Microdisección de captura láser de las subregiones de Glioma para la caracterización espacial y molecular de la heterogeneidad intratumoral, los oncostreams y la invasión

Resumen

La microdisección láser (LMD) es una técnica sensible y altamente reproducible que se puede utilizar para descubrir vías que median la heterogeneidad e invasión del glioma. Aquí, describimos un protocolo optimizado para aislar áreas discretas del tejido glioma usando LMD láser seguido de análisis transcriptomático.

Resumen

Los gliomas son tumores cerebrales primarios caracterizados por su invasividad y heterogeneidad. Patrones histológicos específicos como pseudopalisades, proliferación microvascular, transformación mesenquimal y necrosis caracterizan la heterogeneidad histológica de los gliomas de alto grado. Nuestro laboratorio ha demostrado que la presencia de altas densidades de células mesenquimales, llamadas oncostreams, se correlacionan con la neoplasia tumoral. Hemos desarrollado un enfoque único para entender los mecanismos que subyacen al crecimiento y la invasión del glioma. Aquí, describimos un protocolo integral que utiliza microdisección de captura láser (LMD) y secuenciación de ARN para analizar la expresión diferencial de ARNm de estructuras multicelulares heterogéneas intratumorales (es decir, áreas mesenquimales o áreas de invasión tumoral). Este método mantiene una buena histología tisular y la integridad del ARN. La perfusión, la congelación, la incrustación, la seccionamiento y la tinción se optimizaron para preservar la morfología y obtener muestras de microdisección láser de alta calidad. Los resultados indican que la perfusión de ratones portadores de glioma utilizando 30% de sacarosa proporciona una buena morfología y calidad de ARN. Además, la tinción de secciones tumorales con un 4% de cresyl violeta y 0,5% de eosina da como resultado una buena tinción nuclear y celular, preservando al mismo tiempo la integridad del ARN. El método descrito es sensible y altamente reproducible y se puede utilizar para estudiar la morfología tumoral en varios modelos tumorales. En resumen, describimos un método completo para realizar LMD que preserva la morfología y la calidad del ARN para la secuenciación para estudiar las características moleculares de las estructuras multicelulares heterogéneas dentro de tumores sólidos.

Introducción

Los gliomas son los tumores primarios más agresivos del sistema nervioso central. Son altamente invasivos y heterogéneos¹. El análisis de los componentes celulares y moleculares del tumor revelará nuevas dianas terapéuticas.

Entre los diferentes métodos disponibles actualmente, la microdisección de captura láser (LMD) del tejido tumoral cerebral congelado es una técnica rentable y fiable que permite el aislamiento de áreas anatómicas discretas o poblaciones celulares específicas de los tejidos tumorales para estudiar su perfil molecular^2,,3. LMD permite el análisis de perfiles de expresión génica mRNA de células individuales seleccionadas o estructuras multicelulares^4,5. LmD se puede utilizar para obtener un conocimiento mecánico en profundidad sobre los eventos moleculares que tienen lugar durante la progresión del tumor. La mejora en el procesamiento de los tejidos tumorales es necesaria para obtener una resolución óptica óptima de la morfología tisular y la calidad del ARN^6. Aunque la fijación de paraformaldehído es la mejor opción para el análisis morfológico, la calidad del ARN se ve afectada y degradada en estas condiciones, lo que resulta en una mala calidad del ARN para el análisis de ARN-seq. El uso de secciones de tejido congelado evita la formación de cristales de hielo, que podrían romper las membranas celulares y producir agujeros dentro de las células, y sigue siendo la mejor opción para el análisis de ARN-Seq⁷.

Aquí, describimos un método optimizado de fijación y tinción de sección para procesar tejidos tumorales cerebrales de ratón congelados para LMD. Para evitar que se formen cristales de hielo en el tejido, perfundimos ratones con una solución de 30% de sacarosa. Esta solución interrumpe las interacciones entre las moléculas de agua polar y evita la formación de cristales de hielo, preservando la morfología del tejido. La tinción de tejido es necesaria para diferenciar y obtener población específica de células o áreas anatómicamente distintas dentro del tumor. Es esencial fijar y manchar el tejido con colorantes inocuos para mantener la integridad del ARN. Se ha demostrado previamente que la tinción de tejido con hematoxilina/eosina (H&E) deteriora la integridad del ARN⁸. Fijamos y tiñimos el tejido de interés con etanol, Cresyl violeta 4% y eosina Y 0.5% soluciones. Cresyl violeta es un tinte acidofílico que tiñe el núcleo celular con un color azul oscuro. EosinY es un tinte basófilo que tiñe los componentes básicos de las células, proporcionando una distinción entre el citoplasma y otras estructuras celulares^8. Ambos tintes son solubles en etanol y no deterioran la calidad del ARN. Para evitar daños tisulares y mantener una alta resolución óptica de las estructuras celulares, montamos las secciones de tejido antes de LMD^9.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí que utilizan animales experimentales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Michigan.

