Enfoques de visualización y análisis tridimensionales y de cuatro dimensiones para estudiar la elongación y segmentación axial de vertebrados

Resumen

Aquí, describimos herramientas y métodos computacionales que permiten la visualización y el análisis de datos de imágenes tridimensionales y cuatridimensionales de embriones de ratón en el contexto de la elongación y segmentación axial, obtenidos por tomografía de proyección óptica in toto, y por imágenes en vivo y tinción de inmunofluorescencia de montaje completo mediante microscopía multifotónica.

Resumen

La somitogénesis es un sello distintivo del desarrollo embrionario de vertebrados. Durante años, los investigadores han estado estudiando este proceso en una variedad de organismos utilizando una amplia gama de técnicas que abarcan enfoques ex vivo e in vitro. Sin embargo, la mayoría de los estudios aún se basan en el análisis de datos de imágenes bidimensionales (2D), lo que limita la evaluación adecuada de un proceso de desarrollo como la extensión axial y la somitogénesis que involucra interacciones altamente dinámicas en un espacio 3D complejo. Aquí describimos técnicas que permiten la adquisición de imágenes en vivo con ratones, el procesamiento de conjuntos de datos, la visualización y el análisis en 3D y 4D para estudiar las células (por ejemplo, progenitores neuromesodérmicos) involucradas en estos procesos de desarrollo. También proporcionamos un protocolo paso a paso para la tomografía de proyección óptica y la microscopía de inmunofluorescencia de montaje completo en embriones de ratón (desde la preparación de la muestra hasta la adquisición de imágenes) y mostramos una tubería que desarrollamos para procesar y visualizar datos de imágenes 3D. Ampliamos el uso de algunas de estas técnicas y destacamos las características específicas de diferentes software disponibles (por ejemplo, Fiji / ImageJ, Drishti, Amira e Imaris) que se pueden utilizar para mejorar nuestra comprensión actual de la extensión axial y la formación de somita (por ejemplo, reconstrucciones 3D). En conjunto, las técnicas aquí descritas enfatizan la importancia de la visualización y el análisis de datos 3D en la biología del desarrollo, y podrían ayudar a otros investigadores a abordar mejor los datos de imágenes 3D y 4D en el contexto de la extensión y segmentación axial de vertebrados. Finalmente, el trabajo también emplea herramientas novedosas para facilitar la enseñanza del desarrollo embrionario de vertebrados.

Introducción

La formación del eje del cuerpo de los vertebrados es un proceso altamente complejo y dinámico que ocurre durante el desarrollo embrionario. Al final de la gastrulación [en el ratón, alrededor del día embrionario (E) 8.0], un grupo de células progenitoras de epiblastos conocidas como progenitores neuromesodérmicos (NMP) se convierten en un impulsor clave de la extensión axial en una secuencia de cabeza a cola, generando el tubo neural y los tejidos mesodérmicos paraxiales durante la formación del cuello, el tronco y la cola 1,2,3,4 . Curiosamente, la posición que ocupan estas NMPs en el epiblasto caudal parece jugar un papel clave en la decisión de diferenciarse en mesodermo o neuroectodermo⁵. Aunque actualmente carecemos de una huella molecular precisa para las NMP, generalmente se cree que estas células coexpresan T (Brachyury) y Sox2 ^5,6. Los mecanismos exactos que regulan las decisiones de destino de NMP (es decir, si toman rutas neuronales o mesodérmicas) solo están comenzando a definirse con precisión. La expresión de Tbx6 en la región de la raya primitiva es un marcador temprano de la decisión del destino de NMP, ya que este gen está involucrado en la inducción y especificación del mesodermo ^6,7. Curiosamente, las células del mesodermo temprano parecen expresar altos niveles de Epha1⁸, y la señalización Wnt /β-catenina, así como Msgn1 también se demostró que juegan un papel importante en la diferenciación del mesodermo paraxial y la formación de somita ^9,10. Un análisis espacio-temporal completo de las NMP a nivel de una sola célula será sin duda fundamental para comprender completamente los mecanismos moleculares que controlan la especificación del mesodermo.

La formación de somitas (precursores de vértebras) es una característica clave de los vertebrados. Durante el alargamiento axial, el mesodermo paraxial se segmenta en una serie de unidades de repetición bilaterales conocidas como somitas. El número de somitas y el tiempo requerido para la formación de nuevos segmentos varía entre las especies^11,12. La somitogénesis implica oscilaciones de señalización periódicas (conocidas como el "reloj de segmentación") que pueden observarse mediante la expresión cíclica de varios genes de las vías de señalización Notch, Wnt y Fgf en el mesodermo presómtico (por ejemplo, Lfng)^11,12. El modelo actual de somitogénesis también postula la existencia de un "frente de onda de maduración", una serie de gradientes de señalización complejos que involucran señalización Fgf, Wnt y ácido retinoico que definen la posición del borde posterior de cada nuevo somita. Por lo tanto, una interacción coordinada entre el "reloj de segmentación" y el "frente de onda de maduración" es fundamental para la generación de estos módulos precursores de vértebras, ya que las perturbaciones en estos procesos morfogenéticos clave pueden resultar en letalidad embrionaria o en la formación de malformaciones congénitas (por ejemplo, escoliosis)13,14,15.

A pesar de los avances recientes sustanciales en técnicas de imagen, métodos de análisis de bioimagen y software, la mayoría de los estudios de alargamiento axial y somitogénesis todavía se basan en datos de imágenes bidimensionales individuales / aisladas (por ejemplo, secciones), lo que no permite una visualización completa del tejido multidimensional y complica la clara diferenciación entre malformaciones patológicas (es decir, debido a mutaciones) vs variación morfológica normal que ocurre durante el desarrollo embrionario¹⁶ . La imagen en 3D ya ha descubierto nuevos movimientos morfogenéticos, previamente no identificados por los métodos 2D estándar 17,18,19,20, destacando el poder de las imágenes in toto para comprender los mecanismos de la somitogénesis de vertebrados y la extensión axial.

La microscopía 3D y 4D de embriones de ratón, particularmente las imágenes en vivo, son técnicamente desafiantes y requieren pasos críticos durante la preparación de la muestra, la adquisición de imágenes y el preprocesamiento de datos para permitir un análisis espacio-temporal preciso y significativo. Aquí, describimos un protocolo detallado para imágenes en vivo y tinción de inmunofluorescencia de montaje completo de embriones de ratón, que se puede utilizar para estudiar tanto las NMP como las células mesodérmicas durante la extensión y segmentación axial. Además, también describimos un protocolo para la tomografía de proyección óptica (OPT) de embriones y fetos más viejos, que permite la visualización y cuantificación 3D de anomalías patológicas que pueden resultar de problemas durante la somitogénesis (por ejemplo, fusión ósea y escoliosis)13,21,22. Finalmente, ilustramos el poder de las reconstrucciones por imágenes 3D en el estudio y la enseñanza de la segmentación de vertebrados y el alargamiento axial.

Protocolo

Los experimentos con animales siguieron las legislaciones portuguesa (Portaria 1005/92) y europea (Directiva 2010/63 / UE) sobre vivienda, cría y bienestar. El proyecto fue revisado y aprobado por el Comité de Ética del Instituto Gulbenkian de Ciência y por la Entidad Nacional Portuguesa, "Direcção Geral de Alimentação e Veterinária" (referencia de la licencia: 014308).

1. Preparación de muestras para imágenes 3D y 4D

NOTA: Aquí proporcionamos una descripción detallada sobre cómo diseccionar y preparar embriones de ratón E8.25 a E10.5 para imágenes vivas (1.1), embriones E7.5 a E11.5 para microscopía de inmunofluorescencia de montaje completo (1.2) y fetos para tomografía de proyección óptica (1.3).

