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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Empleamos un protocolo geológico (coring) de muestreo para adquirir muestras óseas corticales de tamaño uniforme para experimentos SRμCT desde el aspecto anterior de la femora humana. Este método es mínimamente destructivo, eficiente, resulta en muestras cilíndricas que minimizan los artefactos de imagen de formas de muestra irregulares y mejora la visualización y análisis microarquiitectural.

Resumen

El hueso es un tejido dinámico y mecánicamente activo que cambia de estructura sobre la vida útil humana. Los productos del proceso de remodelación ósea han sido estudiados sustancialmente utilizando técnicas bidimensionales tradicionales. Los recientes avances en la tecnología de imágenes de rayos X a través de tomografía micro-computarizada de escritorio (μCT) y tomografía micro-computarizada de radiación sincrotrón (SRμCT) han permitido la adquisición de escaneos tridimensionales de alta resolución (3D) de un campo de visión más grande (FOV) que otras técnicas de imágenes 3D (por ejemplo, SEM) proporcionando una imagen más completa de las estructuras microscópicas dentro del hueso cortical humano. Sin embargo, la muestra debe centrarse con precisión dentro del FOV para limitar la aparición de artefactos de rayas conocidos por afectar el análisis de datos. Estudios anteriores han reportado la adquisición de bloques óseos rectilíneas de forma irregular que resultan en artefactos de imágenes debido a bordes irregulares o truncamiento de imagen. Hemos aplicado un protocolo de muestreo geológico (coring) para adquirir especímenes de núcleo óseo cortical de tamaño consistente para experimentos SRμCT desde el aspecto anterior de la femora humana. Este método de coring es eficiente y mínimamente destructivo para el tejido. Crea muestras cilíndricas uniformes que disminuyen los artefactos de imagen por naturaleza de ser isométricos durante la rotación y proporcionan una longitud de trayecto uniforme para los haces de rayos X a lo largo del escaneo. El procesamiento de imágenes de datos tomográficos de rayos X de muestras con forma irregular y de cored confirma el potencial de la técnica para mejorar la visualización y el análisis de la microarquitectura ósea cortical. Un objetivo de este protocolo es ofrecer un método confiable y repetible para la extracción de núcleos óseos corticales que es adaptable para varios tipos de experimentos de imágenes óseas de alta resolución. Un objetivo general de la obra es crear una adquisición de hueso cortical estandarizado para SRμCT que sea asequible, consistente y directa. Este procedimiento puede ser adaptado por investigadores en campos relacionados que comúnmente evalúan materiales compuestos duros como antropología biológica, geociencias o ciencias materiales.

Introducción

Con los recientes avances en la tecnología de imágenes, ahora es factible adquirir datos de imágenes de rayos X con muy alta resolución. Los sistemas micro-CT de escritorio (μCT) son el estándar actual para el hueso canceloso por imágenes debido a su naturaleza no destructiva1. Sin embargo, cuando las características microestructurales por imágenes del hueso cortical, el uso de μCT ha sido más limitado. Debido a las restricciones de resolución, los sistemas de escritorio no pueden alcanzar la resolución necesaria para crear imágenes de características microestructurales más pequeñas que los poros corticales, como las lagunas de osteocitos. Para esta aplicación, SRμCT es ideal debido a la mayor resolución de estos sistemas1. Por ejemplo, los experimentos en la Fuente de Luz Canadiense (CLS) en las líneas de haz de imágenes y terapia biomédicas (BMIT)2 han producido imágenes con voxels de hasta 0,9 μm. Estudios previos1,3,4,5 han utilizado esta resolución para adquirir proyecciones y posteriores renderizaciones tridimensionales (3D) a partir de especímenes óseos corticales de huesos largos humanos(Figura 1)para cuantificar la densidad de lacunar de osteocitos4,6,7,8,9 y variación en la forma de lacunar y tamaño3 a lo largo de la vida humana y entre los sexos. Otros estudios han demostrado la presencia de bandas de osteones en humanos10,un fenómeno previamente reconocido como asociado sólo con mamíferos no humanos en la literatura antropológica forense.

