Estimulación de nichos de células madre y regeneración de tejidos en piel de ratón mediante fotogeneración in situ dependiente de protoporfirina IX conmutable de especies reactivas de oxígeno

Resumen

El objetivo de este protocolo es inducir la producción transitoria in vivo de niveles no letales de especies reactivas de oxígeno (ROS) en la piel del ratón, promoviendo aún más las respuestas fisiológicas en el tejido.

Resumen

Aquí, describimos un protocolo para inducir la fotogeneración conmutable in vivo de especies endógenas reactivas de oxígeno (ROS) en la piel del ratón. Esta producción transitoria de ROS in situ activa eficientemente la proliferación celular en nichos de células madre y estimula la regeneración de tejidos, como se manifiesta fuertemente a través de la aceleración de los procesos de curación de quemaduras y crecimiento del folículo piloso. El protocolo se basa en un tratamiento fotodinámico regulable que trata el tejido con precursores del fotosensibilizador endógeno protoporfirina IX y posteriormente irradia el tejido con luz roja bajo parámetros fisicoquímicos estrictamente controlados. En general, este protocolo constituye una herramienta experimental interesante para analizar la biología de las ROS.

Introducción

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son el resultado de la reducción química del oxígeno molecular para formar agua, e incluyen oxígeno singlete, anión superóxido, peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo ^1,2,3. Las ROS tienen una vida útil muy corta debido a su naturaleza extremadamente reactiva químicamente. En los organismos aeróbicos, las ROS se forman incidentalmente dentro de las células como un subproducto permeable importante de la respiración aeróbica (cadena de transporte de electrones) en las mitocondrias. La acumulación transitoria de altos niveles de ROS en la célula da lugar a una condición de estrés oxidativo que puede provocar la inactivación irreversible de proteínas, lípidos y azúcares y la introducción de mutaciones en la molécula de ADN 2,3,4,5. La acumulación gradual de daño oxidativo en células, tejidos y organismos enteros aumenta constantemente con el tiempo y se ha asociado con la inducción de programas de muerte celular, diversas patologías y el proceso de envejecimiento 2,3,4,6.

Los organismos aeróbicos han desarrollado constantemente mecanismos moleculares eficientes para hacer frente a la acumulación excesiva de ROS en células y tejidos. Estos mecanismos incluyen miembros de la familia de proteínas superóxido dismutasa (SOD), que catalizan la dismutación de radicales superóxido en oxígeno molecular y peróxido de hidrógeno, así como diferentes catalasas y peroxidasas que utilizan el grupo de antioxidantes (glutatión, NADPH, peroxirredoxina, tiorredoxina ^7,8) para catalizar la posterior conversión del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno molecular.

Sin embargo, varios informes apoyan el papel de las ROS como componentes clave de los circuitos moleculares que regulan las funciones celulares críticas, incluyendo la proliferación, la diferenciación y la movilidad ^2,3,4. Este concepto se ve respaldado por la identificación y caracterización inicial de mecanismos específicos de producción de ROS en organismos aeróbicos, incluidas las lipoxigenasas, las ciclooxigenasas y las NADPH oxidasas ^9,10. En este sentido, las ROS exhiben un papel activo durante el desarrollo embrionario de vertebrados 11,12,13 y se han reportado roles clave para estas moléculas en la regulación de funciones fisiológicas específicas in vivo en diferentes sistemas experimentales, incluyendo el programa de diferenciación de progenitores hematopoyéticos en Drosophila^14, la inducción de la cicatrización en el pez cebra o la regeneración de la cola en renacuajos de Xenopus ¹⁵. En mamíferos, las ROS han estado implicadas en el potencial de autorrenovación/diferenciación de las células madre neurales en un modelo de neurosfera¹⁶ y en la desregulación de la función de las células madre intestinales durante el inicio del cáncer colorrectal¹⁷. En la piel, la señalización de ROS se ha asociado con la diferenciación epidérmica y la regulación del nicho de células madre de la piel y el ciclo de crecimiento del folículo piloso^18,19.