1. Preparación de muestras para imágenes en vivo
   1. Disección de embriones de ratón y preparación para imágenes en vivo (por ejemplo, LuVeLu reporter ²³).
      1. Diseccionar embriones de ratón entre E8.25 y E10.5 en medio M2 precalentado (37 °C). Retire suavemente el saco vitelino con fórceps limpios y lave el embrión una vez con medio M2 fresco para eliminar la sangre y los desechos producidos durante la disección.
         NOTA: Es importante evitar dañar el embrión de ninguna manera, de lo contrario no se desarrollará adecuadamente durante el procedimiento de imágenes en vivo.
      2. Durante el procedimiento de imagen en vivo, incubar embriones en una cámara calentada (37 °C), en un ambiente de 65% O₂ y 5% de CO₂ (N₂ equilibrado), en medio DMEM de baja glucosa suplementado con suero fetal bovino definido al 10% de HyClone, 2 mM de L-glutamina y 1% de penicilina-estreptomicina.
         NOTA: Estas condiciones de cultivo permiten que el desarrollo embrionario ocurra alrededor de 10 h. Otros protocolos ^9,10, que utilizan diferentes condiciones de cultivo, podrían permitir períodos aún más largos.
2. Preparación de muestras para microscopía de inmunofluorescencia
   1. Procedimiento de disección y fijación de embriones de ratón
      1. Diseccionar embriones de ratón de E7.5 a E11.5 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría (4 °C) o en medio M2. Después de la extracción de todas las membranas extraembrionarias (por ejemplo, la membrana de Reichart o el saco vitelino) lave el embrión en PBS fresco para eliminar la sangre y los desechos producidos durante el procedimiento de disección.
      2. Fijar embriones a 4 °C, en paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS, durante el tiempo especificado en la Tabla 1.
         PRECAUCIÓN - El PFA debe manipularse dentro de una campana extractora de humos

         Etapa de desarrollo	Tiempo de fijación recomendado (PFA 4%)
         E7.5	1h30
         E8.5	2h
         E9.5	3h
         E10.5	4h
         E11.5	4h