NOTA: Las neuroesferas de Glioma generadas a partir de un GEMM o líneas estables se pueden utilizar para el injerto de tumor intracraneal en ratones¹⁰ y procesarse para la secuenciación de LMD y ARN. Estas células expresan constitutivamente la luciferasa de la luciérnaga y las proteínas GFP, que se utilizarán aún más para el análisis del crecimiento tumoral y la localización.

1. Generación de modelo de glioma de ratón intracraneal a partir de neuroesferas derivadas de modelos de glioma genéticamente modificados

1. Para generar un cultivo primario de células de la neuroesfera a partir de un modelo de ratón genéticamente diseñado (GEMM), utilice el protocolo descrito anteriormente^10,11.
2. Preparar el medio de cultivo de la neurosfera como se describe: 500 mL de Medio águila modificada de Dulbecco F-12 (DMEM/F12) complementado con 10 mL de 50x B-27 y 5 mL de 100x N-2 suplementos de cultivo neuronal, 5 mL de 100x Antibiótico-Antimético, y 1 mL de Normocin. Antes de enchapar las neuroesferas, agregue 20 ng/ml de EGF recombinante humano y FGF al medio de cultivo.
3. Cultivo de neuroesferas de glioma en una incubadora de cultivos de tejidos a 37 oC y 5% de CO₂ durante 2-3 días antes del injerto tumoral intracraneal.
4. El día de la cirugía, recoger las neuroesferas del glioma y girarlas a 550 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet celular.
5. Para disociar las neuroesferas, resuspenda el pellet celular en 1 ml de solución de desprendimiento celular e incuba a 37oC y 5%_CO2 durante 2-4 min. Después del período de incubación, pipetear las neuroesferas hacia arriba y hacia abajo con un micropipeta de 1 ml para asegurar una suspensión de una sola célula.
6. Inactivar la solución de desprendimiento celular diluyendo la suspensión de la neurosfera con 10 ml de medios DMEM/F12 no suplementados. Gire las neuroesferas a 550 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Con cuidado, retire el sobrenadante.
7. Resuspenda el gránulo celular en 100 ml de medios DMEM/F12 sin suplementos. Haga una dilución 1:50 de la suspensión celular, y luego agregue 50 éL de Trypan Blue para contar células viables. Utilice la siguiente fórmula para determinar la concentración de celdas:
   cells/mL á [(células contadas por cuadrado) / á de los cuadrados contados) x 50 x 10.000 celdas/ml]
8. Después de determinar el recuento de células, para lograr una concentración objetivo de 30.000 células/ L en un volumen de 100 l, gire las neuroesferas hacia abajo y resuspenda en el volumen adecuado de DMEM/F12 que no contenga suplementos.
9. Coloque las neuroesferas en un tubo pre-etiquetado de 0,6 ml sobre hielo.
10. Preparar soluciones de trabajo de anestesia, analgésico y reversión de la anestesia antes de la implantación: Para la anestesia de ketamina/dexmedetomidina, agregue 0,6 ml de 100 mg/ml de clorhidrato de ketamina y 0,8 ml de 0,5 mg/ml de hidrocloruro de dexmedetomidina a un vial estéril de 8,6 ml de NaCl de 0,9%. Para buprenorfina analgésica, añadir 1 ml de 0,3 mg/ml de buprenorfina a 9 ml de 0,9% de NaCl que contiene el vial. Para la reversión de la anestesia con atipamezol, agregue 1 ml de 5 mg/ml de atipamezol a 9 ml de 0,9% de NaCl que contiene el vial.
11. Use ratones hembra C57BL/6J de 6-8 semanas de edad para el injerto de tumor intracraneal.
12. En una sala aprobada para la cirugía de supervivencia de roedores, establezca suministros estériles para el injerto de tumor intracraneal. Realice cirugías en un marco estereotaxócico de roedores equipado con una jeringa Hamilton esterilizada de 10 l con una aguja extraíble de 33G. Utilice un esterilizador de cuentas para esterilizar herramientas entre cirugías.