En esta perspectiva, una limitación experimental importante para determinar el papel fisiológico de las ROS en los sistemas biológicos, tanto en condiciones normales como patológicas, es la falta de herramientas experimentales adecuadas para inducir la producción controlada de estas moléculas en células y tejidos, asemejándose con precisión a su producción fisiológica como segundos mensajeros de señalización. En la actualidad, la mayoría de los enfoques experimentales implican la administración de ROS exógenas, principalmente en forma de peróxido de hidrógeno. Recientemente hemos implementado un enfoque experimental para activar una producción in vivo transitoria y no letal de ROS endógenas en la piel del ratón, basada en la administración de precursores del fotosensibilizador endógeno protoporfirina IX (PpIX; por ejemplo, ácido aminolaevulínico o su derivado metilo metilaminolevulinato) y una mayor irradiación de la muestra con luz roja para inducir la formación in situ de ROS a partir de oxígeno molecular intracelular (Figura 1). Este procedimiento fotodinámico puede ser utilizado eficientemente para estimular nichos de células madre residentes, activando así los programas regenerativos del tejido^19,20 y abriendo el camino a nuevas modalidades terapéuticas en medicina regenerativa de la piel. Aquí, presentamos una descripción detallada del protocolo, mostrando ejemplos representativos de estimulación de nichos de células madre, medida como un aumento en el número de células retenedoras de la etiqueta 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) a largo plazo (LRC) en la región abultada del folículo piloso^19,21, y la posterior activación de programas de regeneración (aceleración del crecimiento del cabello y procesos de cicatrización de quemaduras) inducidos por procesos transitorios^, Producción de ROS no letales en la piel de la cepa de ratón C57Bl6.

Protocolo

Todos los procedimientos de cría y experimentación de ratones deben llevarse a cabo de conformidad con la legislación local, nacional e internacional y las directrices sobre experimentación animal.

1. Inducción del crecimiento del cabello, inducción de quemaduras e identificación de LRC BrdU a largo plazo en el epitelio de la piel de la cola

NOTA: Utilice ratones C57BL/6 de 10 o 7 semanas de edad, preferiblemente compañeros de camada, para los diseños experimentales que se describen a continuación. En todos los procedimientos experimentales, los animales serán anestesiados por inhalación de isoflurano al 3% o eutanasiados por luxación cervical según se indique.

