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Resumen

Este artículo proporciona protocolos para el diseño y autoensamble de nanoestructuras a partir de oligómeros de ácido nucleico modificados gamma en mezclas de disolventes orgánicos.

Resumen

Las estrategias actuales en nanotecnología de ADN y ARN permiten el autoensamble de una variedad de nanoestructuras de ácido nucleico en medios acuosos o sustancialmente hidratados. En este artículo, describimos protocolos detallados que permiten la construcción de arquitecturas de nanofibra en mezclas de disolventes orgánicos a través del autoensamble de baldosas de ácido nucleico péptido modificado en gamma, de una sola cadena, direccionables de forma única. Cada tesela de una sola cadena (SST) es un oligómero de 12 bases de LANA compuesto por dos dominios modulares concatenados de 6 bases cada uno. Cada dominio puede unirse a un dominio mutuamente complementario presente en las hebras vecinas utilizando la complementariedad programada para formar nanofibras que pueden crecer a micras de longitud. El motivo SST está hecho de 9 oligómeros totales para permitir la formación de nanofibras de 3 hélices. En contraste con las nanoestructuras de ADN análogas, que forman estructuras monodispersas de diámetro, estos sistemas de ARPna forman nanofibras que se agrupan a lo largo de sus anchuras durante el autoensamble en mezclas de disolventes orgánicos. Por lo tanto, los protocolos de autoensamble descritos aquí también incluyen un tensioactivo convencional, el sulfato de dodetil sódico (SDS), para reducir los efectos de agrupación.

Introducción

Construcción exitosa de numerosas nanoestructuras complejas1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 en medios acuosos o sustancialmente hidratados hechos con natural ácidos nucleicos que ocurren tales como ADN1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 y RNA11,12 se ha demostrado en trabajos anteriores. Sin embargo, los ácidos nucleicos de origen natural se someten a cambios de conformación helicoidales dúplex o han reducido las estabilidades térmicas en mezclas de disolventes orgánicos13,14.

Anteriormente, nuestro laboratorio ha informado de un método para la construcción de nanofibras de 3 hélices utilizando imitaciones de ácido nucleico sintético modificado de posición gamma llamadas ácidos nucleicos de péptido gamma (-PNA)15 (Figura 1A). La necesidad de tal desarrollo y aplicaciones potenciales del ácido nucleico sintético imitado PNA se ha discutido en el campo16,17. Hemos demostrado, a través de una adaptación de la estrategia de baldosas de una sola cadena (SST) presentada para las nanoestructuras de ADN18,19,20, que 9 oligómeros de la VNA secuencialmente distintos pueden ser diseñados para formar nanofibras de 3 hélices en mezclas selectas de disolventes orgánicos aproticos polares como DMSO y DMF. Los oligómeros de la APna fueron ordenados comercialmente con modificaciones de (R)-dietilenglicol (mini-PEG) en tres γ posiciones (1, 4 y 8 posiciones de base) a lo largo de cada oligómero de 12 bases basado en métodos publicados por Sahu et al. 21 Estas modificaciones gamma provocan la pre-organización helicoidal que está asociada con la mayor afinidad de unión y la estabilidad térmica de la ADN en relación con la ANP no modificada.

Este artículo es una adaptación de nuestro trabajo reportado en el que investigamos los efectos de la solución solvente y la sustitución por ADN en la formación de nanoestructuras basadas enELPna 15. El objetivo de este artículo es proporcionar descripciones detalladas del diseño, así como protocolos detallados para los métodos adaptados a disolventes que se desarrollaron para el autoensamble y la caracterización de la nanofibra de LAPNA. Por lo tanto, primero presentamos la estrategia modular SST, una plataforma general para el diseño de nanoestructuras utilizando el ácido nucleico sintético imitar PNA.

