Modulación molecular por shRNAs específicos entregados por lentivirus en neuronas estresadas por retículo endoplásmico

Resumen

En el presente estudio, se derriba la expresión de dos componentes de señalización aguas abajo de la vía PERK, la calcineurina citoprotectora y el CHOP proapoptótico, mediante el uso de shRNAs específicos. De manera opuesta, estos modulan la susceptibilidad de las neuronas corticales primarias a la atrofia de neuritas después de la inducción del estrés del retículo endoplásmico.

Resumen

La acumulación de proteínas desplegadas dentro del retículo endoplásmico (RE), causada por cualquier condición de estrés, desencadena la respuesta de proteína desplegada (UPR) a través de la activación de sensores especializados. UPR intenta primero restaurar la homeostasis; Pero si el daño persiste, la señalización induce apoptosis.

Cada vez hay más pruebas de que el estrés sostenido y no resuelto en el RE contribuye a muchas afecciones patológicas, incluidas las enfermedades neurodegenerativas. Debido a que la UPR controla el destino celular cambiando entre procesos citoprotectores y apoptóticos, es esencial comprender los eventos que definen esta transición, así como los elementos involucrados en su modulación.

Recientemente, demostramos que la acumulación anormal de gangliósidos GM2 causa el agotamiento del contenido de ER Ca²⁺ , que a su vez activa PERK (PKR-like-ER kinase), uno de los sensores UPR. Además, la señalización de PERK participa en la atrofia de neuritas y la apoptosis inducida por la acumulación de GM2. En este sentido, hemos establecido un sistema experimental que nos permite modular molecularmente la expresión de los componentes PERK aguas abajo y así cambiar la vulnerabilidad de las neuronas a sufrir atrofia neurítica.

Realizamos knockdown de la expresión de calcineurina (citoprotector) y CHOP (pro-apoptótico) en cultivos neuronales corticales de rata. Las células se infectaron con shRNA específico entregado por lentivirus y luego se trataron con GM2 en diferentes momentos, fijados e inmunoteñidos con anticuerpos anti-MAP2 (proteína 2 asociada a microtubos). Más tarde, las imágenes celulares se registraron utilizando un microscopio de fluorescencia y el crecimiento total de neuritas se evaluó mediante el uso del software de procesamiento de imágenes de dominio público ImageJ. La inhibición de la expresión de esos componentes de señalización de PERK claramente hizo posible acelerar o retrasar la atrofia neurítica inducida por el estrés del RE.

Este enfoque podría usarse en modelos del sistema celular de estrés del RE para evaluar la vulnerabilidad de las neuronas a la atrofia de las neuritas.

Introducción

El estrés del retículo endoplásmico (RE) se define como cualquier perturbación que comprometa la capacidad de plegamiento de proteínas en el orgánulo. La acumulación de proteínas desplegadas dentro del lumen ER activa una señal de cascada de transducción llamada respuesta de proteína desplegada (UPR). Esta compleja vía de señalización está orquestada por tres sensores de estrés: PERK (proteína quinasa ER similar al ARN de la quinasa [PKR]), IRE1 (enzima 1 que requiere inositol) y ATF6 (factor de transcripción activado 6). Todos juntos intentan restaurar la homeostasis. Pero si el estrés persiste, la UPR finalmente induce la muerte celular por apoptosis¹.

PERK, una proteína transmembrana de ER, sobre el estrés de ER, conduce a la fosforilación del factor de iniciación eucariota-2 alfa (eIF2α), reduciendo la síntesis global de proteínas y, por lo tanto, la carga de proteínas en el ER². Demostramos que la calcineurina A/B (CNA/B), un heterodímero Ca²⁺ fosfatasa, se une directamente al dominio citosólico de PERK, aumentando su autofosforilación y mejorando significativamente la inhibición de la traducción de proteínas y la viabilidad celular ^3,4. Curiosamente, CNA / B es abundante en el cerebro de los mamíferos, distinguiendo dos isoformas de la subunidad A de CN: α y β.

Bajo estrés sostenido en el RE, la vía de señalización PERK es la única rama de UPR que permanece activada, mediando así tanto la respuesta pro-supervivencia como la apoptótica. En la fase crónica, un evento posterior importante es la inducción del factor de transcripción, CHOP (CCAAT/enhancer binding protein homologous protein)⁵. El estrés crónico en el RE también es cada vez más reconocido como un contribuyente común a una amplia gama de trastornos patológicos, incluidas las enfermedades neurodegenerativas⁶. Es importante entender cómo la UPR puede facilitar la señalización citoprotectora en lugar de la muerte celular ⁷. Sin embargo, en la actualidad se sabe poco sobre el mecanismo exacto que controla la transición entre estas dos fases del EPU.