Para lograr una resolución excepcional, el haz de rayos X debe centrarse finamente dentro del campo de visión (FOV), que a menudo limita el tamaño máximo de la muestra a unos pocos milímetros de diámetro. Actualmente, no ha habido procedimientos completos y estandarizados descritos en la literatura que describa la adquisición de muestras óseas que cumplan estas restricciones. El centrado de muestras dentro del FOV es fundamental para garantizar que 1) la muestra permanezca centrada a medida que gira 180° durante la toma de imágenes, y 2) artefactos de escaneo son limitados ya que no hay truncamiento de imagen. En otras palabras, ninguna porción de la muestra fuera del FOV interfiere con el haz que entra en su punto focal dentro del FOV. Si esto ocurre, el algoritmo de reconstrucción se ve privado de algunos de los datos de atenuación necesarios para una reconstrucción totalmente correcta. Vale la pena señalar además que los escaneos de 360° (rotación completa) minimizan los efectos del endurecimiento del haz, pero aumentan los artefactos causados por la desalineación y el movimiento de la muestra durante la toma de imágenes. Por lo tanto, mientras que una exploración de 360° normalmente generará datos más limpios, el tiempo de imagen se duplica y por lo tanto se debe abordar un compromiso entre el costo experimental y la calidad de los datos.

Un aspecto importante y a menudo pasado por alto de los experimentos de imágenes óseas es la técnica de preparación de muestras precisa y replicable realizada antes de la exploración. Los estudios que incorporan métodos SRμCT en sus experimentos mencionan brevemente su protocolo de muestreo, pero los autores proporcionan poco o ningún detalle con respecto a la metodología particular utilizada para reunir sus especímenes. Muchos de estos estudios mencionan el corte de bloques óseos rectilíneos de dimensiones arbitrarias, pero generalmente no proporcionan más información sobre las herramientas o materiales de incrustación utilizados3,4,10,11,12,13,14. Algunos investigadores utilizan comúnmente herramientas rotativas portátiles (por ejemplo, Dremel) para eliminar bloques rectilíneas de hueso de una región de interés (ROI)3,4,10,11,12,13,14. Este método da como resultado muestras de tamaño no uniforme que pueden ser mayores que la FOV, lo que aumenta la probabilidad de artefactos de exploración y truncamiento de imagen. Estos especímenes a menudo requieren más refinación utilizando una sierra de diamantes y obleas de precisión (por ejemplo, Buehler Isomet). La adquisición de muestras con dimensiones coherentes (hasta las dos centésimas/mm) es fundamental para garantizar que los datasets adquiridos sean de la más alta calidad y que los resultados posteriores sean replicables.

La limitada notificación de la metodología de adquisición de muestras añade una capa adicional de dificultad al intentar emplear y/o validar métodos realizados en un estudio anterior. Actualmente, los investigadores deben ponerse en contacto directamente con los autores para obtener más detalles sobre sus procedimientos de muestreo. El protocolo detallado aquí proporciona a los investigadores biomédicos una técnica de muestreo completamente documentada, replicable y rentable. El objetivo principal de este artículo es proporcionar un tutorial completo sobre cómo adquirir muestras de núcleo óseo cortical de tamaño consistente utilizando una prensa de perforación de molino y broca de diamante para la visualización y extracción precisas de datos microarquiitecturales. Este método se modifica a partir de procedimientos utilizados para recoger rutinariamente cilindros uniformes de diámetro pequeño (1-5 mm) de bloques de materiales duros en mecánica de roca de alta presión15,16,17,18,19.