13. Anestetizar ratones con una sola inyección intraperitoneal (i.p.) de la solución anestésica preparada en el paso 1.11 (ketamina:75,0 mg/kg y dexmedetomidina:0,5 mg/kg). Aproximadamente, un volumen de 250 l de la solución anestésica se entregará a un ratón con un peso de 20 g. Asegúrese de que el ratón no responde al reflejo del pedal antes de continuar.
14. Una vez que el ratón esté en un estado profundamente anestesiado, aplique lubricante oftálmico de petrolato estéril en los ojos para evitar el secado. Afeitar el pelaje en el cráneo del ratón. Aplicar 10% de solución tópica de povidona-yodo en la zona de afeitado para desinfectar.
15. Asegure el cráneo del ratón en un marco estereotáctico. Primero, abre cuidadosamente la boca con fórceps y tira suavemente de la lengua y muévela a un lado de la boca para evitar que te atragantes. Mantenga la boca abierta con los fórceps y coloque los incisivos superiores en el ojo de la cerradura de la barra de dientes en el marco estereotáctico.
16. Sosteniendo la cabeza del ratón por las orejas, coloque las barras de las orejas contra los huesos postorbitales y asegúrelos. Asegúrese de que el cráneo del ratón esté nivelado con la mesa quirúrgica. Asegure las barras de los oídos cuidadosamente sin aplicar presión contra el cráneo. A continuación, asegure cuidadosamente la barra nasal.
17. Usando una hoja de bisturí talla 15, haga una incisión a lo largo de la cabeza del ratón, exponiendo el cráneo. Retraiga la piel en el lugar de la incisión utilizando retractores Decolibri. Utilice un aplicador estéril para eliminar todo el tejido pericraneal.
18. Identifique el bregma y baje la aguja de la jeringa de Hamilton directamente sobre ella. Con el marco, coloque la aguja 1 mm antes del bregma y 1,5 mm lateral. Usando una aguja 26G, marca este lugar anotando el cráneo.
19. Utilice un taladro eléctrico inalámbrico equipado con una broca de 0,45 mm para crear un orificio de rebaba en el sitio de destino. Taladre hasta alcanzar la dura mater subyacente. Extraiga cuidadosamente el hueso restante en el orificio de la rebaba con una aguja de 26G.
20. Con una pipeta, homogeneizar las células a fondo y extraer 7 l de la suspensión de la neuroesfera en la jeringa. Para asegurarse de que la jeringa funciona correctamente, dispensar 1 l de la suspensión en una almohadilla empapada en alcohol al 70%.
21. Baje la aguja a la superficie de la dura mater. Baje la jeringa 3,5 mm ventral y retraiga 0,5 mm. Esto creará un espacio de 0,5 mm en el cerebro para que las neuroesferas se depositen cuando se inyectan.
22. Deje la aguja en su lugar durante 2 minutos para el equilibrio de presión. Entrega lenta y suavemente 1 l de las células en el transcurso de 1 min. Deje que las células se asienten durante 6 minutos. Retire la jeringa lentamente y suavemente del cerebro en el transcurso de 2 min.
23. Usando solución salina estéril, lave la superficie del cráneo tres veces. Dispensar el exceso de células en la jeringa en una almohadilla de alcohol 70%, y limpiar la aguja con otro 70% almohadilla de alcohol. Enjuague la jeringa con PBS estéril para evitar la obstrucción de la aguja.
24. Retire los retractores y saque cuidadosamente el ratón del marco estereotáctico. Cierre la incisión con suturas de nylon 3-0, fórceps y un controlador de aguja.
25. Administrar atipamezol (1,0 mg/kg), aproximadamente 100 l para un ratón de 20 g. Administrar buprenorfina (0,1 mg/kg por vía subcutánea) por vía subcutánea, aproximadamente 70 l para un ratón de 20 g. Coloque ratones postquirúrgicos en una jaula de recuperación limpia y monitorícelos hasta que estén alerta y activos.