Recientemente, encontramos que, en neuronas cultivadas, el gangliósido GM2 se acumula en las membranas del RE e induce el agotamiento del calcio luminal. Esto a su vez activa la señalización de PERK, que media la atrofia de neuritas y la apoptosis ⁸. En este estudio, la acumulación de GM2 en neuronas cultivadas se utiliza como un modelo de sistema celular de atrofia de neuritas inducida por estrés ER. Específicamente, se manipulan dos expresiones del factor PERK, CN-Aα y CHOP, que cambia la transición entre eventos tempranos / protectores y una fase crónica / apoptótica. Para lograr esto, los genes respectivos son silenciados; por lo tanto, los cultivos primarios de neuronas corticales están infectados con shRNA específico entregado por lentivirus. El análisis de Western blot revela una reducción significativa de los niveles de expresión de CN-Aα y CHOP en comparación con las células de control, que están infectadas con lentivirus que portan un shRNA revuelto. Después de este tratamiento, las neuronas son sometidas a diferentes tiempos de incubación de GM2 exógeno, fijo, e inmunoteñido con^anticuerpo antimicrotubular asociado a proteína 2 (MAP2) 9. Las imágenes se obtienen con un microscopio de epifluorescencia. El crecimiento total de neuritas se evalúa en relación con el número total de células.

Protocolo

Los procedimientos con animales se realizan siguiendo los protocolos aprobados de la Guía del Instituto Nacional de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. La aprobación para realizar el estudio es otorgada por el Comité de Cuidado y Ética Animal (CICUAL) del INIMEC-CONICET-UNC (Resolución números 014/2017 B y 006/2017 A).

1. Cultivos primarios de neuronas corticales de rata

1. Anestesiar ratas preñadas E18 Wistar en una cámara de CO2 con una mezcla de 80% de CO₂/20%_O2 durante 60 s de exposición y luego sacrificar luego dislocando las vértebras cervicales.
2. Realice los siguientes pasos en una campana de flujo laminar. Extraiga el encéfalo de los embriones con un fórceps estilo # 3 y tijeras de resorte pequeñas y afiladas rectas (Tabla de materiales) a la solución de Hanks en placas de cultivo celular.
3. Diseccionar el tejido bajo una lupa 20x, usando dos pinzas de punta fina estilo # 5, separando la corteza frontal de las meninges. Transfiera la corteza frontal a un tubo cónico de 15 ml e incube el tejido con 3-4 ml de tripsina-EDTA (0,25%) durante 15 minutos, a 37 °C para la digestión química.
4. Después de la digestión, dilúyalo con 3-4 ml de medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco más 10% de suero fetal de ternera (FCS). Luego lávelo 3 veces con Ca 2+/Mg²⁺ solución libre de Sal Balanceada Hanks y 0,1% de glucosa por centrifugación (3000 g durante 5 min).
5. Disociar mecánicamente el tejido 10 veces pipeteando hacia arriba y hacia abajo utilizando una punta de 1000 μL, en DMEM más 10% FCS (Tabla de Materiales). Luego centrifugar el homogeneizado a 100 x g durante 1 min, recoger el sobrenadante y completar el volumen restante a 1000 μL.
6. Colocar la suspensión celular en placas de cultivo celular a una densidad de 520 células/^mm2 con 2 ml de DMEM que contenga 10% de FCS, 1% de penicilina/estreptomicina y 1% de un aditivo aminoácido esencial (ver Tabla de materiales). Luego incubar a 37 °C en un ambiente humidificado con 5% de_CO2 durante 2 h.
   1. Eliminación de materia orgánica y recubrimiento de poli-L-lisina de placas de cultivo celular
      1. Retire la materia orgánica colocando el material de vidrio en una cámara de reacción y agregue alcohol etílico al 96% para cubrir el material. Luego agregue ácido nítrico al 68% (w / v) gota a gota hasta que comiencen a aparecer burbujas de color marrón-verdoso. Una vez que esto suceda, cubra parcialmente el recipiente y permita que la reacción continúe hasta que cese la explosión.
         NOTA: Retire la materia orgánica debajo de una cabina de extracción de gas para evitar la exposición a gases nocivos.
      2. Antes del recubrimiento de poli-L-lisina, enjuague los vasos con agua estéril Mili-Q unas diez veces. Luego incubar los vasos y platos de cultivo con 0,1 μg/μL de poli-L-lisina durante 4 h antes de usarlos. Después de la incubación, enjuague los vasos con agua estéril Mili-Q unas diez veces.
7. Para permitir la diferenciación de las células neuronales, cambie el medio por un medio neurobasal sin suero, con el suplemento sin suero (Tabla de materiales). Mantener los cultivos a 37 °C con 5% de_CO2 hasta el tratamiento.

