad intestinal, y ii) segregar entre la permeabilidad epitelial para y transcelular. Además del desprendimiento celular, la microscopía intravital en combinación con el etiquetado de fluorescencia in vivo permite el estudio de otros mecanismos celulares y moleculares (por ejemplo, redistribución de unión estrecha durante el desprendimiento celular utilizando ratones reportero fluorescentes²² o interacciones entre cis y otras células dentro de la mucosa intestinal²³).

El método presentado aquí representa una adaptación de la microscopía intravital para permitir la observación en tiempo real de la mucosa intestinal, utilizando la microscopía de escaneo láser confocal (CLSM). Por lo tanto, utilizamos ratones noqueadores condicionales de GGTase (Geranylgeranyltransferase) en células epiteliales intestinales (IEC) en (Pggt1b^i-CEC ratones), ya que sufren de una enfermedad intestinal grave y aumento de la permeabilidad epitelial²⁴. Se describe la preparación quirúrgica del ratón y la tinción de la mucosa intestinal, así como los ajustes apropiados utilizados para la adquisición de imágenes y el análisis posterior a la adquisición. Este protocolo podría permitir futuros estudios que contribuyan al conocimiento actual sobre la dinámica y la cinética del desprendimiento de células epiteliales intestinales. Además, el protocolo podría servir como base para diversas adaptaciones para estudiar otros fenómenos que ocurren en la superficie de la mucosa intestinal, e incluso en otros tejidos.

Protocolo

Las autoridades locales pertinentes de Erlangen han aprobado el siguiente protocolo (Regierung von Unterfranken, Wurzburgo, Alemania). Los ratones fueron alojados en condiciones específicas libres de patógenos.

NOTA: La inhibición de la prenilación mediada por GGTase dentro de los CI provoca una alteración grave de la permeabilidad intestinal en ratones Pggt1b^{i-CEC 24}. Por lo tanto, este modelo de ratón se utilizó para demostrar cómo el protocolo puede ser útil para estudiar defectos de barrera intestinal. Sin embargo, este protocolo podría utilizarse para el estudio de cualquier otra línea de ratón.

1. Preparación quirúrgica y tinción de la mucosa intestinal del ratón

NOTA: La preparación quirúrgica se basa en los protocolos descritos anteriormente²⁵. Mantenga el ratón anestesiado bajo una lámpara roja durante la preparación quirúrgica, para evitar una caída de la temperatura corporal.

1. Anestesiar el ratón mediante inyección intraperitoneal de ketamina/xylazin (96 mg/kg de ketamina; y 12,8 mg/kg de xitilazina). Verifique la anestesia comprobando la falta de un reflejo del párpado.
2. Aplicar crema de protección para los ojos con un bastoncillo de algodón.
3. Haga una incisión (1 cm) en el área ventral izquierda utilizando fórceps estándar y tijeras finas rectas.
4. Exteriorizar un segmento del intestino (5-7 cm, aproximadamente).
5. Abra el segmento intestinal exteriorizado longitudinalmente por electrocauterización en el lado antimesentic.
6. Exponga la mucosa y enjuague en breve con solución salina para eliminar el contenido fecal.
   NOTA: Opcionalmente, aplique xylazin directamente sobre el intestino para evitar artefactos de movimiento debido a la peristalsis.
7. Manchar la superficie de la mucosa intestinal con acriflavina y rhodamine-B dextran (10 kDa).
   1. Aplicar la solución de acriflavina de 1 mg/ml (100 l) por pipeteo gota a gota en la mucosa e incubar durante 3 min. Lave la solución restante con PBS.
   2. Aplicar la solución de 2 mg/ml de rhodamina-dextrán (100 l) pipeteando gota a gota en la mucosa e incubar durante 3 min. Lave la solución restante con PBS.
      NOTA: Opcionalmente, retire la sangre de la preparación con algodón aséptico.
8. Colocar el ratón anestesiado supino en una corredera de cubierta montada en una cámara enjuagada con solución salina precalentizada (37 oC).
   NOTA: El segmento intestinal abierto se coloca la superficie luminal hacia abajo, en la corredera de la cubierta.
9. Coloque la preparación (ratón anestesiado en la cámara) en la etapa del microscopio invertido.
10. Cubrir al animal con una almohadilla isotérmica (aprox. 37 oC).
11. Proceda inmediatamente a la microscopía intravital.
    NOTA: Mantenga la preparación quirúrgica enjuagada con solución salina precale calentada para evitar la deshidratación del tejido y la muerte celular.