Se ha informado que el tono helicoidal para los dúplex PNA es de 18 bases por turno en comparación con los dúplex de ADN, que se someten a un giro por 10,5 bases(Figura 1B). Por lo tanto, la longitud de dominio de los SST de la serie de comandos de la serie de datos de la serie de productos se estableció en 6 bases para dar cabida a un tercio de un giro completo o a 120o de rotación para permitir la interacción entre tres hélices triangularmente matrices. Además, a diferencia de los motivos anteriores de SST, cada SST contiene solo 2 dominios, creando efectivamente una estructura de 1 dimensión similar a una cinta que se ajusta para formar un paquete de tres hélices (Figura 1C). Cada oligómero de 12 bases de LA APna se modifica gammamente en las posiciones 1, 4 y 8 para garantizar una distribución uniformemente espaciada de los grupos mini-PEG a través del motivo general de SST. Además, dentro del motivo, hay dos tipos de oligómeros: hebras "contiguas" que existen en una sola hélice y hebras "cruzadas" que abarcan hélices (Figura 1D). Además, los oligómeros P8 y P6 están etiquetados con Cy3 fluorescente (estrella verde) y biotina (oval amarillo), respectivamente (Figura 1D), para permitir la detección de la formación de la estructura mediante microscopía de fluorescencia. En total, el motivo SST está hecho de 9 oligómeros totales para permitir la formación de nanofibras de 3 hélices a través de la complementariedad programada de cada dominio individual al dominio correspondiente en un oligómero vecino (Figura 1E).

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Protocolo

1. Diseño de la secuencia de la ADNA

  1. Descargue DNA Design Toolbox22 desarrollado por Winfree Lab en Caltech23 en la carpeta que contiene scripts de programación para diseñar secuencias.
  2. Dentro de esa carpeta de diseño de secuencia, abra un lenguaje de programación de cuarta generación compatible con la extensión de archivo ".m" y, a continuación, agregue la carpeta "DNAdesign" descargada anteriormente a la ruta de acceso mediante el siguiente comando:
    >> addpath DNAdesign
  3. Posteriormente, ejecute el siguiente script denominado "PNA3nanofiber.m" (consulte la figura complementaria 1) mediante el siguiente comando:
    >> PNA3nanofiber
  4. Ejecute este script para crear variables denominadas "thisSeqs" y "thisScore." La variable "thisSeqs" contiene las secuencias de los oligómeros diseñados, y "thisScore" es la puntuación de penalización.
  5. Ejecute el script varias veces para obtener la puntuación más mínima. En la Tabla 1se muestra una muestra de 20 de este tipo de corridas.
  6. Confirme manualmente la complementariedad deseada de Watson-Crick de cada dominio de las secuencias generadas para el motivo estructural SST especificado. Las especificaciones de secuencia para la estructura de nanofibra de 3 hélices se muestran en la Tabla 2.
  7. Compruebe lo siguiente para las secuencias generadas.
    1. Evite el uso de cuatro bases C y G consecutivas.
    2. Seleccione manualmente secuencias específicas para la funcionalización N-terminal con colorante fluorescente y moléculas de biotina para permitir estudios de microscopía fluorescente.
    3. Incluya un mínimo de 3 mini-PEG gamma-modificaciones en la columna vertebral para permitir la conformación helicoidal pre-organizada en los oligómeros de una sola cadena como se describe por Sahu et al. 21

2. Preparación de las hebras de acciones de la APNA

  1. Obtenga hebras de componentes de la API de secuencias especificadas a escala de 50 nmol con cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)purificación de un fabricante comercial.
  2. Resuspender cada hebra en agua desionizada a concentraciones de 300 m. Almacene las hebras resuspendidas en un congelador de -20 oC hasta varios meses hasta que sea necesario para la experimentación.