Protocolo

Todos los especímenes procedían de donantes cadavéricos embalsamados de la Universidad de Toledo, la Facultad de Medicina y Ciencias de la Vida y la Universidad Médica del Noreste de Ohio (NEOMED), con el consentimiento informado del propio donante o de los parientes más cercanos del donante. La Junta de Revisión Institucional para la Protección de los Sujetos Humanos (IRB) de la Universidad de Akron consideró que estos especímenes estaban exentos de una revisión completa del IRB, ya que no se adquirieron de individuos vivos. La información demográfica, incluida la edad, el sexo y la causa de la muerte, estaba disponible para todos los donantes. Los individuos seleccionados no tenían condiciones de afectación ósea documentadas ni exposición a regímenes de tratamiento que pudieran haber afectado la remodelación ósea en el momento de la muerte. Se obtuvieron muestras óseas corticales de femora de machos y hembras modernos cadavéricos con edades que oscilaban entre los 19 y los 101 años de edad (media = 73,9 años). El árbol medio femoral ha sido estudiado extensamente incluyendo exámenes de variación en porosidad cortical20,21,22,23,24 y densidad material del tejido óseo25,26,27,y por lo tanto se ha convertido en un sitio comúnmente utilizado para análisis microestructurales.

1. Adquisición y maceración de tejidos

  1. Utilice una sierra oscilante equipada con una hoja de carburo de corte a presión (para materiales compuestos) para adquirir ~7,5 cm bloques óseos de la mitad de las diafisias de la femora izquierda.
  2. Remoje los bloques femorales en un plato de vidrio apto para horno lleno de una enzima proteasa en polvo y solución de agua del grifo durante 1 h en una incubadora situada a 45 °C.
  3. Después de la incubación, retire cuidadosamente los tejidos blandos y periosteum restantes utilizando disección contundente o herramientas dentales.
    NOTA: Evite el uso de herramientas afiladas (por ejemplo, bisturí) para eliminar los tejidos blandos. Tales instrumentos pueden causar daños en el hueso que se detectan en las exploraciones μCT, afectando la preservación de la muestra y la calidad de los datos de escaneo.
  4. Retire los desechos u oclusiones en la cavidad medular colocando bloques óseos en un limpiador ultrasónico durante 5-10 minutos con 20:1 partes de agua del grifo a la solución de limpieza (ver Tabla de Materiales)o usando un hilo dental de agua portátil (por ejemplo, Waterpik).
  5. Sumerja el bloque óseo en una taza de espécimen y llénelo con un 70% de etanol. Deje que el hueso se empape durante al menos 24 horas para eliminar los lípidos.
    NOTA: Los xilenos también se pueden utilizar para eliminar los lípidos. El remojo prolongado en xilenos, sin embargo, puede hacer que el hueso sea quebradizo o calcáreo, ya que es un emulsionante.
  6. Después de 24 horas, retire los bloques óseos del etanol y deje secar al aire a temperatura ambiente durante 24-48 horas.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