2. Perfusión animal y preservación cerebral

1. Para controlar la progresión tumoral, determine la bioluminiscencia in vivo utilizando un sistema de imágenes in vivo hasta que los animales muestren signos de carga tumoral. Eutanizar ratones cuando alcanzan una señal entre 10⁶ a 10⁷ fotones/s.
2. Anestetizar ratones que muestran signos de carga tumoral con inyección intraperitoneal (i.p.) de ketamina (75,0 mg/kg) y dexmedetomidina (0,5 mg/kg) solución. Entregue aproximadamente 250 ml a un ratón que pese 20 g. A continuación, asegúrese de que el ratón no responde al reflejo del pedal.
3. Usando fórceps, sostenga la piel por encima de la cavidad peritoneal, y usando un gran par de tijeras de disección hacer una incisión "Y" penetrando la pared peritoneal, perforar el diafragma, y luego cortar la caja torácica.
4. Inserte una cánula contundente de 20G en el ventrículo izquierdo del corazón del ratón. Luego retorzcan la aurícula derecha del corazón para permitir la exsanguinación.
5. Permitir la solución oxigenada de Tyrode (0,8% NaCl, 0,0264% CaCl₂, 0,005% NaH₂PO₄, 0,1% glucosa, 0,1% NaHCO₃, 0,02% KCl) para fluir a través del sistema circulatorio del ratón hasta que el hígado y los pulmones se hayan despejado por completo debido a la eliminación de sangre (5 min).
6. Continúe perfundiendo el animal con una solución de sacarosa del 30% disuelta en la solución de Tyrode durante 15 minutos adicionales. Para evaluar el éxito de la perfusión, confirme que el cuello, la cola y las piernas son rígidos después de la circulación de sacarosa del 30%.
7. Usando un pequeño par de tijeras de disección, corta el cuero cabelludo en la línea media. Comenzando en el hueso occipital y trabajando hacia adelante hacia el hocico. Esto expondrá el cráneo.
8. Usando un par de rongeurs, romper a través del cráneo comenzando en el hueso occipital y continuar hacia adelante para exponer totalmente las superficies del cerebro. Luego gira el lado de la cabeza hacia arriba y disecciona los nervios en la base del cerebro para liberarlo del cráneo.
9. Prepare una solución de sacarosa del 30% con agua libre de RNase y filtre a través de un filtro de malla de nylon de 40 m para reducir la degradación del ARN.
10. Para maximizar la infiltración de la solución de sacarosa, coloque los cerebros diseccionados en una solución de sacarosa del 30% y guárdelos a 4 oC durante la noche. Antes de un procesamiento posterior asegúrese de que el cerebro llegue a la parte inferior de los tubos que contienen la solución de sacarosa.

3. Criopreservación de cerebros que albergan tumores de glioma

1. Antes de criopreservar los cerebros, preparar un frasco lleno de isopentano frío/2-metilbutano y colocar el frasco en un recipiente lleno de nitrógeno líquido. Deje que el disolvente se enfríe.
2. Retire el cerebro de la solución de sacarosa al 30% y seque en un papel de filtro.
3. Etiquete el criomold con un marcador permanente. Con cuidado, agregue aproximadamente 5 ml de OCT (compuesto de temperatura de corte óptimo) en el centro del criomold evitando las burbujas de aire.
4. Coloque el cerebro en criomold que contenga OCT en la orientación deseada. Llene el molde con OCT hasta que el cerebro esté completamente sumergido. Usando fórceps limpios, coloque rápidamente el criomold con OCT y el cerebro en el isopentano frío/2-metilbutano.
5. Una vez que el OCT se solidifique (30-40 s), retire el criomold con el cerebro y colóquelo en hielo seco. No deje el molde que contiene el cerebro en 2-metilbutano más allá de 2 min ya que esto puede causar grietas en OCT sólido.

4. Seccionar los tejidos tumorales cerebrales congelados

1. Etiquetar 2 m de polietilenenucato (PEN) con la información de la muestra. Las secciones de tejido se colocarán directamente en estas diapositivas después de la sección.
2. Ajuste la temperatura de la cámara de criostato entre -20 y -24 oC. Antes de seccionar, coloque el bloque de muestra en la cámara de criostato y déjelo equilibrar a la temperatura en la cámara durante 30-60 min.
3. Limpie la cámara de criostato y el portacuchillas con 100% de etanol y rocíe los cepillos que se utilizarán con la solución de limpieza RNase. Trabajando dentro de la cámara de criostato, retire el molde y conecte el bloque OCT que contiene el cerebro al disco de la muestra de criostato con OCT. Coloque el bloque en el soporte del disco y alinee el bloque con la cuchilla.
4. Instale una cuchilla desechable en el soporte de sección.
5. Secciona el cerebro a 10 m de espesor. Asegúrese de que no haya rayas o líneas de arañazos en el tejido. Usando un pincel, aplanar y desenrosque con precaución el tejido sobre la superficie de corte.
6. Monte cuidadosamente el tejido que contiene las secciones cerebrales en diapositivas de vidrio PEN libres de RNase. Voltear los deslizamientos de vidrio cargado positivo con los dedos en dirección del tejido y presionar suavemente el vidrio deslizarse hacia abajo hacia la sección de tejido.
   NOTA: La temperatura de las manos ayudará a que el tejido se adhiera al vidrio.
7. Después de montar las secciones del cerebro en las diapositivas, mantenga las diapositivas en una caja dentro de la cámara de criostato y luego guárdelas a -80 oC. Nunca mantenga los portaobjetos a temperatura ambiente.
   NOTA: El plegado del tejido y el desgarro son comunes. Para un análisis posterior preciso, es importante minimizar estos artefactos.