2. Producción de lentivirus

NOTA: Los oligonucleótidos que contienen las secuencias dirigidas a las 3'UTR de la isoforma CN-Aα o CHOP y con las secuencias no dirigidas (scrambles) se enumeran en la Tabla 1.

1. Para el recocido, mezclar dos oligonucleótidos monocatenarios con secuencias complementarias en cantidades molares iguales, utilizando tampón de recocido (10 mM Tris-HCl, pH 7.5-8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
2. Calentar a 95 °C durante 2 min y luego enfriar lentamente transfiriendo muestras del bloque de calor o del baño de agua a una mesa de trabajo a temperatura ambiente. Diluir el producto resultante [ARN de horquilla corta, (shRNA) con extremos cohesivos] hasta una concentración final de 0,5 μM, alícuotas y almacenar a -20 °C.
3. Clone el inserto de shRNA en el vector lentiviral pLKO.3G, con GFP como marcador fluorescente verde. Para ello, digiera 1 μg de vector con enzimas de restricción EcoRI y PacI mezclando lo siguiente en un tubo estéril: 2 μL de tampón enzimático de restricción 10x (100 mM bis-Tris propano-HCl, pH 6.5, 100 mM MgCl₂, 1 mg/ml de albúmina sérica bovina), 1 μL de 1 μg/μL pLKO.3G, 0.5 μL de 10 U/μL ECoRI, 0,5 μL de PacI (10 U/μL) y 16 μL de agua ionizada estéril.
   1. Mezclar suavemente por pipeteo. Incubar la reacción durante 3-4 h a 37 °C.
      NOTA: Las digestiones nocturnas son generalmente innecesarias y pueden resultar en la degradación del ADN.
4. Para la ligadura, mezclar el vector digerido e insertar en una proporción molar de 3:1 e incubarlo con la ligasa T4 y el tampón ligasa (proporcionado por el fabricante) durante la noche a 16 °C.
   NOTA: En este punto, la reacción de ligadura puede almacenarse a 4 °C hasta su uso posterior.
5. Transformar células competentes DH5α (Tabla de materiales) u otra cepa adecuada de E. coli con la reacción de ligadura de la siguiente manera.
   1. Mezclar E. coli competente con el volumen total de reacción de ligadura y enfriarla en hielo durante 15 min, colocarla en un baño de 42 °C durante 2 min y luego enfriarla en hielo de nuevo durante 15 min.
   2. Transfiera el volumen total sometido a choque térmico a un tubo de 15 ml y complete el volumen a 1000 μL con medio líquido Luria-Bertani (LB) que se haya mantenido previamente a 37 °C. Agitar las bacterias durante 90 minutos a 37 °C en un agitador orbital a aproximadamente 330 rpm.
   3. Centrifugarlos a 5.000 x g durante 5 min a 4 °C y desechar 900 μL de sobrenadante. Utilice el sobrenadante restante para resuspender el pellet. Extienda la suspensión de bacterias uniformemente sobre una placa sólida de ampicilina (100 μg/ml) LB.
   4. Incubar a 37 °C durante la noche, luego verificar el crecimiento bacteriano. En este punto, las bacterias pueden almacenarse a 4 °C durante 4-5 días.
   5. Elija una sola colonia para transferir a un tubo de 50 ml con 10 ml de medio líquido LB y ampicilina (100 μg / ml). Agitar las bacterias a 37 °C a aproximadamente 330 rpm.
   6. Centrifugar el cultivo para granular las bacterias a 5.000 x g durante 5 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y conservar el pellet bacteriano. Esto se puede almacenar a -20 °C.
6. Purificar el plásmido con un kit de purificación de ADN a partir de pellets de bacterias siguiendo las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales). Calcular la concentración de ADN midiendo la absorbancia a 260 nm y multiplicando por el factor de dilución, utilizando la siguiente relación: A₂₆₀ de 1,0 = 50 μg/ml de ADN puro de doble cadena (ds).

3. Infección por lentivirus

NOTA: Realice el procedimiento de generación de lentivirus en una campana de flujo laminar de clase II.