2. Sección de tejidos

  1. Coloque una diapositiva de microscopio de vidrio de 75 x 25 mm sobre una placa caliente situada a 140 °C. Derretir una generosa cantidad de resina epoxi térmica (ver Tabla de Materiales)en el centro de la diapositiva.
    1. Si se preparan secciones delgadas adicionales para la microscopía (<50 μm), es posible que sea necesario incrustar el bloque óseo en una epoxi de dos partes para preservar la trabeculae. Además, al implementar este protocolo para muestras frágiles (por ejemplo, hueso diagenético o especímenes altamente trabecularizados) es necesario incrustar muestras en una epoxi.
      NOTA: Las muestras óseas utilizadas en este protocolo fueron recuperadas de muestras cadavéricas embalsamadas. Si se recogen muestras frescas en la autopsia o en una caja quirúrgica para examinar las estructuras de tejidos blandos (por ejemplo, vasculatura) a través de SRμCT, la impregnación con epoxi puede inducir daños en dichos tejidos. En estos casos, se recomienda un adhesivo alternativo o medio de montaje (por ejemplo, cinta de doble cara, arcilla de modelado).
  2. Presione el aspecto inferior del bloque óseo en la resina epoxi térmica en la diapositiva del microscopio, con la longitud del hueso perpendicular a la diapositiva. Cambie la muestra de un lado a otro para cubrir la parte inferior del hueso y asegurar una adhesión segura a la diapositiva.
  3. Deje reposar la muestra montada en la placa caliente durante ~5 min para permitir que el epoxi térmico se agache en poros y/o grietas.
    NOTA: El epoxi en la diapositiva debe estar libre de burbujas para una mejor adherencia. Para eliminar burbujas, cambie la muestra hacia adelante y hacia atrás en la diapositiva. Las burbujas a menudo se forman debido al agua y/o etanol atrapado dentro del hueso escapando y evaporándose.
  4. Retire el tobogán con la muestra montada de la placa caliente usando fórceps contundentes y deje enfriar a temperatura ambiente durante ~ 10 minutos. Retire cualquier epoxi del borde de la diapositiva usando una cuchilla de afeitar para asegurarse de que el mandril agarre adecuadamente la diapositiva.
  5. Coloque la diapositiva con la muestra adherida a un mandril deslizante de vidrio y monte el mandril en el brazo giratorio de una sierra de sección de velocidad lenta (consulte Tabla de materiales, Figura 2).
    NOTA: Mientras que una sierra Buehler IsoMet se empleó en este protocolo, hay disponibles otras sierras de sección de precisión que podrían utilizarse en lugar del IsoMet (por ejemplo, Leco, Exakt, Smartcut, CT3, Buehler Petrothin, Well Diamond Wire).
  6. Ajuste el brazo giratorio utilizando el dial de posicionamiento para asegurarse de que la hoja entra en contactos y transecciona la muestra. Coloque la muestra de tal forma que se corte una sección transversal del hueso perpendicular a su longitud.
  7. Agregue pesas al otro lado del brazo de corte para contrarrestar el peso del brazo.
    NOTA: Si se utiliza un contrapeso insuficiente, la muestra puede soportar la hoja y hacer que la hoja se fracture.
  8. Agregue el líquido de corte (20:1 partes de agua al líquido de corte) al receptáculo líquido de la sierra.
  9. Asegure firmemente la hoja de oblea de diamante y asegúrese de que el nivel de fluido sumerja la porción de corte de la hoja. Ajuste la velocidad a 200 RPM y baje lentamente la muestra sobre la hoja (Figura 3).
  10. Asegúrese de que la hoja y el mandril no se tambalee y/o rebote. Si se observa un movimiento excesivo, detenga inmediatamente la sierra y apriete el conjunto de la hoja y/o del brazo del mandril antes de reanudar el corte. Agregue contrapesos adicionales si el mandril se mueve agresivamente hacia arriba y hacia abajo. El movimiento excesivo, incluido el movimiento visible de lado a lado, puede hacer que la hoja se fracture.
  11. La primera sección gruesa es un "corte de residuos" para proporcionar una superficie bien definida paralela a cada corte adicional. Después del corte inicial de residuos, levante el brazo giratorio y mueva el mandril hacia la hoja de 5 mm usando el dial de posicionamiento. Con este método se pueden recoger más secciones gruesas (~1 mm) para microscopía.
    NOTA: Con el fin de ahorrar tejido valioso, se puede omitir el corte de residuos. Sin embargo, al seccionar una muestra con un borde desigual, es fundamental que el pico de la muestra se alinee tangencialmente hasta el borde de la broca de perforación.
    1. Asegúrese de tener en cuenta el kerf de la hoja al seccionar. Por ejemplo, para obtener una sección de 5 mm de una hoja que tiene un kerf de 0,5 mm, mueva la muestra y tire 5,5 mm hacia la hoja.
  12. Una vez completada la sección, coloque el tobogán de vidrio con la muestra montada en una placa caliente para fundir la epoxi térmica. Esto permite la eliminación rápida de los bloques óseos de la diapositiva.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