5. Fijación y tinción de secciones de tejido cerebral crioconservado

1. Para preservar la integridad del ARN, limpie todos los instrumentos que se utilizarán con la solución de limpieza RNase. Proceda con el protocolo de fijación y tinción dentro de una campana de humo.
2. Prepare las soluciones fijativas descritas en tubos limpios libres de RNase de 50 ml. Haga todas las soluciones con agua libre de RNase el día de la tinción.
3. El mismo día que se realizará la microdisección láser, preparar soluciones de etanol al 100%, 95%, 70% y 50%. Mantenga las soluciones en tubos herméticamente cerrados a temperatura ambiente.
4. Preparar un 4% de violeta Cresyl y un 0,5% de eosina Y en 75% de solución de etanol. Vortex la solución vigorosamente durante 1 min y filtrarlos a través de un filtro de nylon de 0,45 m para eliminar los rastros de polvo no disuelto.
5. Colocar los portaobjetos en un recipiente con 95% de etanol durante 30 s. Transfiera los portaobjetos al tubo que contiene 75% de etanol; Dejar toboganes allí durante 30 s.
6. Transfiera los portaobjetos al 50% de etanol y déjelos allí durante 25 s. En este punto, el PTU se disolverá. Transfiera la diapositiva a una solución violeta de Cresyl al 4% durante 20 s y, a continuación, transfiera a una solución de eosina Y al 0,5% durante 5 s.
7. Saque la diapositiva de la solución de tinte y seque la diapositiva con un papel de filtro. A continuación, coloque los portaobjetos en 50% etanol durante 25 s. Transfiera las diapositivas al 75% de etanol durante 25 s. Transfiera las diapositivas al 95% de etanol durante 30 s. Transfiera las diapositivas al 100% de etanol para 60 s.
8. Enjuague la diapositiva con xileno. Transfiéralos a un recipiente con xileno y espere 3 min.
9. Prepare el medio de montaje (por ejemplo, goma Pinpoint) en agua libre de RNase. Para montar secciones cerebrales de ratón, diluir el medio de montaje en agua libre de RNase en una proporción de 1:10.
10. Seque los portaobjetos en una superficie libre de RNase a temperatura ambiente durante 10 s. Antes de que el xileno se seque, proceda a montar los portaobjetos con las secciones de tejido.
11. Disperse suavemente la solución de montaje en la parte superior del tejido de la corredera con un pincel fino estéril y libre de RNase. Espere 10-20 s, y luego transfiera inmediatamente los portaobjetos a la plataforma de microdisección del microscopio.
    NOTA: La relación entre el medio de montaje y el agua libre de RNase utilizado para el montaje varía en función del tejido de interés. La relación medio/agua de montaje preserva la morfología del tejido glioma para la microdisección láser sin afectar la integridad del ARN.

6. Microdisección de captura láser

NOTA: Es necesario utilizar un microscopio de microdisección de captura láser para microdiseccionar con láser áreas específicas de interés dentro del tejido tumoral. Para minimizar el tiempo para la microdisección láser tisular, prepare el microscopio LMD antes de la fijación y la tinción.