1. 24 h antes de la transfección, sembrar 1-5 × 10⁶ células HEK 293 en placas de cultivo de 100 mm de diámetro en 8 mL de medio de crecimiento e incubarlas a 37 °C, 5%_CO2 durante la noche.
2. Mezclar 14 μg de vector pKLO.3G con inserto específico, 10,5 μg de plásmido de empaquetamiento psPAX y 3,5 μg de plásmido de envoltura pMD2.G (Tabla de materiales). Diluir 45 μL de reactivo de transfección plásmido (Tabla de materiales) en 700 μL de medios séricos reducidos (Tabla de materiales) e incubar durante 5 min a temperatura ambiente. Luego combine la mezcla de ADN con el reactivo de transfección de plásmido diluido, mezcle suavemente e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente.
3. Mientras tanto, cambie por DMEM fresco el medio de la placa de cultivo de cultivos celulares HEK 293 (70% confluente en el momento de la transfección). Luego agregue todo el volumen de la solución de ADN gota a gota. Mece el plato suavemente. No es necesario añadir/cambiar el medio después de la transfección.
4. Incubar las células a 37 °C, 5% de CO2 durante 48 h-₇₂ h para permitir que los shRNAs alcancen su transducción óptima verificada por fluorescencia GFP utilizando un microscopio de fluorescencia. Posteriormente, recoger el medio con lentivirus y almacenar a 4 °C.
5. Filtre sobrenadante viral con una membrana de nylon de 0,45 μm. Alícuota el flujo en 1 mL. A continuación, centrifugar a 17.000 x g durante 4 h. Desechar el sobrenadante y conservar el pellet. Deje secar el pellet invisible y, una vez seco, guárdelo a - 80 °C.
   1. Realizar titulación viral mediante citometría de flujo. Sembrar 4 x 10⁵ células HEK 293 en placas de 24 pocillos e incubar a 37 °C durante 24 h. Luego resuspenda las partículas virales en 200 μL de medio de cultivo DMEM (Tabla de materiales) y agregue 0.05, 0.02 y 0.005 μL a cada pocillo.
   2. Incubar la infección viral durante 72 h, retirar el medio y tripsinizar (0,05% tripsina, 1 mL) durante 3 min. Añadir 1 ml de DMEM en solución FCS al 10% y centrifugar a 500 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y lave el pellet dos veces con PBS.
   3. Resuspender el pellet con 100 μL de PBS y fijar las células con 100 μL de paraformaldehído al 2% (PFA) en PBS. Analizar las células con un citómetro de flujo y determinar el porcentaje de células fluorescentes GFP. Recopile estos datos para calcular la titulación viral utilizando la siguiente fórmula:
      Titulación viral
      

4. Cultivos de neuronas primarias estresados con acumulación de gangliósido GM2 e inmunocitoquímica utilizando anticuerpos anti-MAP2

1. Infectar los cultivos primarios de neuronas corticales (15 días in vitro) con oligonucleótidos específicos de shRNA dirigidos a los 3' UTR de CN-Aα o CHOP e incubarlos a 37 °C con 5% de_CO2 durante 1 día.
   NOTA: Los cultivos primarios de neuronas corticales de 7-8 días in vitro también podrían usarse si las células muestran un alto crecimiento de neuritas.
   1. Preparar una solución madre de 500 μM de gangliósido GM2 en etanol y sonicarla durante 1 h.
   2. Añadir la solución madre de GM2 al medio de las placas de cultivo a una concentración final de 2 μM. Dejar incubar a 37 °C con 5% de_CO2 durante 16, 24 y 48 h.
2. Utilice algunos cultivos para preparar homogeneizado celular para el análisis de Western blot (para la especificación de anticuerpos, consulte la Tabla de materiales).
3. Siga los pasos 1.4. y 1.5. y luego fijar las células con 4% de PFA y 120 mM de sacarosa en PBS durante 20 min a 37 °C, y luego lavarlas con PBS. Realice este procedimiento en una membrana antideslizante en una cámara húmeda. Posteriormente, añadir la solución de permeabilización (Triton X-100 al 0,2% en PBS) durante 5 min y lavar con PBS.
   1. Use BSA al 5% diluido en PBS durante 45 min para permitir el bloqueo, luego incubar con el anticuerpo anti-MAP2, diluido 1:800 en solución de bloqueo, a 4 °C durante la noche.
   2. Al final del tiempo de incubación, lavar dos veces con PBS e incubar con anticuerpos secundarios (Tabla de materiales) durante 1 h. Luego lave las celdas con PBS y monte las gafas en portaobjetos utilizando un medio de montaje acuoso (Tabla de materiales).