3. Estudios de curvas de fusión de subconjuntos de oligómeros de la APS

  1. Obtener rangos de temperatura de fusión para diferentes combinaciones de subconjuntos complementarios de 2 oligómeros y 3 oligómeros mediante la ejecución de un estudio de curva de fusión en tampones acuosos como la solución salina tamponada de 1x fosfato (PBS) o el disolvente orgánico polar preferido como Dimethylformamida (DMF) o Sulfóxido de dimetil (DMSO) (ver Figura 2).
    NOTA: Las curvas de fusión térmica a >50% de DMF comienzan a perder la línea de base superior y muestran graves perturbaciones en parte debido a la alta absorción de DMF en la longitud de onda requerida para los experimentos. Este es un fenómeno notable en la literatura24. Sin embargo, es posible obtener las curvas de fusión a 5 m por concentración de hebra en estas condiciones de disolvente.
    1. Aliquot 16,7 l de la población de 300 m de cada oligómero y hacer que el volumen final se convierta en un DMF de 1000 oL en 1x PBS o 100% (v/v) DMSO o DMF al 100% (v/v) obteniendo efectivamente una concentración final de 5 oM por oligómero. Transfiera esta mezcla de subconjunto de oligómeros a un camino óptico de 1 cm, cubeta de cuarzo.
    2. Realice experimentos UV-Vis de temperatura variable en un espectrofotómetro equipado con un bloque de temperatura programable.
    3. Recopile puntos de datos para las curvas de fusión en un rango de temperatura de 15o U201290 oC para ciclos de refrigeración (ancocinamiento) y calefacción (fusión) a una velocidad de 0,5 o 20121 oC/min. Conservar las muestras durante 10 minutos a 90oC antes de enfriar y a 15oC antes de calentar. Determinar la temperatura de fusión (Tm) desde el pico de la primera derivada de la curva de calentamiento.
    4. Compruebe que los rangos de temperatura de fusión para subconjuntos de 2 oligómeros están por encima de 35 oC en todos los casos de disolvente. Además, compruebe que los subconjuntos de 3 oligómeros correspondientes que contienen una hebra adicional a su subconjunto equivalente de 2 oligómeros muestra un aumento considerable en Tm debido al aumento de la coopertividad.
      NOTA: Esto verificaría que un solo autoensamble de múltiples oligómeros puede plegarse de forma cooperativa en la nanoestructura deseada con una estabilidad térmica razonable.

4. Protocolo de autoensamble para múltiples oligómeros distintos de la APS

NOTA: Para diseñar un protocolo de rampa térmica de autoensarmble para nanoestructuras de LAPNA, es deseable el recocido de rampa lenta.

  1. En el caso de las secuencias de oligómeros generadas, recose las muestras durante 22,5 h en un ciclo térmico que se enfría de 90 a 20 oC. Típicamente, la temperatura de fusión obtenida para subconjuntos de 2 y 3 oligómeros-PNA se encuentra en rangos de 40o U201270 oC para diferentes condiciones de disolvente.
  2. Programar el ciclor térmico de la siguiente manera: mantener a 90 oC durante 5 min, rampa de 90 a 70 oC a una velocidad constante de 0,1 oC/min, rampa descendente de 70 a 40 oC a una velocidad de 0,1 oC/3 min, rampa descendente de 40 a 20 oC a una velocidad de 0,1 oC/min y mantener a 4 oC (véase la Tabla 3). Las muestras se pueden almacenar en 4 oC durante 12 o 201224 h antes de la caracterización.
    NOTA: Mientras que los subconjuntos de 2 y 3 oligómeros de nuestro sistema de nanofibras pueden formarse en 1x PBS, las nanofibras a escala de micrones se agregan en 1x PBS. Por lo tanto, las condiciones del disolvente deben optimizarse en función de la escala y el tamaño de la estructura que se está formando, así como del tipo y la densidad de las modificaciones gamma.
  3. Para nanofibras de 3 hélices largas a escala de micrones, prepare muestras de lotes recocidos en 75% DMSO: H2O (v/v), 75% DMF: H2O (v/v), 40% 1,4-Dioxane: H2O (v/v) basado en estudios de optimización dedisolventes 15.
  4. Preparar lotes recocidos de la siguiente manera (véase la Tabla 4). En primer lugar, preparar sub-stocks de 10 l a 20 m de concentraciones de las poblaciones principales de 300 m para cada oligómero mediante la alícuota de 0,67 l de la población principal y haciendo el volumen a 10 l utilizando agua desionizada.
  5. Aliquot 1 l de las sub-stocks de 20 m para cada oligómero y agréguelo a un tubo pcR de 200 l. Esto representa un volumen total de 9 ml para 9 oligómeros.
  6. Agregue 30 l de DMSO/DMF anhidro para los casos de DMSO del 75% y 75% de DMF con 1 l adicional de agua desionizada para hacer un volumen final de 40 ml con cada oligómero a 500 nM de concentraciones finales. Añadir 16 l de 1,4-Dioxano y hacer que el volumen con agua desionizada a 40 l para la condición de disolvente de dioxano 40%.
  7. Cargue los lotes recocidos en el ciclor térmico y recocido utilizando el protocolo mencionado en el paso 4.2.