2. Microscopía intravital

NOTA: Realice el paso 2.1 antes de comenzar la preparación quirúrgica, para evitar largos tiempos de espera entre la anestesia, la cirugía y la adquisición de imágenes. Si es necesario, se pueden administrar dosis adicionales de anestésicos a animales preparados quirúrgicamente para mantenerlos bajo anestesia para los experimentos de diagnóstico por imágenes.

1. Configure el microscopio CLSM.
   1. Inicie el microscopio CLSM encendiendo la base del microscopio y la caja del escáner. Encienda el ordenador pulsando el botón Inicio.
   2. Inicie el software de adquisición de imágenes (por ejemplo, LAS X) haciendo doble clic en el icono. Seleccione la configuración adecuada (Configuración: máquina; Microscopio: DMI6000) y haga clic en Aceptar.
      1. Defina la Resolución adecuada. Ir a Configuración ? Hardware ? Resolución ? Profundidad de bits. Seleccione 12.
   3. Vaya al menú Adquisición. Seleccione xyzt para el modo de adquisición de imágenes en el menú desplegable. Seleccione el objetivo en el menú desplegable (20x o 40x).
   4. Diseñe la configuración de adquisición secuencial. Haga clic en Seq. Agregue una segunda secuencia, haciendo clic en el botón Agregar (+). Seleccione Entre fotogramas.
      1. Configure la secuencia 1 (detección de acriflavina; excitación de 416 nm; emisión de 514 nm). Encienda la caja láser visible. Active el PMT1 (ON). Defina la ventana de longitud de onda de emisión (490-550 nm).
      2. Configure La secuencia 2 (detección de rhodamineB-dextran; 570 nm excitación; 590 nm, emisión). Encienda la caja láser visible. Active el PMT2 (ON). Defina la ventana de longitud de onda de emisión (550-760).
   5. Active los láseres correspondientes (488 y 552). Ir a Configuración ? Láseres. Active los láseres de 488 y 552 nm (encienda).
2. Ajuste la configuración a las características específicas del experimento actual.
   1. Encienda la fuente de luz (presione la alimentación). Coloque la preparación (ratón anestesiado en la cámara) en la etapa del microscopio y cambie la posición xy hasta que el eje de iluminación se centre en la preparación del tejido.
   2. Seleccione el campo de interés utilizando la fuente de luz estándar y los oculares.
      1. Seleccione el cubo de filtro (I3). Abra el obturador. Concéntrese en la superficie de la mucosa intestinal utilizando la macro y la micro-rueda. Busque un área donde se puedan visualizar varias vellosidades dentro del campo de visión cambiando la posición XY.
   3. Verifique que la tinción de rhodamine-dextran también sea visible en esa área. Cambie el cubo de filtro (N2.1). Compruebe la imagen a través de los oculares.
   4. Inicie la adquisición de imágenes CLSM desde el software. Optimice la configuración de las dos secuencias.
      1. Seleccione Secuencia 1. Ajuste la potencia, ganancia y desplazamiento del láser para la Secuencia 1.
      2. Seleccione Secuencia 2. Ajuste la potencia, ganancia y desplazamiento del láser para la Secuencia 2.
   5. Defina el rango de pila z.
      1. Abra el menú desplegable de la pila Z. Concéntrese en la superficie de la mucosa utilizando el control del eje z. Pulse Iniciar.
      2. Concéntrese en el límite inferior donde la señal todavía es detectable. Pulse Finalizar.
      3. Defina los números de pilas z (10). Evite lapsos de tiempo de más de 2 minutos durante dos puntos de tiempo consecutivos.
   6. Defina la configuración de tiempo. Vaya al menú Hora. Haga clic en Minimizar. Seleccione Adquirir hasta que se detenga.
   7. Defina el promedio de línea. Seleccione Seq 1. Seleccione Promedio de línea 2. Seleccione Seq 2. Seleccione Promedio de línea 2.
3. Adquirir las imágenes correspondientes.
   1. Seleccione Formato (1024 x 1024) y Velocidad (400). Pulse Inicio.
   2. Pulse Detener después del tiempo de adquisición de la imagen deseado.
4. Guarde el archivo. Vaya a Proyecto. Haga clic con el botón derecho en el archivo correspondiente. Pulse Guardar como.
   1. Asigne el nombre adecuado al archivo. Seleccione la carpeta adecuada. Pulse Guardar.
5. Eutanasiar al animal (dislocación cervical) y recoger los tejidos para el análisis ulterior, si es necesario.

