Andamio compuesto de colágeno-quitosano cargado de doxiciclina para la curación acelerada de heridas diabéticas

Resumen

El andamio DOX-CL preparado satisfizo los requisitos previos de un apósito DW ideal en resistencia mecánica, porosidad, absorción de agua, tasa de degradación, liberación sostenida, propiedades antibacterianas, biocompatibilidad y antiinflamatorias, que se consideran esenciales para la recuperación del tejido dañado en los trabajadores de la muerte.

Resumen

Una complicación importante de la diabetes mellitus son las heridas diabéticas (DW). La fase prolongada de inflamación en diabetes obstruye las etapas posteriores de lesión que lleva a la herida retrasada que cura. Se seleccionó la doxiciclina (DOX), como un fármaco potencial de elección, debido a sus propiedades antibacterianas junto con sus propiedades antiinflamatorias reportadas. El estudio actual tiene como objetivo formular andamios no reticulados (NCL) y reticulados (CL) cargados con DOX y evaluar su capacidad curativa en condiciones diabéticas. El resultado de la caracterización de los andamios revela que el andamio DOX-CL tiene una porosidad ideal, una baja tasa de hinchazón y degradación, y una liberación sostenida de DOX en comparación con el andamio DOX-NCL. Los estudios in vitro revelan que el andamio DOX-CL fue biocompatible y mejoró el crecimiento celular en comparación con los grupos de control y tratados con andamios CL. Los estudios antibacterianos han demostrado que el andamio DOX-CL era más efectivo que el andamio CL contra las bacterias más comunes que se encuentran en DW. Usando el streptozotocin y el modelo dieta-inducido alto en grasas de DW, un índice perceptiblemente (p≤0,05) más rápido de contracción de la herida en el grupo tratado andamio de DOX-CL fue observado comparado a ésos en el andamio del CL tratados y los grupos de control. El uso del andamio DOX-CL puede resultar ser un enfoque prometedor para el tratamiento local para los trabajadores de la mujer.

Introducción

La diabetes mellitus (DM) es una condición en la que el fracaso del cuerpo para administrar insulina o reaccionar a sus resultados en la digestión anormal de azúcares directos provoca un aumento de la glucosa en sangre ¹. El enredo más consecutivo y aplastante de la DM es la herida diabética (DW). Aproximadamente el 25% de los pacientes con DM tienen la oportunidad de acumular una DW en su vida ¹. La cura obstaculizada de DW se acredita a un triopathy del DM: immunopathy, vasculopathy, y neuropatía. Siempre que la DW no se trate, puede dar lugar al desarrollo de gangrena, lo que provoca la extracción del órgano en cuestión ^2.

Muchos tratamientos, como instruir a los pacientes (inspeccionar la herida diariamente, limpiar la herida, evitar actividades que crean presión sobre la herida, monitoreo periódico de glucosa, etc.), controlar su glucosa en sangre, desbridamiento de la herida, descarga de presión, procedimiento médico, oxigenoterapia hiperbárica y terapias avanzadas son en la práctica ^3,4. La mayoría de estos medicamentos no abordan todos los requisitos previos vitales para la atención de la DW a la luz de las condiciones fisiopatológicas multifactoriales y los gastos inesperados relacionados con estos medicamentos ^5. Aunque la patogenesia de DW es multifactorial, la inflamación persistente con la gerencia inadecuada del tejido se indica para ser la razón real de la cura retrasada en DWs ^5,6.

Los niveles aumentados de mediadores inflamatorios y favorable-inflamatorios en DW dan lugar a factores de crecimiento disminuidos responsables de la herida retrasada que cura ^2,6. La formación inadecuada de la matriz extracelular (ECM) en DWs se acredita a los niveles crecientes de metaloproteinasas de la matriz (MMPs) responsables de la degradación rápida de ECM formado. En los MMPs, MMP-9 es reportado como un intermediario importante responsable de la inflamación prolongada y la rápida degradación de la ECM ^7. Se afirma que el tratamiento local con un fármaco antiinflamatorio que disminuye los niveles elevados de MMP-9 restablece la homeostasis cutánea, la disposición marco y provoca una mejor curación de los DWs ^8,9.