1. Inducción del crecimiento del pelo en la piel posterior de ratones en la segunda fase telógena (reposo) (alrededor del día 50 después del parto)
   1. Anestesiar ratones con inhalación de isoflurano al 3%. Confirmar la anestesia profunda completa por falta de reflejo pedal (pellizco firme del dedo del pie). Afeitar dos regiones independientes una al lado de la otra de la piel de la espalda en cada ratón utilizando cortapelos y crema depilatoria (Tabla de materiales). Use el lado izquierdo para el control y el lado derecho para el tratamiento.
      NOTA: Compruebe que, después del afeitado, la piel subyacente del dorso es rosada y no gris/negra, un indicador de melanogénesis y entrada en la fase anágena (crecimiento) en esta cepa de ratón.
   2. Lavar a fondo con PBS para eliminar todos los restos de crema y proceder a la inducción de la producción in situ transitoria de niveles de ROS no letales como se describe en la sección 2.1.
   3. Registre el crecimiento del folículo piloso a través de la adquisición diaria de imágenes de alta resolución de las áreas de control y de la piel de la espalda tratada en cada animal (por ejemplo, utilizando una cámara HD acoplada a una lente binocular de 5−20x).
2. Inducción de lesiones por quemaduras de^2º grado en la piel posterior de ratones en la segunda fase telógena (reposo) (alrededor del día 50 después del parto)
   1. Anestesiar ratones. Afeitar toda la región de la piel de la espalda en cada ratón con un cortapelos y crema depilatoria y lavar bien con PBS para eliminar todos los restos de crema.
      NOTA: Administrar inyecciones subcutáneas in situ de lidocaína al 0,5% (2 mg/ml) en solución salina estéril, que no exceda los 7 mg/ml, justo antes del procedimiento de quema.
   2. Precalentar una barra de latón (1 cm de sección transversal) a 95 °C sumergiéndola en agua hirviendo y luego aplicarla en la región central de la superficie dorsal de la piel dorsal de cada ratón durante 5 s.
   3. Inmediatamente después de la generación de la quemadura, inyectar intraperitonealmente a los animales 1 ml de solución fisiológica (NaCl al 0,9%) en una manta eléctrica para evitar la deshidratación. Dejar que los animales se recuperen durante 24 h y proceder a la inducción de la producción in situ transitoria de niveles no letales de ROS como se describe en la sección 2.3.
   4. Registre la progresión de la herida por quemadura mediante la adquisición diaria de imágenes de alta resolución de las áreas de control y de la piel de la espalda tratada en cada animal (p. ej., utilizando una cámara HD acoplada a una lente binocular de 5−20x).
3. Generación e identificación de LRCs BrdU a largo plazo en el epitelio de la piel de la cola
   1. Inyectar a los compañeros de camada de 10/14 días de edad por vía intraperitoneal (sin anestesia) una vez al día durante 4 días consecutivos con 50 mg/kg de BrdU de peso corporal disueltos en PBS. Después de la fase de etiquetado, deje que los ratones crezcan durante 50-60 días antes de cualquier tratamiento.
      NOTA: Use una aguja nueva para cada inyección.
   2. Proceda como se describe en la sección 2.3 para la inducción de la producción transitoria in situ de ROS no letales en la piel de la cola en diferentes momentos antes de la preparación de los tejidos enteros.
   3. Para preparar montes enteros de epidermis de la cola, eutanasia a los ratones por dislocación cervical y cortar las colas con tijeras quirúrgicas.
      1. Use un bisturí para hacer una incisión longitudinal recta a lo largo de la cola y pele toda la piel como una sola pieza de la columna vertebral. Incubar la piel pelada en 5 mM de EDTA en PBS en tubos de 5 mL durante 4 h a 37 °C y separar cuidadosamente las láminas intactas de la epidermis de la dermis con unas pinzas.
      2. Fijar el tejido en formaldehído al 4% en PBS durante al menos 72 h a temperatura ambiente (RT) y proceder a la detección de BrdU utilizando los anticuerpos adecuados.
      3. Utilizar microscopía de fluorescencia/confocal para identificar y cuantificar las LRC en cada condición experimental, incluyendo controles de luz y tratamientos fotodinámicos en diferentes momentos antes de la preparación de los tejidos enteros, como se describió previamente en detalle^19,20.
         NOTA: Las láminas epidérmicas fijas pueden almacenarse en PBS que contengan azida sódica al 0,02% a 4 °C durante un máximo de tres meses. Las láminas epidérmicas fijas se pueden utilizar para la inmunolocalización de las proteínas requeridas siguiendo los procedimientos estándar de cortes histológicos.

2. Inducción de la producción transitoria de niveles no letales de ROS en la piel del ratón

NOTA: Para inducir la producción transitoria de niveles no letales de ROS en la piel del ratón, se utilizará un tratamiento fotodinámico utilizando un precursor del fotosensibilizador endógeno PpIX, en este caso, metil-aminolevulinato (mALA), y luz roja.