5. Imágenes de microscopía de fluorescencia interna total (TIRF)

  1. Prepare una cámara de humedad a partir de una caja de puntas de pipeta vacía. Llene la caja con aproximadamente 5 ml de agua para evitar el secado de los canales de flujo de muestra descritos a continuación (ver Figura 3).
  2. Prepare la cámara de flujo con un portaobjetos de microscopio, 2 tiras de cinta de doble cara y cubreobjetos recubiertos con nitrocelulosa. Para recubrir el cubreobjetos con nitrocelulosa, sumerja el cubreobjetos en un vaso de precipitados que contenga un 0,1% de colodión en acetato de amilo y secado al aire.
    1. Preparar la solución de nitrocelulosa haciendo una dilución 20 veces de colodión 2% disponible comercialmente en acetato de amilo con disolvente de acetato de isoamilo.
  3. Preparar la solución de albúmina sérica bovina biotinilada (Biotin-BSA) pesando 1 mg de Biotina-BSA y disolviéndola en 1 ml de 1x PBS. Flujo 15 l de 1 mg/ml Biotina-BSA en 1x Tampón PBS colocando el canal de flujo en un ángulo. Incubar el canal de flujo durante 2-4 min a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
  4. Preparar el tampón de lavado disolviendo 1 mg de BSA en 1 ml de 1x PBS. Lave el exceso de Biotina-BSA fluyendo 15 ml del tampón de lavado. Para pasivar la superficie, incubar el canal de flujo durante 2-4 minutos a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
  5. Preparar la solución de estreptavidina midiendo 0,5 mg de estreptavidina y 1 mg de BSA y luego disolver utilizando 1 ml de 1x PBS. Flujo 15 l de 0,5 mg/ml de estreptavidina en 1x PBS que contiene 1 mg/ml de BSA. Incubar el canal de flujo durante 2-4 min a temperatura ambiente en una cámara humidificada. Flujo de 15 l del tampón de lavado para lavar la estreptopavidina sin ataduras.
  6. Flujo de 15 ml de lote previamente recocido de oligómeros de ARPna a 500 nM de concentración por hebra en 75% DMSO, 75% DMF o 40% 1,4-Dioxane condición. Incubar el canal de flujo durante 2-4 minutos a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
  7. Preparar 1 mM trolox en condiciones de disolvente preferidas diluyendo 10 veces de un stock de 10 mM de Trolox en DMSO (medida 2,5 mg de Trolox y disolver en 1 ml de DMSO). Lavar las nanoestructuras no enlazadas en el canal de flujo con 15 ml de Trolox de 1 mM con la misma composición de disolvente que las nanoestructuras.
    NOTA: El contenido de DMSO >50% en el canal de flujo produciría perturbaciones de señal menores debido al diferente índice de refracción de la condición del disolvente durante el TIRF que normalmente se calibra para los ángulos TIRF de agua de cobertura. Esto se puede rectificar lavando con 1 mM Trolox hecho diluyendo el Trolox de 10 mM 10 veces usando agua desionizada. Sin embargo, esta técnica proporciona imágenes más claras, pero solo es útil para evaluar si se produjo la formación, ya que produce microburbujas bifásicas en el canal de flujo. Como resultado, las nanoestructuras pueden ser visibles en la interfaz de las dos fases como se muestra en la figura 4D.
  8. Transfiera el canal de flujo al portaobjetos y a la imagen utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con imágenes TIRF utilizando un objetivo de inmersión de aceite de 60x y una lupa de 1,5x. Escanee el canal de flujo con un aumento de 60x o 90x supervisando el canal Cy3 (consulte la figura 4).

6. Imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM)

  1. Pesar 0,5 g de acetato de uranilo en 50 ml de agua destilada para preparar una solución de tinción de acetato de uranilo acuoso al 1%. Filtrar la solución de tinción de acetato de uranilo acuoso al 1% utilizando un filtro de 0,2 m unido a una jeringa.
    NOTA: Alternativamente, 2% acetato de uranilo acuoso podría ser comprado a un fabricante comercial.
  2. Compre rejillas de cobre recubiertas de capa de soporte formvar disponibles comercialmente con tamaño de 300 mallas.
    NOTA: Es importante tener en cuenta que la capa de soporte formvar podría ser disuelta por disolventes como DMSO más allá de 2 min. Para una incubación de muestras más larga, están disponibles en el mercado formvar estabilizados con monóxido de silicio en rejillas de cobre que permiten que la rejilla sea más hidrófila que las rejillas recubiertas de carbono y puede soportar condiciones de muestra vigorosas y haz de electrones como se muestra en la Figura 5C.
  3. Pipetear 4 l de muestra en la rejilla durante 15 s. Utilice un pedazo de papel de filtro para eliminar la muestra poniendo el papel de filtro en contacto con la rejilla desde un lado.
  4. Añadir inmediatamente 4 l de la solución de tinción a la rejilla durante 5 s.
  5. Quítese la mancha como antes y sostenga el papel del filtro contra la rejilla durante 1-u20122 min para asegurarse de que la rejilla está seca. Por lo general, las muestras deben ser de imagen dentro de 1-u20122 h después de la tinción. Alternativamente, si se garantiza que la rejilla esté completamente seca, las rejillas se pueden almacenar en una caja de almacenamiento de la red TEM hasta 3 días antes de la toma de imágenes.
  6. Transfiera la rejilla a un soporte de muestra TEM y a una imagen utilizando un microscopio electrónico de transmisión operado a 80 kV con aumento que oscila entre 10 K y 150K (ver Figura 5).

7. Diferentes morfologías para híbridos de ADN-ADN basados en el reemplazo selectivo con ADN

  1. Obtener oligómeros de ADN de secuencias especificadas (ver Tabla 5) de fabricantes comerciales de oligonucleótidos sintetizados a escala de 25 nmol utilizando desalado estándar. Resuspender estas secuencias de ADN utilizando agua desionizada libre de RNase a concentraciones de stock de 20 m.
  2. Para los reemplazos contiguos de hebras de ADN, las secuencias D3, D5 y D9 pueden reemplazar las hebras p3, p5 y p9. Del mismo modo, para los reemplazos de hebras de PNA cruzado con ADN, las secuencias D1, D4 y D7 pueden reemplazar las hebras p1, p4 y p7.
  3. Aliquot 1 l de las sub-stocks de 20 m para cada oligómero de ADN o ADP y agréguelo a un tubo de PCR de 200 l como en el paso 2.7. Añadir 30 l de DMSO anhidro y 1 l de agua desionizada libre de RNase para que el volumen final se realice a 40 l (ver Tabla 6).
  4. Cargue los lotes recocidos en el ciclor térmico y recocido utilizando el protocolo mencionado en el paso 4.2.
  5. Caracterice las nanoestructuras híbridas de ADN-ADN mediante el protocolo TIRF siguiendo los pasos de la sección 5 o utilizando el protocolo de imágenes TEM mencionado en la sección 6 (consulte la figura 6).