         Tabla 1 - Tiempos de fijación para embriones en diferentes etapas de desarrollo
      3. Después de la fijación, lave los embriones al menos dos veces (5-10 minutos cada uno) en PBS para eliminar el PFA por completo. En este punto, los embriones pueden ser llevados directamente al protocolo de tinción de inmunofluorescencia (Paso 1.2.2) o pueden ser deshidratados y almacenados para su uso futuro (Paso 1.2.1.4).
      4. Si es necesario, almacene los embriones a -20 °C en metanol al 100% durante largos períodos.
         1. Para mejorar la preservación del tejido, deshidrate el embrión gradualmente con aumentos del 10% en la concentración de metanol (diluido en PBS), cada paso 10 min a temperatura ambiente (RT) en un agitador, hasta alcanzar el 100% de metanol. Reemplace el 100% de metanol una vez usando una alícuota fresca.
         2. Recupere embriones congelados por rehidratación siguiendo una serie inversa de metanol/PBS, cada paso 10 min a RT en un agitador, y con lavados finales en PBS (dos veces, 5-10 min cada uno) antes de entrar en el protocolo de inmunotinción.
            PRECAUCIÓN - El metanol debe manipularse dentro de una campana extractora de humos.
   2. Tinción por inmunofluorescencia de montaje completo
      NOTA: El siguiente protocolo de tinción por inmunofluorescencia se adaptó del procedimiento descrito en Osorno et ^al.24. Todos los lavados deben realizarse en un agitador. Después del paso de bloqueo, las incubaciones se realizan a 4 °C para garantizar la integridad/preservación de los anticuerpos.
      1. Lave los embriones tres veces (30 min cada uno) en PBS que contenga 0.1% Triton X-100 (0.1% PBST) y luego una vez en 0.5% PBST durante 1 hora (RT) para mejorar la permeabilización.
      2. Para reducir la unión inespecífica, lavar en 1 M de glicina en PBS (pH 7.5) durante 30 min a RT.
      3. Lavar tres veces en PBST al 0,1% durante 30 min para eliminar completamente la glicina.
      4. Incubar los embriones durante la noche a 4 °C en solución bloqueante que contenga: 3% de suero (de la especie animal en la que se produjeron los anticuerpos secundarios), 1% de albúmina sérica bovina (BSA) y 0,1% de Tritón X-100, en PBS.
      5. Diluir los anticuerpos primarios en solución de bloqueo (normalmente 1:200 para los anticuerpos T y Sox2) e incubar durante dos o tres días a 4 °C.
      6. Antes de agregar los anticuerpos secundarios, lave los embriones tres veces (30 min cada uno) en PBST al 0,1% a 4 °C. Diluir los anticuerpos secundarios en solución bloqueante (1:1000) e incubar durante 2 días a 4 °C, protegidos de la luz.
      7. Lave los embriones seis veces (30 min cada uno) en PBST al 0,1% a 4 °C.
      8. Para la contratinción nuclear, incubar embriones en 4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Diclorhidrato (DAPI), diluido 1:500 en PBST, durante la noche en un agitador a 4 °C, protegido de la luz.
      9. Finalmente, lave los embriones tres veces (30 min cada uno) en PBST al 0,1% a 4 °C.
   3. Limpieza de tejidos y preparación de diapositivas
      1. Limpieza de tejidos con salicilato de metilo o una mezcla de alcohol bencílico con benzoato de bencilo (BABB)
         1. Antes de limpiar usando salicilato de metilo o BABB, deshidrate completamente los embriones llevándolos al 100% de metanol, a través de una serie de metanol / PBS que consiste en aumentos sucesivos del 10% en la concentración de metanol (tiempos de incubación de 10 min cada uno a 4 ° C). Para lograr una deshidratación completa, reemplace el metanol 100% por uno fresco y espere 10 minutos adicionales.
         2. Realizar el aclaramiento embrionario mediante la incrustación en una serie de salicilato de metilo o BABB en metanol con aumentos sucesivos del 20% en la concentración, incubación de 20 minutos para cada paso. Cuando el salicilato de metilo o la solución de BABB alcanza el 100%, realice dos cambios adicionales para una solución fresca.
            PRECAUCIÓN: Tanto el salicilato de metilo como el BABB deben manipularse dentro de una campana extractora de humos.
            NOTA: Para una limpieza adecuada, es esencial que los embriones estén completamente deshidratados. También es esencial que el metanol se mezcle completamente con salicilato de metilo o BABB en la serie de soluciones de limpieza.
         3. Después de que los embriones se vuelvan completamente transparentes, manipularlos individualmente, utilizando preferentemente un estereoscopio de fluorescencia, para reducir las posibilidades de daño tisular.
         4. Para la obtención de imágenes, monte embriones en un portaobjetos de vidrio cóncavo de depresión de 75 mm x 25 mm o en un vidrio de cubierta de 20 mm x 60 mm # 1.5. Esta última opción permitirá obtener imágenes desde ambos lados, si es necesario, pero es mucho más frágil y difícil de sellar. Transfiera los embriones a los portaobjetos del microscopio utilizando un palillo de dientes, una punta de algodón fina, una pipeta Pasteur o cualquier otro instrumento similar.
         5. Para evitar comprimir los embriones, agregue espaciadores hechos de fragmentos de vidrio de cubierta # 1 (170 μm de grosor), silicona o arandelas delgadas de metal. Luego agregue una gota de medio de montaje, cubra con una cubierta # 1 o # 0 de 20x20 mm y sello.
         6. Si usa espaciadores de vidrio o metal, selle con parafina derretida para estabilizar mejor la preparación; no selle con esmalte de uñas porque se disuelve con salicilato de metilo o BABB. Para evitar burbujas, coloque el cubrehojas en un lado y luego, deslícelo gradual y suavemente hacia los lados; agregue más medio si es necesario.
            NOTA: Vea el video para comprender mejor cómo manipular los embriones eliminados y cómo montarlos en la diapositiva del microscopio.
      2. Limpieza de tejidos con RapiClear
         1. Cuando se usa RapiClear, no se requiere deshidratación embrionaria. Después del paso 1.2.2.9, coloque los embriones en el centro de un portaobjetos de vidrio cóncavo de depresión de 75 mm x 25 mm, retire todo el PBST en el portaobjetos de depresión del microscopio y agregue 200 μL de solución de limpieza.
         2. Después de 10 minutos protegidos de la luz, cuando los embriones comiencen a volverse transparentes, reemplace la solución de limpieza, espere 20 minutos adicionales (protegidos de la luz) y luego cubra con un deslizamiento, comenzando desde un lado y moviéndose suavemente hacia el otro.
            NOTA: El tiempo para despejar completamente el embrión puede pasar de unos minutos a la noche dependiendo de la etapa y el tamaño de los embriones. Además, todo el proceso debe realizarse bajo un estereomicroscopio. Para comprender mejor la limpieza y la preparación de la diapositiva del microscopio, consulte el protocolo de video.
3. Preparación de muestras para tomografía de proyección óptica
   NOTA: Los siguientes procedimientos fueron adaptados de protocolos anteriores^19,25,26. Se describirá el protocolo para el análisis de fetos de ratón E18.5.
   1. Procedimiento de disección y fijación del feto de ratón
      1. Diseccionar fetos de ratón E18.5 en PBS frío (4 °C), extraer todas las membranas extraembrionarias y luego lavar los fetos varias veces en PBS fresco para eliminar la sangre y los desechos producidos durante el procedimiento de disección.
      2. Fijar fetos en PFA al 4% fabricados en PBS, a 4 °C durante 5 a 7 días.
      3. Lave los fetos una vez (15 min) en PBS y luego tres veces (30 min cada uno) en agua desmineralizada o PBS. Realice los lavados en una coctelera.
      4. Deshidratar los fetos por incubación (serie de 25 min en RT en un agitador) en soluciones de metanol de concentraciones crecientes (aumentos del 10% diluidos en agua desmineralizada o PBS) hasta 100% metanol.
      5. Cambie la solución de metanol al 100% (use una alícuota fresca) tres veces (20 minutos cada una) para garantizar una deshidratación completa. Los embriones pueden almacenarse a -20 °C o llevarse directamente (un día después) al proceso de blanqueo (paso 1.3.2).
   2. Proceso de blanqueo
      1. Para eliminar la pigmentación natural, incube los fetos (por separado) en un agitador, primero durante un día en 5% H₂0₂ en metanol y luego en 10% H₂0₂ en metanol durante un máximo de 3 días hasta que los embriones pierdan toda la pigmentación natural.
         PRECAUCIÓN: H₂O₂ debe manipularse suavemente dentro de una campana extractora de humos. La solución blanqueadora que contiene H₂O₂ cuando está en contacto con la muestra crea vapores y, por lo tanto, el tubo que contiene los fetos debe permanecer abierto durante todo el procedimiento de blanqueo. Algunos protocolos de blanqueo sugieren la combinación de H₂O₂ con formamida. Si se utiliza esta alternativa, se debe tener especial cuidado, ya que agregar H₂O₂ a la formamida sin diluir puede provocar una explosión.
      2. Rehidratar gradualmente los embriones en una serie inversa de metanol (con una disminución del 10%) en agua desmineralizada, cada uno incubado durante 20 minutos en RT en un agitador, y finalmente lavar tres veces (30 minutos cada uno) en agua desmineralizada. Espere un día, cambie el agua desmineralizada y continúe.
         NOTA: Consulte la Figura suplementaria 1 para obtener un resultado representativo del proceso de blanqueo.
   3. Protocolo de desmineralización
      NOTA: La desmineralización es opcional, pero se recomienda para fetos o cachorros.
      1. Realizar la desmineralización lavando los fetos en EDTA de 0,1 M a 42 °C durante unas horas [ver también Cho et ^al.27] seguido de cinco lavados (20 min cada uno) con agua desmineralizada para eliminar completamente el EDTA. Realice todos los procedimientos en un agitador.
   4. Preparación de la muestra para la limpieza
      1. Incrustar fetos en un bloque de agarosa al 1%. Para preparar estos bloques, llene un tubo o jeringa de plástico de 50 ml (construyendo un espacio cilíndrico cortando el lado de salida de la jeringa y usando el émbolo para bloquear el lado opuesto) con agarosa derretida, coloque al feto en la agarosa en posición vertical y mantenga esta posición en el centro del bloque con la ayuda de fórceps durante la solidificación de la agarosa.
      2. Coloque el molde con el bloque a 4 °C (30 min) para que la agarosa se gelatilice completamente. En caso de posicionamiento incorrecto del feto dentro del bloque o la aparición de burbujas de aire, derrita la agarosa colocando el bloque a 50 ° C durante la noche y repita el procedimiento al día siguiente.
      3. Retire el bloque de agarosa con el feto del molde y colóquelo en un recipiente con agua desmineralizada. Reemplace con agua fresca desmineralizada después de 15 min.
      4. Antes de limpiar con BABB, deshidrate la muestra. Para preservar mejor la integridad del tejido, realice la deshidratación del feto gradualmente con aumentos del 10% en la concentración de metanol (diluido en agua desmineralizada o PBS), cada paso durante más de 45 minutos a RT en un agitador, hasta alcanzar el 100% de metanol.
      5. Cambie el 100% de metanol (use una alícuota fresca), primero cuatro veces en intervalos de una hora y luego nuevamente al día siguiente para garantizar una deshidratación completa.
   5. Proceso de limpieza y montaje de muestras para imágenes OPT
      1. Limpiar los fetos en un agitador a través de una serie (2,5 horas cada uno) de solución de BABB en metanol, con aumentos del 25% en la concentración de BABB, hasta alcanzar el 100% de BABB.
      2. Reemplace la solución de BABB por una fresca todos los días, hasta que el feto sea completamente transparente. Este proceso puede tardar de 3 a 5 días. Mantenga el bloque que contiene al feto, en una coctelera durante todo el procedimiento. Los fetos pueden permanecer en solución 100% BABB durante largos períodos.
         NOTA: Si el feto no está correctamente deshidratado, se volverá ligeramente translúcido (emulsión "blanquecina") después de agregar BABB por primera vez. Si esto sucede, vuelva a entrar en metanol puro y realice dos lavados adicionales en metanol fresco. Nunca refrigere las muestras mientras realiza la deshidratación y el limpieza, ya que los cambios de temperatura pueden provocar condensación de agua.
      3. Conecte el bloque de agarosa despejado al eje motor del escáner OPT, ajuste la óptica para obtener una imagen de todo el feto y proceda a adquirir un conjunto de datos de proyección completo^19,28.

2. Adquisición de microscopio/imagen

1. Para obtener imágenes 3D y 4D correctas, elija el microscopio que mejor se adapte al objetivo experimental. La Tabla 2 proporciona información general para guiar a través de la selección.