1. Para iniciar el sistema, primero encienda la tira de alimentación, seguido de encender el láser. A continuación, encienda el controlador del microscopio y el ordenador. Inicie el software LMD.
2. En Control de microscopio, seleccione aumento de 10x. En Control láser, establezca los parámetros láser para la disección de tejidos. Establezca una frecuencia láser de 120 Hz para obtener los mejores resultados de corte. Ajuste siempre la corriente láser al 100%.
3. Para una microdisección láser precisa, ajuste la velocidad a 10 y un ajuste de apertura a 2.0-10.0 m. Ajuste la potencia a 53. Tener la potencia láser en un ajuste más alto puede causar aguafuerte de vidrio.
4. Cargue el colector de tejido que capturará el tejido después de la disección. Haga clic en el segundo botón de descarga. Retire el colector vacío y coloque los tubos de cabeza plana DE 0,5 ml PCR libres de DNase/RNase que contengan 30 ml de tampón de lisis en el colector. Vuelva a colocar el colector en la máquina y haga clic en Continuar en el software para continuar.
5. Cargue la muestra procesada (fija y manchada) en el microscopio. Primero, haga clic en descargar en el software LMD. A continuación, monte la muestra en el portaobjetos y coloque el portaobjetos en el escenario. Haga clic en Continuar en el software para continuar.
6. En las ventanas Cortar formas, seleccione Dibujar + Cortar. Utilice los controles del microscopio para encontrar el área de interés. Dibuje la región de interés (ROI) y seleccione un tubo colector de destino. Es posible dibujar varios ROIs para micro diseccionar diferentes áreas de una sola diapositiva al mismo tiempo.
7. Haga clic en Iniciar corte para proceder a la microdisección tisular. Después de seccionar las áreas de interés, retire los tubos colectores del soporte y coloque los tubos sobre hielo seco. Transfiera las muestras de tejido de ARN recogidas a -80 oC para su almacenamiento a largo plazo.

7. Aislamiento de ARN del tejido glioma microdiseccionado

1. Para la extracción de ARN de LMD, utilice un kit de aislamiento de ARN optimizado para muestras pequeñas y bajo rendimiento de ARN (ver Tabla de Materiales). Siga las instrucciones de fabricación. Llevar a cabo todos los pasos de aislamiento a temperatura ambiente (25 oC). Para mantener la calidad del ARN, trabaje rápidamente. Preparar todas las soluciones según lo indicado por el fabricante.
2. Ajustar el volumen de la muestra a 350 ml con tampón de lisis con 1% de mercaptoetanol. Vortex la muestra durante 40 s con el fin de reducir la viscosidad de la muestra y aumentar la eficiencia de la columna de espín de arn.
3. Transfiera la totalidad de la muestra a una columna de giro eliminator gDNA colocada en un tubo de recogida de 2 ml. Centrifugar el tubo durante 30 s a 8.000 x g. Guarde el flujo y asegúrese de que no quede líquido en la columna después de la centrifugación.
4. Añadir 350 s de etanol al 70% al flujo y mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la muestra a una columna de giro de elusión de ARN colocada en un tubo de recogida de 2 ml. Cierre la tapa suavemente y centrífuga durante 15 s a 8.000 x g. Deseche el flujo a través, guardando la columna.
5. Añadir 700 l de tampón de lavado de ARN 1 (20% etanol, 900 mM GITC, 10 mM Tris-HCl pH 7.5) a la columna de giro de elución de ARN. Cierre suavemente la tapa y centrífuga durante 15 s a 8.000 x g para lavar la membrana de la columna de centrifugado. Deseche el flujo.
6. Después de la centrifugación, retire cuidadosamente la columna de espín de elARN del tubo de recolección para que la columna no entre en contacto con el flujo.
7. Añadir 500 l del segundo tampón de lavado de ARN (etanol 80%, NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7.5) a la columna de centrifugado. Cierre la tapa de la columna y gire 8.000 x g durante 20 s para lavar la membrana de la columna. Deseche el flujo.
8. Para lavar la columna de elución de ARN, añadir 500 s de 80% de etanol, cerrar la tapa de la columna y centrifugar a 8000 x g durante 2 min. Tire los tubos con la solución de elución.
9. Utilice un nuevo tubo de recogida, abra la tapa de la columna de centrifugar a 8000 x g durante 5 minutos para secar la columna. Deseche el tubo de elución.
10. Coloque la columna de giro de elución de ARN en un nuevo tubo de recogida de 1,5 ml. Añadir 12 ml de agua libre de RNase calentada a 37 oC directamente al centro de la membrana de la columna de espín. Espere 4 minutos y centrífuga durante 1 min a toda velocidad para eluir el ARN.