3. Análisis de imagen: Determinar la tasa de desprendimiento celular y el epitelio intestinal

1. Tasa de desprendimiento de celdas
   1. Inicie el software de adquisición de imágenes.
   2. Vaya a Abrir proyectos. Seleccione el archivo adecuado.
   3. Defina el tiempo total de adquisición de imágenes.
      1. Seleccione la última pila z completa. Seleccione la última posición Z desde el punto de tiempo seleccionado anteriormente. Lea la hora en la esquina inferior derecha de la pantalla (tiempo total de adquisición de la imagen).
   4. Seleccione un villus.
      1. Seleccione la posición de pila Z adecuada (superficie del villus, pero lo suficientemente profunda como para evitar la interferencia con las células ya arrojadas y otros componentes presentes en el lumen).
      2. Mida la longitud de la membrana basal. Seleccione la herramienta de regla. Divide el villus en varias líneas para cubrir o dibujar todo el perímetro de villus. Añadir los diferentes valores (longitud total de la membrana basal). Elimine los segmentos de la herramienta Regla.
   5. Cuente el número de eventos que se producen durante toda la duración de la adquisición de la imagen.
      1. Divida el vitón en segmentos con un tamaño adecuado. Analice la secuencia de eventos/segmento deslizando la barra a través de los diferentes puntos de tiempo. Anote los eventos de desprendimiento de celdas identificadas.
   6. Calcular el número de eventos de desprendimiento/tiempo/longitud de la membrana basal, que indica la tasa de desprendimiento celular. Cuenta hasta 5 villi/video, y al menos dos videos/ratón. Calcule la media de estas 10 mediciones.
2. Fuga
   1. Seleccione un villus.
   2. Seleccione la posición de pila Z adecuada (superficie del villus, pero lo suficientemente profunda como para evitar la interferencia con las células ya arrojadas y otros componentes presentes en el lumen). Contar el número total de células epiteliales/villus.
   3. Cuente el número de puntos de fuga (presencia paracelular de dextrano de rhodamina. Este evento es transitorio, que se puede confirmar comprobando imágenes anteriores y ulterior adquiridas).
   4. Calcular el número de fugas/número total de células epiteliales. Analice 10 villus/muestra/vídeo diferentes y calcule el número medio de fugas y células/villus permeables.

Resultados

El protocolo presentado aquí describe un enfoque intravital basado en microscopía para visualizar fugas epiteliales intestinales y observar el rendimiento de desprendimiento celular en el intestino en tiempo real. Brevemente, los ratones son anestesiados y sometidos a preparación quirúrgica con el fin de exponer la superficie de la mucosa del intestino delgado. A continuación, los CI se tiñen mediante la aplicación tópica de acriflavina; mientras que la rhodamine luminal B-dextran...

Discusión

Aunque técnicamente desafiante, la metodología basada en microscopía intravital representa un enfoque experimental único para visualizar el proceso celular altamente dinámico en tiempo real, como el rendimiento de desprendimiento celular. Hasta ahora, no existe un enfoque experimental alternativo para visualizar la extrusión celular in vivo. Creemos que este protocolo puede contribuir a la descripción de diversos procesos celulares que juegan un papel en el mantenimiento de la homeostasis intestinal.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acriflavine hydrochloride	Sigma Aldrich	A8251	1 mg/mL solution in PBS
Deltaphase isothermal pad	BrainTree	B-DP-PAD	-
Gemini Cautery System	BrainTree	B-GEM-5917	-
Ketamin	WDT	9089.01.00
LAS X	Leica	-	-
LSM microscope SP8	Leica	-	-
PBS	Biochrom	L182
Rhodamine B dextran	Invitrogen	D1824	10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution
Standard forceps (Dumont SS)	Fine Science Tools	11203-23	-
Straight fine scissors	Fine Science Tools	14060-10	-
Tamoxifen	Sigma Aldrich	T5648	50 mg/mL in ethanol
Xylazin	Bayer	1320422