1. Para activar la producción transitoria de ROS para la inducción del crecimiento del pelo en la piel dorsal, prepare a los animales como se indica en la sección 1.1.
   1. Aplicar ~25 mg de mALA en forma de crema tópica (Tabla de Materiales) en la región derecha, manteniendo el lado izquierdo como control interno evitando diferencias interindividuales. Incubar durante 2,5 h en la oscuridad, lavar bien el exceso de crema con PBS. Para confirmar la profundidad de la anestesia, monitoree a los animales cada 10 minutos hasta que se recuperen por completo.
      NOTA: La producción de PpIX en la piel posterior debe probarse in situ mediante su fluorescencia roja bajo excitación con luz azul (407 nm).
   2. Anestesiar a los animales.
   3. Irradiar toda la piel de la espalda con una fuente adecuada de luz roja (Tabla de materiales) para una dosis total de 2,5−4 J/^cm2. Mantenga a los ratones en una manta eléctrica hasta su completa recuperación y proceda como se describe en el paso 1.1.3.
      NOTA: La irradiancia debe ajustarse manipulando la distancia entre la fuente de luz y el tejido y medirse con un medidor de energía de potencia (Tabla de materiales). El experimento se considera finalizado cuando se observa un crecimiento completo del pelo en cualquiera de las regiones afeitadas independientes de cada animal. Todo el procedimiento implica un solo fototratamiento.
2. Para activar la producción transitoria de ROS para mejorar la cicatrización de las lesiones por quemaduras de^2º grado, prepare a los animales como se indica en la sección 1.2.
   1. Aplique ~ 25 mg de mALA en forma de crema tópica a lo largo de la superficie quemada, abarcando aproximadamente 4 mm de tejido adyacente. Incubar durante 2,5 h en la oscuridad, lavar bien el exceso de crema con PBS. Para confirmar la profundidad de la anestesia, monitoree a los animales cada 10 minutos hasta que se recuperen por completo.
   2. Anestesiar a los animales.
   3. Irradiar toda la piel de la espalda con una fuente adecuada de luz roja para una dosis total de 2,5−4 J/^cm2. Mantenga a los ratones sobre una manta eléctrica hasta su completa recuperación y proceda como se describe en el paso 1.2.4.
      NOTA: El procedimiento experimental para cada animal se considera finalizado cuando se observa la cicatrización completa de la quemadura. Todo el procedimiento implica un solo fototratamiento.
3. Para activar la producción transitoria de ROS en la piel de la cola, prepare ratones como se indica en la sección 1.3, aplique ~25 mg de mALA en forma de crema tópica a lo largo de toda la zona del tejido dorsal y proceda como se describe en la sección 2.1 para la piel de la espalda. Realizar tratamientos fotográficos y controles de luz correspondientes 24 h, 48 h o 72 h antes de la eutanasia animal y la posterior extracción de la piel de la cola de las monturas enteras.
   NOTA: En todos los diseños experimentales, ensayar la dependencia de ROS del proceso mediante el uso de eliminadores antioxidantes de ROS (p. ej., inoculación diaria de 100 mg/kg de N-acetilcisteína de peso corporal mediante inyección intraperitoneal de una solución de 20 mg/ml en PBS, pH 7,2, a partir de 5 días antes de los tratamientos con mALA o, alternativamente, dos dosis de 100 mg/ml de ácido ascórbico en etanol al 50%, espaciado 30 min, aplicado tópicamente sobre la piel en el intervalo de tiempo entre los tratamientos con mALA y la irradiación con luz roja).