8. Control de calidad del ARN, preparación de bibliotecas y análisis de ARN-Seq

1. Después de la extracción y purificación del ARN, amplificar el ARN y crear una biblioteca de ADNc utilizando un kit especial adecuado para el aislamiento de ARN a concentraciones picomolares siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales). Siga las instrucciones del fabricante. Limpie la estación de trabajo para evitar la contaminación con otros productos de PCR y la degradación nucleasa de las muestras.
2. Si el ARN tiene un valor RIN mayor que 4, lo que significa que el ARN es de buena calidad o sólo parcialmente degradado, proceda con el paso de fragmentación. Prepara todos los objetos sobre hielo.
3. Cree una mezcla maestra como se indica (Tabla 1). Cree una mezcla de reacción en un tubo PCR de pared delgada de 0,2 ml sin nucleasa. Incubar los tubos a 94 oC en un ciclor térmico de tapa caliente. El tiempo de incubación de fragmentación depende de la calidad del ARN. RIN 7: 4 min, RIN 5-6: 3 min, RIN 4-5: 2 min.
4. Después de la incubación, coloque los tubos en un estante de PCR que se enfrió previamente a -20 oC y déjelo sentado durante 2 minutos.
5. Para cada tubo de muestra de ARN, prepare la primera mezcla maestra de reacción de síntesis de hebras (Tabla 2). Incubar los tubos en un ciclor térmico de tapa caliente en las condiciones descritas en la Tabla 3. los productos de ADNc se pueden congelar a -20 oC hasta dos semanas antes de proceder al siguiente paso.
6. Cree la mezcla maestra PCR como se indica en el Cuadro 4. Coloque los tubos en un ciclor térmico de tapa caliente y ejecute la reacción de PCR bajo los ajustes indicados en la Tabla 5.
7. Permita que las cuentas, que se utilizarán para purificar el ADN, se calienten a temperatura ambiente. Una vez calentado, añadir 40 s de las cuentas a cada muestra. Vortex los tubos para mezclar y girar hacia abajo brevemente para recoger líquido en la parte inferior del tubo. Deje que los tubos se incuban a temperatura ambiente durante 8 minutos para permitir que el ADN se una a las cuentas.
8. Coloque los tubos en un dispositivo de separación magnética y deje sentarse durante unos 5 minutos, o hasta que la solución se vuelva completamente clara. Manteniendo los tubos en el dispositivo de separación, utilice una pipeta para quitar el sobrenadante cuidadosamente sin alterar las perlas.
9. Manteniendo los tubos en el dispositivo de separación, añadir 200 s de etanol recién hecho 80% a las cuentas para lavar sin perturbar las cuentas. Espere 30 s antes de retirar el 80% de etanol. Repita este paso.
10. Gire brevemente por los tubos y vuelva a colocarlos en el dispositivo de separación. Retire cualquier etanol residual del 80% sin perturbar las perlas.
11. Deje que los tubos se sequen al aire con las tapas abiertas durante 5 min. No lo deje sensato más tiempo, ya que las cuentas se secarán en exceso.
12. Manteniendo los tubos en el dispositivo de separación, agregue 52 s de agua libre de nucleasas para cubrir las cuentas. Retire los tubos del dispositivo de separación y la pipeta hacia arriba y hacia abajo hasta que se resuspendan todas las perlas. Incubar a 5 min a temperatura ambiente.
13. Vuelva a colocar los tubos en el dispositivo de separación hasta que la solución quede clara, aproximadamente 1 min. Transfiera 50 sL del sobrenadante resultante a los pozos de una tira de 8 pozos. Añadir 40 s l de nuevas perlas a cada muestra. Vórtice a fondo para mezclar. Permita que las perlas se unan al ADN incubando a temperatura ambiente durante 8 min.
14. Durante este período de incubación, comience a descongelar los componentes que se utilizarán para cualquier ARNR presente en las muestras. Una vez desconwestresados, colócalos en hielo. Además, precalentar un ciclor térmico a 72 oC.
15. Coloque las muestras en el dispositivo de separación magnética hasta que la solución se despeje (aproximadamente 5 min). Aliquot 1,5 l de sondas por muestra a un tubo PCR refrigerado. Coloque el tubo en el ciclor térmico precalentado bajo los ajustes de 72 oC durante 2 min y 4 oC.
16. Manteniendo los tubos de muestra en el dispositivo de separación magnética, retire el sobrenadante con un pipeta sin perturbar las perlas. A continuación, añadir 200 l de etanol recién hecho 80% a las cuentas para lavar sin perturbar las cuentas. Espere 30 s antes de retirar el 80% de etanol. Repita este paso.
17. Gire brevemente por los tubos y vuelva a colocarlos en el dispositivo de separación. Retire cualquier etanol residual del 80% sin perturbar las perlas. Deje que los tubos se sequen al aire con las tapas abiertas durante 2 min. No deje que se sente más tiempo, ya que las cuentas se secarán en exceso.
18. Prepare la mezcla maestra para todas las muestras combinando los siguientes componentes en el orden presentado(Tabla 6).
19. Mezcle la mezcla maestra por vórtice y agregue 22 s de la mezcla a las cuentas secas de cada muestra y mezcle bien para resuspender. Dejar incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
20. Gire hacia abajo los tubos y colóquelos en el dispositivo de separación magnética durante 1 minuto o hasta que las muestras se borren. Transfiera 20 l del sobrenadante, sin perturbar las perlas a nuevos tubos PCR. Coloque los tubos en un ciclor térmico precalentado bajo los ajustes de la Tabla 7.
21. Prepare una mezcla maestra de PCR para obtener suficiente para las reacciones de cada muestra. Agregue los siguientes componentes a la mezcla maestra en la Tabla 8indicada. Añadir 80 l de la mezcla maestra de PCR a cada uno de los tubos de muestra del paso 8.20 y colocar en el ciclor térmico en los siguientes ajustes (Tabla 9).
22. Permita que las perlas, que se utilizarán para purificar el ADN, se calienten a temperatura ambiente. Una vez calentado, añadir 100 s de las cuentas a cada muestra. Deje que los tubos se incuban a temperatura ambiente durante 8 minutos para permitir que el ADN se una a las cuentas.
23. Coloque los tubos en un dispositivo de separación magnética y deje sentarse durante unos 5 minutos, o hasta que la solución se vuelva completamente clara.
24. Manteniendo los tubos en el dispositivo de separación, utilice una pipeta para quitar el sobrenadante cuidadosamente sin alterar las perlas.
25. Manteniendo los tubos en el dispositivo de separación, añadir 200 s de etanol recién hecho 80% a las cuentas para lavar sin perturbar las cuentas. Espere 30 s antes de retirar el 80% de etanol. Repita este paso.
26. Brevemente, gire por los tubos y vuelva a colocarlos en el dispositivo de separación. Retire cualquier etanol residual del 80% sin perturbar las perlas.
27. Deje que los tubos se sequen al aire con las tapas abiertas durante 5 min. No deje que se quede más tiempo, ya que las cuentas se secarán en exceso. Pipeta de 20 l de Tris Buffer al pellet seco. Retire el tubo del dispositivo de separación y mezcle bien con un pipeta para resuspender las perlas. Dejar incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
28. Coloque los tubos en el dispositivo de separación durante 2 minutos, o hasta que la solución se aclare. Adquiere el sobrenadante y transfiéralo a nuevos tubos. A continuación, almacene la solución recogida a -20 oC.
29. Compruebe la necesidad de las bibliotecas finales para el control de calidad y cantidad. Agrupa las muestras, agrupadas y secuenciadas, como lecturas de 50 nt de extremo emparejado, de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.