Técnicas de microscopía óptica	Principio de imagen	Objetivo experimental y consideraciones
Imágenes de campo amplio	Utiliza fluorescencia, luz reflejada o transmitida.	Ideal para una visión general y rápida del embrión (por ejemplo, para exámenes de detección y para evaluar las etapas de desarrollo y los fenotipos obvios). La profundidad de campo reducida, en comparación con el espesor observable a grandes aumentos, no permite una interpretación o análisis precisos de la morfología 3D.
Confocal (escaneo láser; CLSM)	Utiliza iluminación de escaneo láser y detección de fluorescencia a través de un agujero de alfiler.	Permite la obtención de imágenes de cortes ópticos de muestras marcadas fluorescentemente, idealmente con una señal fuerte. La obtención de imágenes a través de un agujero de alfiler elimina la señal de fuera de la profundidad de campo, lo que permite una discriminación precisa de la información en 3D. La adquisición es órdenes de magnitud más lenta que widefield, pero con un contraste sin igual y una discriminación 3D de la morfología. La alta resolución temporal no se puede lograr porque las imágenes se adquieren 1 píxel a la vez. Bueno para imágenes 3D de embriones de ratón fijos de hasta E9.5. Las imágenes a través de todo el mesodermo o somitas presómitas requieren limpieza de tejidos, debido a la dispersión de la luz en los tejidos más profundos. La fototoxicidad y el blanqueamiento son una consideración. El fotoblanqueo puede, dentro de unos límites, compensarse a posteriori. Sin embargo, los efectos fototóxicos en muestras vivas no pueden, y a menudo no son fáciles de determinar. Esto es más obvio si las muestras muestran baja expresión y se necesitan altas potencias láser.
Fluorescencia de excitación de dos fotones (TPEFM)	Utiliza excitación láser pulsada de infrarrojo cercano (NIR) en lugar de iluminación láser visible.	TPEFM permite el corte óptico a través de muestras más gruesas que CLSM. La resolución es ligeramente menor, pero el contraste en los tejidos más profundos es considerablemente mejor, por lo que es ideal para la obtención de imágenes en vivo de embriones de ratón. Aunque el TPEFM a menudo se considera menos fototóxico que el CLSM convencional, requiere altas potencias láser que también pueden tener efectos nocivos en las células y los tejidos. Ideal para imágenes 3D de embriones de hasta E11.5, aunque las imágenes a través de todo el mesodermo presómico aún requieren limpieza de tejidos.
Confocal (disco giratorio)	Una forma de confocal que, en lugar de un solo láser, utiliza múltiples fuentes puntuales.	El uso de múltiples estructuras puntuales permite una creación más rápida de cortes ópticos (se pueden lograr varios fotogramas por segundo o pilas por minuto) que CLSM. La adquisición es prácticamente tan rápida como widefield, con una discriminación 3D razonable. Sin embargo, solo permite obtener imágenes de los tejidos más superficiales del embrión de ratón. Permite una detección más sensible que el CLSM, por lo que es una alternativa para embriones con baja expresión de proteínas de fluorescencia.
Hoja ligera / plano único (LSFM/SPIM)	En lugar de iluminación de campo ancho o puntual, la muestra se ilumina un plano ortogonal a la vez. En la mayoría de las configuraciones, permite obtener imágenes desde múltiples ángulos.	También requiere muestras marcadas fluorescentemente. La adquisición de rodajas ópticas es extremadamente rápida (múltiples fotogramas por segundo) y ha reducido los efectos de la fototoxicidad o el blanqueo. Sin embargo, si se requiere una vista múltiple, los pasos posteriores de preprocesamiento del conjunto de datos pueden requerir horas/días de cálculo. LSFM/SPIM permite una mejor detección de niveles de expresión más bajos que CLSM. Ideal para imágenes 3D de embriones de ratón in toto durante la gastrulación. Las muestras a menudo deben montarse y mantenerse en suspensión (preparación no convencional).
Tomografía de proyección óptica (OPT)	Las rodajas ópticas no se detectan sino que se calculan a partir de una serie de imágenes de campo amplio de todo el embrión desde diferentes ángulos (las "proyecciones").	Ideal para imágenes 3D de embriones / fetos de ratón en etapa posterior (>5 mm), pero solo fijos y despejados. Tiene la ventaja de producir pilas 3D de cortes ópticos de muestras fluorescentes y no fluorescentes. Los conjuntos de datos son isométricos (segmentos con igual resolución en las tres dimensiones), lo que lo hace ideal para el análisis anatómico. La adquisición de un conjunto de datos de proyección puede requerir solo unos minutos, seguidos de 15-30 minutos de reconstrucción.
Tomografía de coherencia óptica (OCT)	Utiliza iluminación NIR a través de la muestra para obtener cortes ópticos basados en la interferencia con la reflexión de la luz.	La OCT permite obtener imágenes fáciles a través de tejido vivo (unos pocos milímetros de profundidad en la muestra sin contraste fluorescente) con unas pocas docenas de micrómetros de resolución. La adquisición es muy rápida (unas cuantas rebanadas por segundo). Aunque es una posible alternativa para OPT, esta técnica no está comúnmente disponible.
Superresolución (SR), fuerza atómica (AFM) o imágenes de campo cercano (NSOM)	La SR normalmente se basa en la localización de una sola molécula y AFM / NSOM en superficies de escaneo a resoluciones de subdifracción (pocos nanómetros).	Permite la obtención de imágenes a nivel de subdifracción (resolución de <200 nm), a menudo con la intención de detectar moléculas individuales o moléculas en la superficie celular. No es ideal para el análisis morfológico de muestras grandes como embriones de ratón. La adquisición suele ser un proceso lento (segundos a minutos por imagen).

Tabla 2 - Información genérica para orientar la selección de la técnica/microscopio de imagen más adecuada para el objetivo experimental específico del investigador.

3. Preprocesamiento del conjunto de datos de imágenes

NOTA: Aquí destacamos algunos de los pasos clave del preprocesamiento de conjuntos de datos de imágenes, a saber, la reducción de ruido (3.1) y la deconvolución (3.2), y proporcionamos algoritmos que permiten la preparación y el preprocesamiento adecuados de series temporales de conjuntos de datos 3D (3.3) y tinciones de inmunofluorescencia de montaje completo (3.4). Finalmente, indicamos referencias que describen en detalle un protocolo para el preprocesamiento y reconstrucción de conjuntos de datos OPT.