La doxiciclina (DOX), un inhibidor de MMP-9, fue elegida para suprimir los niveles elevados de MMP-9, un mediador inflamatorio importante responsable de la inflamación persistente en DWs ^10,11,12. Además, dox poseen antioxidante (producir radicales hidroxi y fenoxi libres capaces de unirse con especies reactivas de oxígeno) ¹³ y anti-apoptótico (inhibir la expresión de caspasa y estabilización mitocondrial) ¹⁴ actividades que son esenciales para el tratamiento de dw. Se eligió la disposición de los marcos que contenían DOX, colágeno (COL) y quitosano (CS). La elección del COL depende de la forma en que ayuda a proporcionar el marco necesario responsable de la resistencia mecánica y la regeneración tisular ¹⁵. Por otra parte, el CS es estructural homólogo al glycosaminoglycan, asociado a varias fases curativas de la herida. También se informa que el CS posee una propiedad antibacteriana significativa ¹⁵. Por lo tanto, el andamio COL/CS de DOX está formulado para suprimir la inflamación prolongada, seguido de apoyar la formación de la matriz para la cura exitosa de heridas en condiciones de DM.

Protocolo

Todos los procedimientos animales realizados fueron aprobados por el comité ético animal institucional de JSS College of Pharmacy, Ooty, India.

1. Preparación de andamios porosos cargados DOX por método de liofilamiento

1. Agregue 1.2 g de COL a 100 mL de agua (por ejemplo, Millipore) y manténgalo a un lado para la hinchazón.
2. Revuelva la dispersión de COL hinchada a 2000 rpm durante la noche para asegurar la disolución completa de COL.
3. Preparar la solución de CS disolviendo aproximadamente 0,8 g de CS en 100 mL de ácido acético al 1%.
4. Revuelva la solución CS durante la noche a 2000 rpm para asegurar una dispersión uniforme.
5. Mezcle DOX (1% p/v), seguido de la solución CS, a la solución COL, y revuelva durante 30 min.
6. Filtre la mezcla física obtenida utilizando un paño de muselina para eliminar el material particulado.
7. Ultracongelar el filtrado obtenido a -85 °C ± 4 °C durante unas 24 h.
8. Liofilizar la mezcla ultracongelada a -85 °C ± 4 °C durante 72 h.
9. Almacenar los andamios obtenidos en un desecador para su posterior análisis ^16,17.

2. Reticulado de andamios

1. Disolver la ETM (0,488 g) en 50 mL de agua.
2. Remoje 50 mg del andamio cargado dox en 20 mL del tampón MES durante 30 min.
3. Mezcle 19,5 mL de tampón MES con 0,1264 g de EDC y 0,014 g de NHS en un casto separado.
4. Sumergir el andamio en la mezcla tampón durante 4 h para lograr la reticulación ^16.
5. Almacene los andamios reticulados (CL) y no reticulados (NCL) cargados dox para su posterior evaluación.

3. Caracterización de andamios

1. Examen morfológico mediante microscopía electrónica de barrido (SEM)
   1. Caracterizar los andamios para análisis morfológicos utilizando SEM (1 cm × 1 cm × 0,5 cm).
   2. Manche la sección transversal y la superficie exterior del andamio con la delicada capa de oro (~ 150 Å).
   3. Captura la imagen fotográfica a un voltaje de excitación de 5 kV y 10 kV.
   4. Coloque las muestras en trozos de aluminio y encierre con el oro a aproximadamente 9 V.
   5. Mida el andamio utilizando SEM con el aumento de la resolución a 10 kV.
2. Determinación de la porosidad
   1. Medir la porosidad de los andamios utilizando el método de desplazamiento de líquido (etanol) ¹⁸.
   2. Calcule la porosidad de los andamios utilizando las fórmulas siguientes.
      
      W_w = Peso húmedo del andamio
      W_d = Peso seco del andamio
      W_v = Volumen del andamio
3. Determinación de la capacidad de absorción de agua
   1. Mida el peso seco del andamio.
   2. Incubar el andamio pesado a 37 °C durante 24 h en tampón de fosfato salino (PBS) pH 7,4.
   3. Retire el exceso de PBS sobre el andamio utilizando papel de filtro.
   4. Mida la capacidad de absorción de agua utilizando las fórmulas siguientes ¹⁷.
      
      W_S = Porcentaje de absorción de agua
      W₁=Peso húmedo del andamio
      W₀= Peso seco del andamio
4. Degradación de andamios
   1. Incubar el andamio (1cm x 1cm) a 37 °C durante 7 días en un PBS de pH 7,4 que contenga lisizimas.
   2. Lave el andamio para eliminar los iones adheridos en la superficie.
   3. Liofil liofil el andamio lavado ¹⁷.
   4. Calcule la tasa de degradación utilizando fórmulas.
      
      Ww = Peso inicial del andamio
      Wd = Peso del andamio después de la liofilamiento
5. Estudios de liberación in vitro
   1. Determine el comportamiento de liberación del DOX desde el andamio utilizando el método de saco de diálisis.
   2. Dispersar el andamio en unos mililitros de líquido de herida simulado (pH 7.4) y transferirlo a una bolsa de diálisis.
   3. Cierre firmemente los extremos de la bolsa de membrana y sumérjase en los 500 mL de solución de líquido de herida simulada.
   4. Revuelva la solución de líquido de la herida que contiene la bolsa de diálisis a 200-250 rpm.
   5. Recoja la solución sobrenadante y reemplácela con una cantidad igual de solución tampón fresca a intervalos de tiempo definidos.
   6. Determine el porcentaje de liberación de DOX de los andamios en la solución sobrenadante utilizando un espectrómetro uv-visible a 240 nm.