8. Diferentes morfologías para nanofibras de ADP en diferentes concentraciones de SDS

  1. Preparar un stock principal de SDS del 20% (wt/v) midiendo 20 mg de SDS y disolviéndolo en 100 ml de agua desionizada.
  2. Preparar un sub-stock SDS del 6% (wt/v) alícuotando 3 sL de la población de SDS del 20% y haciendo que el volumen sea de 10 oL con agua desionizada.
  3. Recose los oligómeros de la APS en concentraciones finales de 5,25 mM y 17,5 mM de SDS de la siguiente manera. Aliquot 1 l de las sub-stocks de 20 m para cada oligómero de LANA y agréguelo a un tubo de PCR de 200 l como en el paso 2.7. Añadir 30 l de DMSO anhidro y 1 l de SDS al 6% y 20% para que el volumen final se realice a 40 l para alcanzar concentraciones finales de SDS de 5,25 mM y 17,5 mM, respectivamente (véase el Cuadro 7).
  4. Cargue los lotes recocidos de diferentes concentraciones de SDS en el ciclor térmico y recocido utilizando el protocolo mencionado en el paso 4.2.
  5. Caracterice las nanoestructuras de LA ADNA en presencia de SDS utilizando el protocolo TIRF siguiendo los pasos de la sección 5 o utilizando el protocolo de imágenes TEM mencionado en la sección 6 (véase la figura 7).

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Resultados

Los protocolos discutidos en las secciones anteriores describen el diseño de un motivo SST adaptado a partir de nanofibras de ADN para la generación robusta de estructuras automontadas de nanofibras utilizando múltiples oligómeros de ARPna distintos. Esta sección describe la interpretación de los datos obtenidos de la recreación exitosa de los protocolos descritos.

Siguiendo el protocolo descrito en la sección 5 para la toma de imágenes TIRF de muestras de oligómeros de ARPna recocid...

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Discusión

Este artículo se centra en adaptar y mejorar los protocolos de nanotecnología de ácido nucleico existentes hacia las mezclas de disolventes orgánicos. Los métodos descritos aquí se centran en las modificaciones y la solución de problemas dentro de un espacio experimental definido de disolventes orgánicos aproticos polares seleccionados. Todavía existe un potencial inexplorado para que otros protocolos establecidos de nanotecnología de ácido nucleico se adapten dentro de este espacio. Esto podría mejorar las a...

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses financieros competidores.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por la subvención 1739308 de la National Science Foundation, la subvención NSF CAREER 1944130 y por la subvención FA9550-18-1-0199 de la Oficina de Investigación Científica de la Fuerza Aérea. Las secuencias de la ADP fueron un regalo generoso del Dr. Tumul Srivastava de Trucode Gene Repair, Inc. Nos gustaría dar las gracias al Dr. Erik Winfree y al Dr. Rizal Hariadi por sus útiles conversaciones sobre el código MATLAB de DNA Design Toolbox. También queremos dar las gracias a Joseph Suhan, Mara Sullivan y el Centro de Imágenes Biológicas por su asistencia en la recopilación de datos de TEM.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
γPNA strands/oligomersTrucode Gene Repair Inc.Section 2.1
UV-Vis SpectrophotometerAgilentVarian Cary 300Section 3.1.2
Quartz cuvettesStarna29-Q-10Section 3.1.1
Thermal cyclerBio RadC1000 touchSection 4.1
0.2 mL PCR tubesVWR53509-304Section 4.5
Anhydrous DMFVWREM-DX1727-6Section 4.6
Anhydrous DMSOVWREM-MX1457-6Section 4.6
Anhydrous 1,4-DioxaneFisher ScientificAC615121000Section 4.6
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)VWR75800-994Section 3.1.1
Microscope slidesVWR89085-399Section 5.2
Glass cover slipsVWR48382-126Section 5.2
2% Collodion in Amyl AcetateSigma-Aldrich9817Section 5.2
Isoamyl AcetateVWR200001-180Section 5.2
Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA)Sigma-AldrichA8549Section 5.3
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153Section 5.4
StreptavidinSigma-Aldrich189730Section 5.5
TroloxSigma-Aldrich238813Section 5.7
Total Internal Reflection Fluorescence microscopeNikonNikon Ti2-ESection 5.8
Transmission Electron MicroscopeJoelJEM 1011Section 6.6
TweezersDumont0203-N5AC-POSection 6.3
Uranyl AcetateElectron Microscopy Sciences22400Section 6.1
Formvar, 300 mesh, Copper gridsTed Pella Inc.1701-FSection 6.2
Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper gridsTed Pella Inc.1829Section 6.2
DNA oligomers/strandsIDTSection 7.1
Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)VWR97064-860Section 8.1

Referencias

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