1. Reducción de ruido
   1. Si las imágenes muestran una relación señal-ruido reducida, considere la posibilidad de aplicar un método clásico como un filtro "Mediano" o "Difusión anisotrópica" disponible en Fiji/ImageJ²⁹, o un método más elaborado basado en el aprendizaje automático como "CARE"³⁰ o "Noise2Void"³¹.
      NOTA: Esto es especialmente relevante para los conjuntos de datos de imágenes en vivo, donde el fotoblanqueo y el fotodaño es una preocupación importante, y se necesitan exposiciones más bajas y mayores ganancias del detector.
2. Deconvolución
   1. Si las imágenes se adquirieron con alta resolución (cerca o en el muestreo de Nyquist), considere realizar la restauración de imágenes con deconvolución para mejorar la calidad del conjunto de datos antes del análisis. Tenga en cuenta que algunas herramientas de deconvolución también incluyen un paso de denoising.
      NOTA: Esto se ha abordado ampliamente en Krull et ^al.32 y en la documentación disponible en el sitio web del software de deconvolución de Huygens (https://svi.nl/HomePage).
3. Preparación de una serie temporal de conjuntos de datos 3D para una visualización y análisis adecuados
   NOTA: A menudo, la deriva embrionaria o de etapa puede ocurrir durante las imágenes de lapso de tiempo. Esto debe corregirse antes de realizar el análisis. A veces, la deriva es lo suficientemente grave como para que la adquisición deba interrumpirse y realizarse ajustes. En este caso, lo mejor es mantener las mismas dimensiones X, Y y Z.
   1. Las pilas 4D separadas se pueden concatenar en una sola hiperstacka 4D utilizando la función "concatenar" de Fiji. Sin embargo, esta herramienta no maneja composite/hyperstacks, por lo que es necesario convertir todos los segmentos 4D en pilas simples utilizando la operación Image | Hyperstacks | Hyperstack para apilar. Mantenga algún sistema de numeración para mantener el orden de estos segmentos 4D y tome nota de la información sobre cada uno (canales, cortes, puntos de tiempo). Repita el procedimiento para todos los segmentos y, a continuación, concatenarlos mediante el procedimiento Image | Pilas | Herramientas | Concatenar.
   2. Reconstruir la hiperstack concatenada con la operación Image | Hyperstacks | Apilar a Hyperstack y elegir el orden correcto de las diferentes dimensiones. Inspeccione el Hyperstack para asegurarse de que todas las dimensiones están secuenciadas correctamente.
      NOTA: El número de canales (c) y sectores (z) debe ser el mismo para todos los segmentos 4D; el número de fotogramas (de tiempo) (t) debe ser igual al total de puntos de tiempo añadidos para todos los segmentos 4D. Es importante navegar por la pila para comprender cómo se interpolan las diferentes dimensiones, antes de realizar la conversión a hyperstack. El valor predeterminado de Fiji/ImageJ es alternar canales, luego alternar segmentos Z y luego alternar puntos de tiempo ("XYCZT"). Confirme que esto se aplica a los datos generados por el microscopio.
   3. Elija Compuesto como modo de visualización y guárdelo como Formato de archivo de imagen etiquetada (TIFF). Para conjuntos de datos grandes, considere la posibilidad de convertir al formato BigDataViewer³³ , realizando la operación Plugins | bigDataViewer | Exportar imagen actual como XML/HDF5. Esto genera un conjunto de datos que se puede navegar de manera más eficiente y en 3D utilizando BigDataViewer y puede ser manejado por otras herramientas de Fiji / ImageJ para conjuntos de datos de big data.
   4. Registre la hiperstack concatenada (serie temporal de pilas 3D) para compensar la deriva embrionaria/etapa utilizando^{el plugin} ImageJ "Correct 3D Drift" o el plugin BigStitcher³⁵, dependiendo del grado de corrección de deriva necesario. Los archivos XML/HDF5 se pueden abrir con BigStitcher.
      NOTA: Es necesario realizar el registro de lapsos de tiempo 3D que muestren la deriva embrionaria antes de cualquier intento de realizar seguimiento celular o análisis de movimiento; la corrección de la deriva también es necesaria para interpretar adecuadamente los movimientos morfogenéticos.
4. Preprocesamiento de conjuntos de datos de imágenes de inmunofluorescencia
   1. Atenuación de la señal de profundidad Z
      NOTA: Aunque el método que proponemos para corregir la atenuación de la señal puede ser útil, esto debe usarse con cuidado, ya que a menudo menos señal en profundidad puede reflejar un fenómeno biológico y no óptico. Considere medir la descomposición en un área de tejido donde no se espera que la molécula de interés esté presente o expresada y ajuste la compensación para esa área. Si todavía hay una señal positiva más baja en profundidad, puede revelar un fenómeno biológico real. Considere también que algunas áreas de la muestra pueden producir más dispersión o atenuación láser que otras, y que no se corregirá completamente con este método simple.
      1. Para embriones más gruesos/en etapa tardía, la atenuación del haz, el fotoblanqueo y la aberración esférica causada por el desajuste de los índices de refracción (entre el medio de montaje y el objetivo del microscopio) pueden dar lugar a conjuntos de datos donde la intensidad de fluorescencia se atenúa en gran medida en las rebanadas más profundas de la pila Z. Por lo tanto, compense esta pérdida de señal antes del análisis. Determinar analíticamente la atenuación más precisa es complejo y altamente dependiente de la muestra³⁶, pero una aproximación rápida se puede determinar empíricamente en ImageJ/Fiji utilizando el Proceso | | matemáticas Función de macro y haciendo clic en Vista previa.
      2. Cargue la pila Z en Fiji/ImageJ y, a continuación, realice el procedimiento Image | Pilas | Reslice. Comience en: arriba, mantenga la opción Evitar interpolación marcada y OK. Ahora la "Z" será el eje "Y". A continuación, haga | de imagen Tablas de búsqueda (LUT) | Fuego (o cualquier otra LUT multicolor). Esto ayudará a evaluar visualmente la mejor compensación durante los próximos pasos. Cambie a una rebanada en el medio del embrión, donde los efectos de la atenuación en profundidad son claramente visibles (la intensidad cae desde la parte superior [superficial] hasta la inferior [más profunda]).
      3. Proceda a determinar la corrección de la caída de intensidad vertical ("y") con el procedimiento Proceso | | matemáticas Macro, y agregue el siguiente "Código" exactamente como está escrito aquí:
         v = v * A * exp ( B * y/h )
         En esta expresión, "v" es la variable para la intensidad del píxel (que se ajustará como una función sobre la profundidad), "y" la variable para la profundidad, y "h" para la profundidad completa, y "exp" es una función exponencial; "A" debe reemplazarse con un número entre 0.5 y 1.0 (elija valores más bajos para evitar la sobresaturación de las capas superiores de la pila Z); B reemplazado por un número entre 0.5 y 2.0, dependiendo de cuán severa sea la atenuación de la profundidad Z, idealmente debería ser 1, sin embargo, en algunos casos se necesita menos (o más) para compensar correctamente las capas inferiores; un valor más alto de B resultará en una mayor compensación de atenuación. Haga clic en Vista previa para hacer una primera evaluación. Pruebe diferentes valores de A y B hasta obtener una compensación adecuada de arriba a abajo de la imagen (la LUT "Fire" puede ser útil para esta evaluación). Cuando esté satisfecho, aplique la configuración haciendo clic en Aceptar.