3. Perforación de muestras

  1. Monte secciones óseas de 5 mm hasta la parte inferior de una lata de aluminio poco profunda (~8 cm de diámetro) utilizando la técnica de unión epoxi térmica como se describe en los pasos 2.2-2.4.
  2. Coloque lata en una mesa de máquina XY de la prensa de perforación del molino (consulte Tabla de materiales)y apriete las abrazaderas fijadoras de mano (Figura 4).
  3. Inserte la broca de perforación con punta de diamante del joyero de eje hueco de diámetro interior de 2 mm (consulte Tabla de materiales)en el mandril de perforación del molino. Ajuste el limitador de profundidad para evitar el corte a través de la lata (Figura 5).
  4. Alinee el aspecto anterior central de la muestra ósea debajo de la broca evitando el contacto cercano con el periosteum, el endosteum o las áreas altamente trabecularizadas.
    NOTA: La selección automatizada de cortices femorales de parte media anterior no es factible, ya que el grosor cortical varía entre los individuos, especialmente con el aumento de la edad.
  5. Llene la lata con agua destilada para cubrir completamente la muestra. Esto evita la acumulación de calor, la quema de la muestra y/o el daño a la broca durante el encinamiento.
    NOTA: Para evaluar la posibilidad de daños por calor causados por el corte, se utilizó un termómetro infrarrojo para lograr lecturas de temperatura del agua destilada, ya que la broca de perforación penetró primero en la superficie de los huesos. La temperatura varió en 1 °C, de 22.9 a 23.9 ° C entre las diez muestras cored para esta prueba. Por lo tanto, argumentamos que el daño inducido por calor es insignificante.
  6. Para los primeros casos de contacto entre la broca central y el hueso, aplique presión suave para usar un anillo en la superficie superior del hueso. Esto evita la desviación de la broca al principio del proceso de perforación y garantiza la correcta colocación de la broca.
  7. Durante el coring, levante la broca dentro y fuera de la muestra mientras mantiene la punta de la broca debajo de la superficie del agua. Continúe con esta técnica cada pocos segundos para eliminar el polvo óseo atrapado y asegurarse de que los desechos no ocluyen la broca.
    NOTA: Si el núcleo está formando una forma cónica, es probable que se deba a 1) lo que no permite suficiente tiempo para eliminar el polvo óseo de la broca, y 2) el corte está ocurriendo demasiado rápido. El aumento de la velocidad puede romper piezas grandes de la muestra y pulverizar el aspecto superior.
  8. Una vez completado el cordón, el núcleo óseo resultante puede quedar alojado en la broca de taladro hueco (Figura 6). Utilice un par de fórceps de punta fina o una pequeña llave Allen para desalojar el núcleo del bit (Figura 2).
  9. Almacene la muestra de cored en un tubo de microcentrífuga etiquetado en un lugar fresco y seco hasta que se muestre.

4. Rutinas de procesamiento de imágenes para evaluar los parámetros microarquiitecturales óseos a partir de núcleos óseos corticales