Resultados

Nuestro laboratorio ha generado modelos de ratón genéticamente diseñados (GEMM) utilizando el sistema de transposasa de belleza durmiente(Figura 1A). Este sistema incorpora alteraciones genéticas específicas en el genoma de las células progenitoras neuronales en ratones neonatales. Estas células progenitoras alteradas forman tumores glioma endógenos. Las secuencias de plásmidos utilizadas para generar los tumores fueron: (1) pT2C-Luc...

Discusión

Comprender los mecanismos moleculares subyacentes a la heterogeneidad e invasión del glioma es de vital importancia para descubrir nuevas dianas terapéuticas¹³. En este manuscrito, describimos un método detallado y optimizado para analizar el paisaje molecular de la heterogeneidad e invasión del glioma utilizando microdisección de captura láser (LMD) seguida de análisis transcriptomico.

La microdisección de captura láser (LMD) se puede utilizar para identificar...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase Cell Detachment Solution	Biolegend	423201
Animal-Free Recombinant Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Gibco	15240062
B-27 Supplement (50X), serum free	Gibco	17504044
Buffer RLT	Qiagen	79216
Corning PCR Tubes	Sigma Aldrich	CLS6530
Cresyl Violet Acetate	Sigma Aldrich	C5042
DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12	Gibco	11330057
Eosin Y	Sigma Aldrich	E4009
HiSeq 4000	Illumina	N/A
Laser Microdissection (LMD) System	Leica	LMD7000
N-2 Supplement (100X)	Gibco	17502048
Normocin - Antimicrobial Reagent	Invivogen	ant-nr-1
Peel Away Disposable Embedding Molds	Electron Microscopy Sciences	70182
PEN Membrane Glass Slide (2 µm)	Lieca	1150518
Pinpoint Solution	Zymo Research	D3001-1
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B-1MG
Research Cryostat	Leica	CM3050s
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Fisher Scientific	AM9780
RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian	Takara Bio	634411
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571