         NOTA: Esto debe realizarse en cada canal individualmente, porque los tintes y láseres desplazados al rojo pueden atenuarse menos, y algunos tintes se blanquean más rápido que otros. Tenga en cuenta que este procedimiento podría no ser lo suficientemente preciso como para permitir una cuantificación confiable de las variaciones de intensidad de fluorescencia en profundidad, aunque ciertamente es más confiable que realizar cuantificaciones directamente en el conjunto de datos 3D original que se ve gravemente afectado por la atenuación de la señal en profundidad. Una forma de identificar y controlar este efecto es comparar imágenes de diferentes embriones desde los lados dorsal o ventral.
      4. Restaure la geometría original de la pila Z compensada haciendo Image | Pilas | Reslice, comience en la parte superior, mantenga marcado Evitar interpolación , y ahora la "Y" debe convertirse en el plano "Z" nuevamente; Reemplace el color realizando "Imagen | Tablas de búsqueda | Grays" (o la otra LUT de elección). Descarte la pila z original no compensada y guarde la versión compensada.
         NOTA: Consulte la Figura suplementaria 2 como resultado representativo del método de atenuación de la señal de profundidad Z.
   2. Corrección de escalado del eje Z
      1. Si la imagen con un objetivo diseñado para un índice de refracción diferente al utilizado para montar los embriones, es necesario realizar una nueva escala del grosor de la rebanada, de lo contrario las mediciones en profundidad serán incorrectas (potencialmente en un 50% si se utiliza un objetivo "seco" en un embrión limpiado de tejido). Esto se explica, se revisa y se discuten los diferentes métodos, en ³⁷ y ³⁸. Determinar analíticamente la escala de distorsión del eje Z real es compleja, pero una aproximación aceptable se puede determinar fácilmente encontrando la relación entre el índice de refracción de la muestra y el índice de refracción del objetivo (por ejemplo, 1.53 / 1.0 para un embrión eliminado de salicilato de metilo fotografiado con un objetivo seco de 20 x, o 1.56 / 1.33 para un embrión despejado con BABB y fotografiado con un objetivo de inmersión en agua).
      2. Con el conjunto de datos Z-stack ya abierto en Fiji/ImageJ (para imágenes multicanal, después de que se ensamblaron como "compuestas" con todos los canales), vaya a Image | Propiedades y cambiar la profundidad del vóxel al grosor de corte obtenido durante la adquisición de la imagen multiplicado por la corrección de escala del eje Z determinada en el paso anterior (4.2.1; Sección "Preprocesamiento del conjunto de datos de imágenes"). Confirme el resultado mediante el | de imagen Pilas | Vistas ortogonales.
   3. Reposicionamiento del embrión a una posición anatómicamente estándar utilizando Fiji/ImageJ
      NOTA: Reposicionamiento del embrión (ver las ventajas destacadas en Figura suplementaria 3) en una posición estandarizada del eje anterior-posterior [A-P] y dorsal-ventral [D-V] utilizando Fiji/ImageJ, requiere la instalación del TransformJ ³⁹ conjunto de complementos del sitio web de actualización "ImageScience" de Fiji.
      NOTA: Esta técnica es preferible a las rondas de rotaciones en los tres planos que introducirían artefactos de aliasing y degradación de la resolución. Sin embargo, debido a que el complemento del visor 3D de Fiji/ImageJ no puede manejar correctamente conjuntos de datos mayores de 200-300 Mb (es posible que el complemento no se represente o muestre un comportamiento impredecible al intentar rotar el ángulo de visión), el conjunto de datos 3D original debe ser muestreado primero.
      1. Comience por reducir el tamaño del conjunto de datos en image | Escale y luego inserte los valores de "escala" X, Y y Z necesarios para reducir el conjunto de datos a menos de 200 Mb (por ejemplo, un muestreo descendente de 0,5 x 0,5 x 0,5 dará como resultado un conjunto de datos 8 veces más pequeño). Asegúrese de que la opción Crear nueva ventana esté marcada.
      2. Luego vaya a Plugins | visor 3D. Dentro de la ventana del visor 3D, haga clic sobre el embrión para seleccionarlo, y debería aparecer un cuadro 3D rojo. Cuando se utiliza este modo (con el cuadro rojo activado), la rotación del conjunto de datos se puede controlar con el ratón, en contraste con el comportamiento predeterminado, que es girar el ángulo de visión. Al reposicionar el embrión con el ratón, nunca haga clic fuera o el conjunto de datos se anulará la selección.
      3. Cuando esté satisfecho con la nueva posición del embrión, seleccione Editar | | de transformación Exportar imagen transformada en el menú de la ventana "Visor 3D". Para inspeccionar los diferentes planos ortogonales vaya a imagen | Pilas | Vistas ortogonales. Si el embrión no está colocado correctamente, cierre la ventana y vuelva a la ventana del visor 3D y vuelva a ajustar. Repita el paso 4.3.2.
      4. Cuando el embrión esté correctamente posicionado, seleccione en el menú de la ventana "Visor 3D" Editar | | de transformación Guarde la transformación y guarde la matriz de transformación en un archivo de texto con la extensión *.mat. Abra este archivo de texto con Fiji/ImageJ, elimine las dos primeras líneas (texto) y vuelva a guardar. Esto crea un archivo de matriz de transformación compatible con el complemento "TransformJ" descrito en ³⁹.
      5. Cambie al conjunto de datos de resolución completa (puede ser un hiperstack compuesto multicanal) y realice la operación Plugins | | TransformJ TransformJ afín. En la nueva ventana, busque el archivo de matriz guardado anteriormente, seleccione la interpolación Cubic B-Spline | vuelva a muestrear isotropicalmente | De acuerdo.
         NOTA: Esta operación requiere mucha memoria y CPU. Dependiendo de la estación de trabajo y el tamaño del conjunto de datos, la operación puede tardar de minutos a horas. El uso de la opción de remuestreo isotropical garantiza que no se pierda resolución durante la operación de transformación, por lo que el conjunto de datos aumentará de tamaño significativamente y ya no será anisotrópico como la pila z confocal original; es de esperar que el número de cortes en el eje Z aumente al mismo número de píxeles X e Y de cada corte, y la pila se hinche a 5-10 veces el tamaño original. Esto es necesario para garantizar que no se pierda información en el curso de la interpolación de vóxeles durante la rotación y la traslación.
      6. Una vez que el embrión se reposiciona correctamente, a menudo es posible recortar la mayor parte del espacio vacío creado alrededor del embrión. Realice una | completa de imágenes de proyección Z Pilas | Proyecto Z... y elija Intensidad máxima; dibuje el ROI mínimo que contiene todo el embrión en X e Y. Cambie a las ventanas de imagen del conjunto de datos original, vaya a Editar | Selección | Restaure la selección y recorte seleccionando Imagen | recorte.
      7. Recorte las rodajas al principio y al final que no intersecten los tejidos embrionarios. Para ello, seleccione imagen | Pilas | Herramientas | Quitadores de sectores y especifique el primer y último sector que desea eliminar, asegurándose de cambiar el "incremento" a 1 (de lo contrario, elimina solo todos los demás sectores).
      8. Después de reposicionar y recortar el nuevo conjunto de datos, asegúrese de guardarlo como un nuevo archivo TIFF. Si este conjunto de datos es demasiado grande (más que la RAM de la GPU), considere la posibilidad de utilizar BigDataViewer para exportar como XML/DHF5, como se explica en el paso 3.3 (de la sección "Preprocesamiento del dataset de imágenes").
5. Preprocesamiento y reconstrucción del conjunto de datos OPT
   1. Utilizar el protocolo para el preprocesamiento y reconstrucción del conjunto de datos OPT descrito en Martins et ^al.19 y Gualda et ^al.28.