  1. Reconstrucción de imágenes μCT
    1. Descargue e instale la última versión de NRecon en https://www.bruker.com/products/microtomography.html para la reconstrucción de las imágenes de proyección SRμCT.
    2. Seleccione el acceso directo NRecon en el escritorio y aparecerá el GPUReconServer asociado.
    3. Abra el conjunto de datos deseado en la ventana emergente. Si no aparece la ventana, seleccione el icono de carpeta en la esquina superior izquierda de la ventana del visionador de datos.
    4. Seleccione la primera proyección de la adquisición de SRμCT. En Salida, elimine las selecciones para Usar ROI y Escalas ON.
    5. Elija el destino del archivo de reconstrucción. Seleccione Examinar y cree una nueva carpeta denominada Recon. El formato de archivo seleccionado debe ser BMP(8).
    6. Comprobar compensación de desalineación.
      NOTA: Esta estimación suele estar cerca de corregirse. El renderizado 3D aproximado se puede ajustar manualmente moviendo las flechas hacia arriba y hacia abajo para desplazar las imágenes superpuestas para que los bordes derecho e izquierdo se alineen lo más estrechamente posible.
    7. En Configuración, elija las selecciones deseadas para aplicar los algoritmos Suavizado, Endurecimiento de vigas, Rotación CS, Objeto mayor que FOV y Artefactos de anillo.
    8. Ajuste el histograma en Salida seleccionando Automático.
      NOTA: La imagen resultante puede ser tenue.
    9. Seleccione Iniciar para comenzar a procesar la reconstrucción.
    10. Utilice la nomenclatura estándar para los índices de lacunar canal/osteocito28. Estos pueden incluir: volumen total de tejido VOI (TV), volumen del canal (Ca.V), número total de canales (Ca.N), diámetro medio del canal (Ca.Dm), porosidad cortical (Ca.V/TV), dado como porcentaje, número total de lagunas (N.Lc) y volumen medio de lacunares (Lc.V), entre otros. Para determinar la densidad de lacunar por mm3 (N.Lc/BV), el volumen óseo (BV) se calcula como volumen total menos volumen de canal (TV-Ca.V).
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.
  2. Recopilación de datos microarquiitecturales de imágenes reconstruidas
    1. Descargue e instale la última versión de CTAnalyser en https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html para el análisis de parámetros microarquiitecturales.
      NOTA: La versión gratuita de CTAnalyser es limitada en funcionalidad. Por lo tanto, se recomienda comprar una licencia completa para realizar análisis más detallados.
    2. Bajo | de imagen Propiedades | Cambiar tamaño de píxel, asegúrese de que el tamaño del píxel coincide con el del protocolo de imágenes μCT aplicado.
      NOTA: Si edita imágenes en ImageJ o en un programa similar, tenga en cuenta que al guardar, se modificará el encabezado incrustado en el archivo TIFF y el software de análisis modificará el tamaño de píxel al importar el conjunto de datos.
    3. Seleccione Procesamiento personalizado para crear una lista de tareas (véase Materiales suplementarios) para analizar la microarquitectura ósea desde el dataset de exploración. Un protocolo general para los parámetros de red de osteocitos lacunar utilizando plugins propiedad de CTAnalyser sigue aquí:
      NOTA: La lista de tareas del complemento funciona bien para los conjuntos de datos donde el ejemplo es el único asunto visible en el FOV. Si el espacio vacío rodea la muestra, se requiere la aplicación de un ROI. De lo contrario, los valores recopilados en análisis 3D y análisis de objetos individuales se reducirán artificialmente.
      1. Vuelva a cargar las imágenes para restablecer y/o ajustar cualquier modificación (por ejemplo, desde la edición en ImageJ o similar) antes de abrir el menú Procesamiento personalizado en el software de análisis.
      2. Para reducir el ruido en las imágenes, aplique un filtro gaussiano de paso bajo en espacio 3D con un núcleo redondo y un radio de 2-3.
        NOTA: Esta configuración se aplicó a los conjuntos de datos de los experimentos SRμCT notificados mediante pruebas de prueba y errores. El objetivo era obtener las reconstrucciones de la mejor calidad para los datos. Ajuste los ajustes de reconstrucción para adaptarse a cada configuración experimental única.