3. Detección de ROS en la piel

1. Evaluación ex vivo de la producción de ROS en la piel de la cola después del tratamiento fotodinámico con hidroetidina
   NOTA: La hidroetidina es una molécula no fluorescente que reacciona específicamente con ROS para producir colorante fluorescente 2-hidroxietidio (hET).
   1. Incubar las pieles enteras de la cola, obtenidas como se describe en la sección 1.3.3, durante 3 h a 37 °C en 5 mM de EDTA en solución de PBS (muestras de control) o conteniendo adicionalmente 2 mM mALA (muestras de tratamiento fotodinámico).
   2. En todos los casos, añadir hidroetidina hasta una concentración final de 3,2 μM a partir de un stock de 25 mg/ml en dimetilsulfóxido (DMSO) e incubar durante 1 h en la oscuridad a RT.
   3. Estire las muestras de piel de la cola sobre una superficie de vidrio con las yemas de los dedos e irradie con luz roja de 636 nm a una fluencia de 10 J/^cm2 .
   4. Proceda inmediatamente a separar la epidermis de la dermis y a fijar las láminas epidérmicas como se describe en la sección 1.3.3.
   5. Evalúe la emisión de rojo hET bajo un microscopio de fluorescencia/confocal utilizando luz verde excitante, capture imágenes de alta calidad y proceda con un análisis adicional.
      NOTA: Utilice la tinción con hET de muestras de tejido en ausencia de tratamiento fotodinámico como control negativo de la autooxidación de hET.
2. Detección in vivo de la producción de ROS en la piel de la espalda después de la inducción del crecimiento del cabello y la cicatrización de quemaduras seguida de un tratamiento fotodinámico
   NOTA: Este paso se realiza utilizando diacetato de 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína (DHF-DA), un compuesto no fluorescente permeable de células que, después de la escisión por enzimas esterasas intracelulares, reacciona específicamente con ROS dando el colorante fluorescente 2′,7′-diclorofluoresceína (DCF).
   1. Utilice animales preparados para la inducción del crecimiento del cabello (sección 1.1) o la cicatrización de quemaduras (sección 1.2). Justo antes de los tratamientos tópicos con mALA en crema (ver secciones 2.1 y 2.2), dispensar tópicamente 100 μl de 1 mg/ml en etanol al 50% de DHF-DA en todas las zonas de control o tratadas de la piel objetivo, dejar que la piel absorba completamente el material y continuar con la aplicación tópica de mALA crema.
   2. Incubar a los animales tratados durante 4 h en la oscuridad, lavar bien la crema tópica de mALA de la piel con PBS y dispensar una segunda dosis de 100 μL de solución de DHF-DA sobre la piel. Para confirmar la profundidad de la anestesia, monitoree a los animales cada 10 minutos hasta que se recuperen por completo.
   3. Incubar a los animales tratados durante 50 min en la oscuridad, anestesiar e irradiar toda la piel del dorso con una fluencia que oscile entre 2,5 y 4 J/^cm2 de luz roja de 636 nm utilizando una lámpara LED.
   4. Inmediatamente después de la irradiación, evaluar los niveles de ROS generados en la piel utilizando un sistema de imagen in vivo (Tabla de Materiales). Configure la caja de filtro para una excitación de 445−490 nm y una emisión de 515−575 nm, capture imágenes de alta calidad y proceda con un análisis adicional.
      NOTA: Utilice la tinción de DHF-DA de muestras de tejido en ausencia de tratamiento fotodinámico como control negativo para la autooxidación de DHF-DA.

Resultados

La administración tópica del precursor mALA en la piel de la espalda y la cola del ratón da lugar a una acumulación significativa de PpIX en todo el tejido y, notablemente, en el folículo piloso, como lo demuestra la fluorescencia de color rosa rojizo de este compuesto bajo excitación con luz azul (407 nm) (Figura 2A,C). La irradiación posterior del tejido tratado con luz roja (636 nm) a una fluencia de 2,5−4 J/^cm2 promueve la producción transitoria de R...

Discusión

Aquí, presentamos una metodología que permite una activación transitoria de la producción endógena de ROS in vivo en la piel del ratón con efectos fisiológicos. La metodología se basa en un procedimiento fotodinámico para inducir una estimulación controlada y local del fotosensibilizador endógeno PpIX (Figura 1B). Este enfoque experimental es una herramienta interesante para estudiar la biología de las ROS en sistemas experimentales in vivo, constituyendo un avance significativo ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate	Sigma Aldrich	D6883-50MG
5'-bromo-2'-deoxiuridine	Sigma Aldrich	B5002-500MG
Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein	Roche	11202693001
Depilatory cream (e.g., Veet)	Veet
Dihydroethidium	Sigma Aldrich	37291-25MG
In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2	Perkin Elmer
mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g	Galderma
Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D)	ThorLabs
Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp	Photocure ASA