4.3D renderizado, visualización y análisis

NOTA: Aquí proporcionamos una lista de posibles aplicaciones de diferentes herramientas de software, que permiten o mejoran la visualización y el análisis de conjuntos de datos de imágenes 3D.

1. Renderizado y visualización 3D usando Drishti
   NOTA: Drishti⁴⁰ es un software gratuito de visualización científica diseñado para explorar y presentar conjuntos de datos 3D y 4D de micro-CT, confocal / multifotón y microscopía de hoja de luz. Aquí utilizamos este software para la representación 3D y la visualización de la tinción de inmunofluorescencia de montaje completo (Paso 2; Sección "Preparación de muestras para imágenes 3D"). Hay múltiples tutoriales en línea para ayudar a los usuarios a comprender cómo operar Drishti; busque en línea "Tutoriales 3D de Ajay Limaye Drishti". Drishti no puede leer directamente pilas de archivos TIFF, por lo que primero deben convertirse al formato nativo "pvl.nc".
   1. Ejecute la herramienta "drishtiimport.exe", ubicada en la carpeta de instalación de Drishti: Archivos | Cargar | Archivos | elija "Archivos de imagen TIFF en escala de grises" y cargue una pila 3D de un solo canal, tal como se guardó en Fiji/ImageJ. En el caso de una pila compuesta multicanal, divida los canales en Fiji/ImageJ y guarde cada uno individualmente. El tipo voxel es "ushort"; "Archivo"..."Guardar como"..."TIF", responder "y" a todas las preguntas. En la ventana de información adicional que solicita el tamaño del vóxel, asegúrese de agregar los tamaños correctos de vóxel "X Y Z".
   2. Carga de archivos *.pvl.nc en Drishti y renderizado: En la ventana principal de Drishti, File | Cargar | Cargue 1 ( - 4 ) volúmenes dependiendo del número de canales disponibles (como archivos separados). Después de cargar, presione F2 para obtener un renderizado de alta calidad. Esta acción requiere una potente tarjeta GPU. Información para manejar los parámetros de renderizado, Editor de funciones de transferencia, búsqueda en los tutoriales en línea. Una vez satisfecho con las propiedades de renderizado, proceda a generar un renderizado animado.
   3. Vaya a Ver y active el editor de fotogramas clave. Manipule el embrión y colóquelo en la posición inicial deseada. Use el botón derecho del mouse para "arrastrar" el embrión al centro si es necesario, o el mouse se desplaza para hacer zoom. Pulsa establecer fotograma clave en el editor de fotogramas clave, luego elige otra posición, ángulo o zoom, arrastra el marcador de línea de tiempo a un punto de tiempo diferente y vuelve a establecer fotograma clave . Ahora hay 2 fotogramas clave donde el embrión se representa en 2 posiciones / ángulos / zoom diferentes, y una serie de fotogramas intermedios. Al presionar el botón Reproducir , Drishti puede interpolar las condiciones faltantes y reproducirlo como una animación. Ir a archivo | Guarde la secuencia de imágenes para guardar la secuencia animada de todos los fotogramas. Esta secuencia de fotogramas se puede abrir más tarde en Fiji/ImageJ y guardar como AVI (File | Importar | Secuencia de imágenes ... Archivo | Guardar como | Compresión JPEG con una velocidad de fotogramas razonable (sugerimos 15 - 30).
      NOTA: Aunque Drishti permite guardar videos *.wmv, es recomendable guardarlos como fotogramas separados y solo luego convertir la serie a formato de video AVI o MOV (esto se puede hacer usando Fiji / ImageJ).
2. Reconstituciones 3D y segmentación manual de tejidos utilizando Amira
   NOTA: Este software comercial permite, de forma manual o automática/semiautomática, la segmentación 3D de tejidos embrionarios en conjuntos de datos 3D. Hay un "Centro de aprendizaje" en línea para este software con múltiples tutoriales disponibles ⁴¹. A continuación se describen los pasos básicos necesarios para segmentar manualmente los tejidos embrionarios a partir de embriones teñidos con inmunofluorescencia (paso 1.2). La segmentación manual es mucho más fácil después de que el embrión se coloca correctamente en un eje A-P/D-V estándar (consulte la sección "Preprocesamiento del conjunto de datos de imágenes", paso 4.3).
   1. Cargue un conjunto de datos TIFF 3D. Asegúrese de especificar las dimensiones correctas del vóxel, cuando se le solicite. Cree y conecte un módulo de visualización (por ejemplo, "Orthoslice" o "Volren") e inspeccione el conjunto de datos en 3D.
   2. Conecta el campo Etiqueta (o Editar campo Nueva etiqueta en las versiones más recientes de Amira). En este software, los resultados de la segmentación manual se almacenan en "materiales", así que cree un material para cada tejido de interés. Utilice la herramienta "lazo" para la segmentación manual. Hay varios tutoriales disponibles que explican cómo realizar esto (busque en línea "Amira Segmentation Editor tutorial").
   3. Cuando termine con la segmentación de todos los tejidos de interés, salga del Editor de segmentación volviendo al modo Proyecto . Habiendo creado una nueva versión del conjunto de datos (el "campo de etiquetas", que ahora se adjunta al módulo de conjunto de datos original) en el que los píxeles pertenecientes a cada material tienen el mismo valor.
   4. Convierta estos "materiales" en objetos 3D generando modelos de superficie 3D a partir del conjunto de datos "Etiquetas". Esto se puede hacer conectando un módulo "Generar superficie", ajustando los parámetros según sea necesario (active las opciones "compactar", "borde", "Ajustar coords" y "Suavizado sin restricciones"). Haga clic en Aplicar y se generará un nuevo módulo *.surf.
   5. Visualización de los objetos de superficie, extracción y exportación individual como archivos *obj. Adjuntar una | de pantalla SurfaceView al módulo *.surf e inspeccione en el visor principal. En el panel "propiedades" del módulo "SurfaceView", en la propiedad "Materiales", seleccione Todo + Todo y haga clic en eliminar, para que se vacíe el búfer del visor. A continuación, en el segundo desplegable de la propiedad Materiales , seleccione sólo un material y haga clic en Agregar al búfer; sólo ese material debe ser visible.
   6. En la propiedad Estilo de dibujo , haga clic en más opciones | crear superficie y se crea un nuevo módulo *.surf y se agrega al proyecto. Cámbiele el nombre al nombre del tejido (presione F2 en el teclado) y Archivo | Exportar datos como... y Guardar como tipo: Frente de onda (*.obj). Repita la operación para cada material.
      NOTA: Estos archivos *.obj, cada uno de los cuales contiene uno de los tejidos segmentados en Amira, pueden ser utilizados por otras herramientas ("3Dviewer" plugin de Fiji/ImageJ y SimLab).
3. Visualización 3D interactiva en formato de documento portátil (PDF) con SimLab Composer
   NOTA: Este software de gráficos por computadora 3D facilita la creación de imágenes renderizadas en superficie, animaciones y simulaciones. Se pueden encontrar tutoriales útiles en la línea ⁴². Aquí describimos cómo este software permite la creación de ilustraciones interactivas 3D PDF, utilizando los archivos de superficie 3D de frente de onda (*.obj) creados con Amira (Paso 2.3; Sección "Renderizado, visualización y análisis 3D").
   1. Ir a archivo | Nuevo y crear una escena vacía. A continuación, File | importar e importar el 1er archivo *.obj guardado de Amira. Mantenga todas las opciones de la ventana Importar archivo sin marcar y haga clic en Aceptar.
   2. Si no aparece nada en la ventana de visualización del Compositor, haga clic en Ctrl+F o en el icono para Ajustar todo. Ahora el objeto segmentado debería aparecer en el centro de la ventana. Repita el proceso para agregar otro objeto segmentado y confirme su posición en relación con el 1er (por ejemplo, 2 somitas adyacentes).
   3. Seleccione uno de los objetos en la ventana de visualización haciendo clic con el botón izquierdo del mouse, cambie su nombre para reflejar el nombre de la estructura anatómica o el tejido, luego cambie a la representación "3DGeom ~ 1" y, utilizando el panel Materiales , cambie el color alterando los valores R, G, B.
   4. Repita para todos los objetos, hasta que la ilustración 3D esté completamente ensamblada. Tenga en cuenta que algunos materiales también se pueden hacer transparentes manipulando el canal "Alfa", junto a los valores RGB, y por lo tanto permiten la observación de objetos internos u ocluidos.
   5. Con este software, la ilustración del embrión ensamblado se puede exportar como un archivo "PDF 3D", que se puede incluir en las publicaciones. Primero cree una "plantilla" con texto y enlaces activos para cambiar "Estados de escena" para poder incluir instrucciones y tres etapas diferentes en la misma ilustración. Esto se puede hacer cambiando de "Construcción de escenas" al modo "Compartir" (botones a la izquierda de la ventana de Composer), luego haciendo clic en Mostrar configuración de PDF y creando una nueva plantilla de página. Para crear una figura interactiva simple para incluir en un manuscrito, no use una plantilla y simplemente exporte PDF.
      NOTA: Utilice el software Adobe Acrobat Reader para interactuar con los archivos PDF 3D (la operatividad de las funciones de la ilustración interactiva en PDF 3D puede variar en función de las versiones de Acrobat Reader disponibles). La mayoría de los otros visores no son compatibles con el formato PDF 3D, incluidos los navegadores web. Tales ilustraciones interactivas en PDF en 3D se pueden incluir en publicaciones; pregunte a los editores sobre esta posibilidad con anticipación.
4. Visualización y análisis 3D con Imaris
   NOTA: Este software permite la visualización, el análisis y la interpretación integrales de imágenes de conjuntos de datos de microscopía 2D-4D, con una interfaz y flujos de trabajo intuitivos. Hay varios tutoriales útiles en línea sobre cómo comenzar con este software, disponibles en el sitio web (https://imaris.oxinst.com/tutorials). Para cargar e interactuar de manera más efectiva con grandes conjuntos de datos en Imaris (normalmente, aquellos más grandes que la memoria de la GPU) es recomendable convertir el conjunto de datos primero a "*.ims", utilizando el programa "ImarisFileConverter.exe" instalado en la carpeta de instalación de Imaris. El ImarisFileConverter puede leer muchos formatos de imágenes de microscopía, incluidos los archivos OME y "h5" guardados por BigDataViewer de Fiji.
   1. Visualización 3D
      1. Este software puede renderizar una visualización 3D del conjunto de datos utilizando el modo "Vista 3D" y el usuario puede realizar varios ajustes en la forma en que se muestra el conjunto de datos [por ejemplo, elegir entre MIP (Proyección de intensidad máxima) o modo de fusión (mejor representación con señales de profundidad y sombras)].
      2. Vistas ortogonales" modo - Con el posicionamiento adecuado del embrión (Paso 4.3; Sección "Preprocesamiento del conjunto de datos de imágenes") se puede usar la pestaña "Sección" y navegar a través de todo el embrión y ver secciones ópticas desde los planos normales (transversal, coronal y sagital). Si los embriones no se reposicionan adecuadamente, interpretar su anatomía con planos ortogonales es extremadamente difícil (ver Figura suplementaria 3). Aunque Imaris tiene una función conocida como "marco de referencia" para solucionar este problema al analizar embriones 3D, es preferible reposicionar los conjuntos de datos a priori.
   2. Análisis 3D
      NOTA: Este software también tiene varias herramientas para analizar la morfología y las intensidades de fluorescencia. Como ejemplo, aquí describimos un flujo de trabajo simple para analizar las variaciones de intensidad de fluorescencia tisular a lo largo del tiempo utilizando la herramienta "Manchas" de Imaris, donde el usuario coloca manualmente regiones esféricas de interés (ROI) en el embrión en 3D, e Imaris puede medir la fluorescencia tisular dentro de estos ROI esféricos.
      1. Cargue un conjunto de datos 3D o 4D en Imaris y agregue un nuevo punto en el modo de vista 3D . Luego, uno puede seleccionar puntos específicos del embrión (también durante varios puntos de tiempo si se utiliza un conjunto de datos 4D) y cuantificar dentro de esos puntos, por ejemplo, la media de intensidad.
         NOTA: Este software también permite trazar la intensidad a lo largo del tiempo. Esto permite al usuario responder fácilmente a preguntas como: "¿cómo cambia la fluorescencia dentro de un somite con el tiempo?".
      2. Agregue el módulo de punto haciendo clic en el botón Agregar nuevo punto o seleccionando la vista 3D | Spots en el menú de Imaris. Elija Omitir reacción automática, editar manualmente. Cambie el modo de puntero Imaris de Navegar a Seleccionar (esto también se puede hacer presionando la tecla ESC en el teclado).
      3. En la ventana Propiedades de Spots , seleccione el canal específico al que se conectará el spot (por ejemplo, "Canal 1") y active en Seguimiento manual las opciones de conexión automática al punto seleccionado y Habilitar retraso antes de avanzar automáticamente .
      4. Mueva el cursor del ratón a la ventana de visualización y el cursor debería cambiar a una esfera de alambre amarilla hueca. Vaya al punto de tiempo 1 y agregue un punto (= esfera) haciendo clic en el tejido de interés. La esfera ("Spot") solo se agrega si se hace clic mientras se mantiene presionada la tecla Mayús . Repita para todos los puntos de tiempo deseados asegurándose de rastrear la misma porción de tejido a lo largo del tiempo.
      5. En la ventana Propiedades de spots , cambie a la pestaña Estadísticas y, dentro de estadísticas , cambie de Estadísticas generales a Estadísticas detalladas . Del primer desplegable elija Valores específicos, y del segundo desplegable elija "Intensidad media Ch=*...", donde Ch* es el canal en el que se realizará la medición. Un botón a la derecha del "Haga clic para abrir el panel de trazado de tiempo" se encontrará en la parte inferior izquierda de la ventana de propiedades de spots. Al hacer clic en este botón, se abre una gráfica con la intensidad media de fluorescencia dentro de los "puntos", trazada a lo largo del tiempo. Estos valores también se pueden exportar a una hoja de cálculo para su posterior análisis.