      3. Aplique un umbral global de escala de grises a las imágenes seleccionando valores bajos y altos para resaltar los canales vasculares. Las rodajas reconstruidas que se ven en las figuras 8B y 8D representan un umbral de ejemplo de 0-155.
        NOTA: Al igual que el paso 4.2.3.2, la configuración de umbral aplicada aquí se eligió a través de una prueba extensa y un error. Se deben ajustar los umbrales para cada configuración experimental y el sistema de imágenes μCT utilizado.
      4. Despeckle (denoise) para eliminar las motas blancas en el espacio 3D que están dentro del rango de tamaño de píxel volumétrico (voxel) de lacuna de osteocitos con el fin de aislar canales solamente.
        NOTA: Para una exploración SRμCT de hueso cortical humano tomada a 0,9 μm de tamaño de píxel, el límite inferior para lacunae de osteocitos es de 13 voxels.
      5. Despeckle para eliminar cualquier mota negra en el espacio 2D para eliminar artefactos en los canales. Estos pueden ser bastante grandes en 2D, eliminando así las características que son <15.000 píxeles.
      6. Dilatar los poros en el espacio 3D utilizando la función de operación morfológica con un núcleo redondo de 2 o 3 radios, dependiendo de la calidad de las imágenes, con el fin de aislar cualquier tejido blando atrapado en los canales.
      7. Realice una función Despeckle adicional utilizando los mismos ajustes que el paso 4.2.3.5. con el fin de eliminar los tejidos blandos aislados dentro de los canales.
      8. Erosione la dilatación del paso 4.2.3.6. utilizando una función de operación morfológica utilizando un núcleo redondo con 2 o 3 radios. El radio para este paso debe hacer juego el radio utilizado en el procedimiento 4.2.3.6.
      9. Ejecute análisis 3D y seleccione qué parámetros calcular para el volumen de canales vasculares. Por lo general, los valores básicos proporcionarán suficiente información.
      10. Guarde las imágenes procesadas con Guardar mapas de bits en una subcarpeta personalizada del directorio.
        NOTA: Si se crea una imagen de reconstrucción 3D a partir de las imágenes procesadas utilizando un programa como Amira/Avizo, Libélula, Drishti, etc., se recomienda guardar las imágenes como monocromáticas (1 bit).
      11. Calcule el número de canales vasculares y describa su tamaño, forma y orientación utilizando la función Análisis de objetos individuales.
      12. Repita los pasos 4.2.3.1 – 4.2.3.3. para restablecer la imagen para el análisis de lacunar de osteocitos.
      13. Elimine las motas blancas en el espacio 3D mediante la función Despeckle, asegurándose de que estos artefactos sean más pequeños que el límite inferior de tamaño de lacunar. Este paso elimina el ruido de la exploración que puede parecer poros corticales, preservando al mismo tiempo la verdadera laguna de osteocitos. Para escaneos SRμCT humanos de tamaño de píxeles de 0,9 μm, este límite inferior es de 13 voxels.
      14. Despeckle una vez más para eliminar las motas blancas que son más grandes que el límite superior del tamaño de lacunar. Para los datasets SRμCT humanos con la configuración enumerada en el paso 4.2.3.13, este límite es de 2743 voxels.
      15. Realizar análisis 3D para extraer información microestructural relativa a la laguna de osteocito específicamente.
      16. Seleccione Guardar mapas de bits para guardar las imágenes procesadas con el fin de aislar las lagunas de osteocitos.
      17. Realice análisis de objetos individuales para calcular el número de osteocitos en 3D dentro del volumen de interés (VOI) seleccionado.
        NOTA: Una vez establecida y probada la lista de tareas, CTAnalyser tiene una función de administrador de lotes (BatMan) que se puede emplear para acelerar la extracción de datos y garantizar un procesamiento uniforme de imágenes. Una lista de tareas con configuración de ejemplo para Procedimiento 4.2.3. se pueden encontrar en los Materiales Suplementarios.