5. Análisis de atrofia de neuritas

1. Obtenga imágenes con una lente de aire 20x (NA 0.8) utilizando un microscopio invertido de epifluorescencia equipado con una cámara CCD. Analice imágenes con los complementos de ImageJ. Para ello, cargue la imagen en ImageJ y reste el fondo haciendo clic en Proceso | Restar fondo.
2. Haga clic en la imagen | Ajustar | Umbral o escriba las siguientes claves: Ctrl (o Cmd) + Mayús + T. Se abre una ventana para ajustar los valores mínimos, lo que permite distinguir los trazados de ruta y soma. Haga clic en la imagen binaria (neuritas y somas son de color blanco). En esta imagen, use la selección a mano alzada para eliminar somas; El área de soma seleccionada vuelve a ser negra.
3. Seleccione trazas y haga clic en Editar | Selección | Crear selección. Obtenga el ROI haciendo clic en las teclas Ctrl (o Cmd) y T de la selección y guárdelo. Abra la imagen original, luego haga clic en el panel del administrador de ROI y seleccione el ROI correspondiente, previamente obtenido. Luego haga clic en la imagen original.
4. Una vez que el ROI se rastree en la imagen, escriba las teclas Ctrl (o Cmd) y M (Analyze | Medida). Se abre una ventana; Copiar el valor medio (unidades arbitrarias U.A.) para procesar el análisis estadístico.
   NOTA: Para obtener valores como μm, haga clic en Analizar | Establecer escala. Aparece una ventana abierta para establecer valores. Asegúrese de agregar la escala correcta (Analizar | Set Scale) dependiendo de las características del microscopio utilizado.

Resultados

Aquí, abordamos la cuestión de si el silenciamiento de dos componentes PERK aguas abajo afecta la fase de transición de UPR en un modelo de célula de estrés ER. Para lograr esto, silenciamos el gen CN-Aα así como el gen CHOP mediante dos secuencias específicas de shRNA para cada uno (Tabla 1) en cultivo de células neuronales primarias durante 1 día¹⁰. La expresión se analiza mediante Western blot (Figura 1 y

Discusión

Describimos un sistema experimental que permite la modulación molecular de la transición de la supervivencia a las fases APOPTÓTICAS de la UPR en un modelo de célula neuronal.

Para un análisis adecuado de la atrofia de neuritas, es esencial obtener cultivos de neuronas primarias con procesos numerosos, largos y altamente ramificados ^9,11. Esto facilita el examen de la extensión del proceso neuronal, permitiendo detectar las clara...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 anti-Mouse	Thermo Fisher Scientific	#R37120
anti-CHOP	Thermo Fisher	# MA1 - 250
Anti-CN-Aα	Millipore	# 07-067
Anti-GM2	Matreya	#1961
anti-MAP2	Sigma Aldrich	# M2320
anti-β-actin	Thermo Fisher	# PA1 - 183
aprotinin	Santa Cruz Biotechnology	#3595
Axiovert 200 epifluorescence microscope	Zeiss
B27 supplement	Life Technologies	#17504944
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	#11966025
EcoRI	Promega	#R6011
Fetal Calf Serum (FCS)	Life Technologies	#16000044
Fine-tippeds forceps  style #5	Dumont
Forcep style #3	Dumont
HEK 293	ATCC	#CRL-1573
IRDye 680 CW secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632221
IRDye 680 secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632220
IRDye 800 CW secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632210
IRDye 800 CW secondary antibody	LI-COR Biosciences	#92632211
lentiviral envelope plasmid pMD2.G	Addgene	#12259
lentiviral packing plasmid psPAX2	Addgene	#12260
lentiviral vector pLKO.3G	Addgene	#14748
Leupeptin hemisulfate	Santa Cruz Biotechnology	#295358
Lipofectamine LTX & Plus Reagent (plasmid transfection reagent)	Life Technologies	#A12621
MISSION shRNA	Sigma Aldrich
Monosialoganglioside GM2	Matreya	#1502
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
Neurobasal Medium	Life Technologies	#21103049
Nitrocellulose membrane 0.45 µm	BIO-RAD	#1620115
Odyssey infrared imaging system	LI-COR Bioscience
OneShot Top 10	Life Technology	#C404010
Opti-MEM (Reduced serum media)	Life Technologies	#105802
PacI	BioLabs	#R0547S
penicillin-streptomycin	Life Technologies	#15140122
Pepstatin A	Santa Cruz Biotechnology	#45036
phenylmethylsulfonyl fluoride	Santa Cruz Biotechnology	#329-98-6
Poly-L-lysine	sigma aldrich	P#2636
Straight sharp small spring scissors	Fine Science Tools
T4 DNA Ligase	Promega	#M1801
Trypsin-EDTA 0.25 %	Life Technologies	#25200056
Vibra-Cell Ultrasonic Liquid Processor (VCX 130)	Sonics
Wizard plus SV Minipreps DNA purification system	Promega	#A1330