Resultados

Los resultados representativos mostrados en este trabajo tanto para la imagen viva como para la inmunofluorescencia, se obtuvieron utilizando un sistema de dos fotones, con un objetivo de agua de 20 × 1.0 NA, el láser de excitación sintonizado a 960 nm y fotodetectores GaAsP (como se describe en Dias et al. (2020)⁴³. La tomografía de proyección óptica se realizó utilizando un escáner OPenT personalizado (como se describe en Gualda et al. (2013)²⁸.

Discusión

La elongación axial y la segmentación son dos de los procesos más complejos y dinámicos que ocurren durante el desarrollo embrionario de los vertebrados. El uso de imágenes 3D y 4D con seguimiento unicelular se ha aplicado, desde hace algún tiempo, para estudiar estos procesos tanto en embriones de pez cebra como de pollo, para lo cual la accesibilidad y las condiciones de cultivo facilitan la obtención de imágenes complejas 19,44,45,46,47,48,49

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose low gelling temperature	Sigma	A9414	Used to mounting embryos (e.g. for OPT)
Amira software	Thermofisher	-	Commerial software tool
Anti-Brachyury (Goat polyclonal)	R and D Systems	AF2085 RRID:AB_2200235	For immunofluorescence
Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)	Abcam	ab92494 RRID:AB_10585428	For immunofluorescence
Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)	R and D Systems	AF4744 RRID:AB_2200834	For immunofluorescence
Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)	Sigma	L9393 RRID:AB_477163	For immunofluorescence
Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)	Molecular Probes	A11055 RRID:AB_2534102	For immunofluorescence
Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)	ThermoFisher   Scientific	A10042 RRID:AB_2534017	For immunofluorescence
Benzyl Alcohol (99+%)	(any)	-	Used to clear embryos (component of BABB)
Benzyl Benzoate (99+%)	(any)	-	Used to clear embryos (component of BABB)
Bovine serum albumin	Biowest	P6154	For immunofluorescence
Coverglass 20x20 mm #0	(any)	-	100um thick
Coverglass 20x20 mm #1	(any)	-	170um thick
Coverglass 20x60 mm #1.5	(any)	-	To use as “slides”
DAPI (4’,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)	Life Technologies	D3571	For immunofluorescence
Drishti software	(open source)	-	Free software tool
EDTA	Sigma	ED2SS	For demineralization
Fiji/ImageJ software	(open source)	-	Free software tool
Glycine	NZYtech	MB01401	For immunofluorescence
Huygens software	Scientific Volume Imaging	-	Commerial software tool
HyClone defined fetal bovine serum	GE Healthcare	#HYCLSH30070.03	For live imaging
Hydrogen peroxide solution 30 %	Milipore	1085971000	For clearing
Imaris software	Bitplane / Oxford instruments	-	Commerial software tool
iSpacers	SunJin Lab	(varies)	Use as spacers for preparations
L-glutamine	Gibco	#25030–024	For live imaging medium
Low glucose DMEM	Gibco	11054020	For live imaging medium
M2 medium	Sigma	M7167	To dissect embryos
Methanol	VWR	VWRC20847.307	For dehydration and rehydration steps
Methyl salicylate	Sigma	M6752	Used to clear embryos
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Used in solution to fix embryos
Penicillin-streptomycin	Sigma	#P0781	For live imaging medium
PBS (Phosphate-buffered saline solution)	Biowest	L0615-500	-
RapiClear	SunJin Laboratory	RapiClear 1.52	Used to clear embryos
Secure-Sea hybridization chambers	Sigma	C5474	Use as spacers for preparations
simLab software	SimLab soft	-	Commerial software tool
Slide, depression concave glass - 75x25 mm	(any)	-	To mount thick embryos.
Triton X-100	Sigma	T8787	For immunofluorescence