Resultados

El método descrito de muestreo básico demostró ser altamente eficaz y eficiente. La perforación de muestras utilizando este protocolo permitió la adquisición de muestras de tamaño consistente de >300 para experimentos en la línea de haz CLS BMIT-BM2,con un FOV de ~2 mm a 1,49 μm de tamaño voxel. Para validar la consistencia del diámetro del núcleo, se tomaron tres mediciones a lo largo de la longitud (superior, media, inferior) de un subconjunto de núcleos femorales anteriores humanos...

Discusión

No ha habido un protocolo integral y estandarizado para adquirir muestras uniformes y cilíndricas de núcleo óseo cortical para imágenes SRμCT de alta resolución con configuraciones limitadas de FOV. El protocolo detallado aquí llena ese vacío proporcionando un tutorial completo sobre cómo adquirir muestras de núcleo óseo cortical de tamaño consistente para imágenes SRμCT y la posterior visualización y extracción precisas de datos microarquiitecturales. Hemos demostrado que nuestro protocolo proporciona un...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

La investigación descrita en este artículo se realizó en las instalaciones del BMIT en la Fuente de Luz canadiense, que cuenta con el apoyo de la Fundación canadiense para la Innovación, las Ciencias Naturales y el Consejo de Investigación de Ingeniería de Canadá, la Universidad de Saskatchewan, el Gobierno de Saskatchewan, Western Economic Diversification Canada, el Consejo Nacional de Investigación de Canadá y los Institutos Canadienses de Investigación de la Salud. Los autores quisieran agradecer a los científicos de la fuente de luz canadiense, en particular a Adam Webb, Denise Miller, Sergey Gasilov y Ning Zu por la asistencia en la configuración y solución de problemas de los sistemas de microscopios SkyScan SRμCT y de haz blanco. También queremos agradecer a Beth Dalzell de la Facultad de Medicina y Ciencias de la Vida de la Universidad de Toledo y al Dr. Jeffrey Wenstrup de la Universidad Médica del Noreste de Ohio por el acceso a muestras cadavéricas para este estudio. JM Andronowski cuenta con el apoyo de fondos de investigación de puesta en marcha proporcionados por la Universidad de Akron y una beca del Instituto Nacional de Investigación y Desarrollo de la Justicia en Ciencias Forenses con fines de justicia penal (2018-DU-BX-0188). RA Davis cuenta con el apoyo de una asistente de posgrado proporcionada por la Universidad de Akron. Los equipos y suministros utilizados para el corte y la aserración fueron comprados por fondos de puesta en marcha proporcionados por la Universidad de Akron y la subvención de la NSF EAR-1624242 a CW Holyoke.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1-1/8" plunge cutting carbide for compositesWarrior6181228.6mm plunge
70% EthanolFisher ScientificBP82015003.8 Liters
Blunt-tipped forcepsFisher Scientific10-300
Centrifuge tubesThermoFisher55398
Crystalbond 509-3 EpoxyTed Pella821-3
CTAnalyserBruker microCTv.1.15.4.0Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html
Dental Tool KitAmazon787269885110
Diamond wafering saw blade for composite materialBuehler#11-4247
Drill PressJet Mill/Drill350017Model: JMD-15, benchtop drill presses are suitable substites, but typically lack a translatable machine table for positioning samples beneath the drill stem
Fine-tipped forcepsFisher Scientific22-327379
Fixturing clamps for XY machine table for mill/drillMSC Industrial Supply#04804571
Glass microscope slidesTed Pella2600575x50mm slides, 1mm thick
Glass slide chuckBuehler#112488Large enough to hold 75x50mm glass slides
Hot plate capable of reaching 140 °CThermoScientificHP88850105
IncubatorNAPCOModel 4200
Isocut FluidBuehler111193032Lubricant; 30mL
Jeweler's diamond coring drill bitOtto Frei#119.0502mm inner diameter hollow stem coring bit
NReconBruker microCTv.1.6.10.2Download and install at https://www.bruker.com/products/microtomography.html
Oscillating sawHarbor Freight62866
Oven-safe glass dishesPyrex1117715Glass food storage container
Precision slow-speed saw (Isomet 1000)Buehler111280160
Razor bladesAmazon25181
Shallow aluminum tinsAmazonB01MRWLD0R~8cm diameter
Specimen cupsAmazon616784425436 885334344729
Tergazyme detergentAlconox1304-11.8kg box
Ultrasonic cleanerMTI CorporationKJ201508006

Referencias

  1. Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
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