4. Estudios antibacterianos in vitro

1. Determinar la concentración inhibitoria mínima (MIC) de los andamios CL y DOX-CL contra S. aureus, S. epidermis, E. coli, P. aeruginosa utilizando el método de dilución de micro-caldo.
2. Prepare los cultivos bacterianos utilizando caldo Mueller-Hinton en una proporción de 1:1000 para obtener 0.5 de turbidez de McFarland.
3. Añadir D-glucosa (800 mg/dL) a los cultivos bacterianos para hiperglucation ^19,20.
4. Picar y solubilizar el CL y DOX-CL en DMSO (control negativo).
5. Diluir en serie la suspensión bacteriana hiperglicada (100 μL) y las muestras de ensayo (100 μL de solución de andamios) en una placa de 96 pozos.
6. Incubar la placa a 37 °C durante 20-24 h.
7. Registre la absorbancia a una longitud de onda de 600 nm ^21.

5. Estudios de biocompatibilidad in vitro

1. Evaluar la biocompatibilidad de los andamios preparados utilizando MTT [(3-(4, 5 dimetil tiazol-2 il)-2, 5-difenil tetrazolio bromuro)] ensayo.
2. Esterilizar los andamios de dimensión estándar y colocarlos en placas de 24 pozos.
3. Añadir las células 3T3-L1 a la placa de 24 pozos e incubar durante 72 h.

6. Estudios in vivo en animales

1. Inducción de dm y herida por escisión
   1. Alimente al animal con una dieta alta en grasas durante dos semanas y administre una dosis única de estreptozotocina (STZ) (50 mg/kg de peso corporal) en solución tampón de citrato por vía intraperitoneal a ratas albinas Wistar (180-200 g) para la inducción de la diabetes tipo 2.
   2. Elija los animales con una glucosa en sangre constante de 250 mg/dL para el estudio.
   3. Aleatorizar los animales seleccionados para la inducción de heridas por escisión.
   4. Anestesiar a las ratas diabéticas usando el éter dietílico (5 mL fueron agregados a la cámara de anestesia previamente saturada) y confirmar usando el método del pellizco del dedo del pie y el color de la membrana mucosa.
   5. Afeitarse la zona dorsal (dorsal torácica, región lumbar) utilizando un recortador aséptico y cuchillas (A40).
   6. Esterilice el área afeitada con un hisopo alcohólico.
   7. Extirpar la piel (2 x 2 cm² y una profundidad de 1 mm) con una cuchilla quirúrgica aséptica A40 en el área afeitada para crear una herida abierta.
   8. Divida los animales en tres grupos (Grupo 1- Control de enfermedades (Control), Grupo 2- Andamio CL (Placebo), Grupo 3- ANDAMIO DOX CL), cada grupo formado por 6 ratas.
   9. Coloque los andamios CL y DOX CL con cinta quirúrgica y cubra el grupo control con gasa estéril durante 21 días.
   10. Trace el área de la herida en una hoja estéril de OHP y mida la reducción porcentual de la herida usando el método de la rejilla en los días 0, 7, 14 y 21 para todos los grupos.
   11. Calcule el porcentaje de reducción de la herida utilizando las siguientes fórmulas.
       

7. Estudios histopatológicos

1. Aísle el área curada de la herida en los días 7, 14, y 21, almacene en la solución del formalin (el 10%).
2. Seccione los tejidos utilizando un microtomo para obtener un espesor de 6 μm.
3. Monte las secciones en un portaobjetos de vidrio y manche con Hematoxilina y eosina ¹⁷.
4. Capture las imágenes con un aumento de 40x utilizando un microscopio digital.

8. Estimación de hidroxiprolina

1. Aísle el área curada de la herida en los días 0, 7, 14, y 21 para la evaluación.
2. Estimar el contenido de hidroxiprolina utilizando el procedimiento descrito por Reddy G et al., 1996 ²².

9. Prueba de Elisa

1. Estime los niveles de MMP-9 utilizando el kit Elisa según las instrucciones del fabricante.
2. Aísle las muestras de tejido del área curada de la herida el día 21 y mince usando un homogeneizador del tejido.
3. Centrífuga el homogeneizado obtenido y recoge el sobrenadante.
4. Diluya el sobrenadante a 100 veces usando el tampón de ensayo.
5. Escanee la placa con un lector de placas múltiples.

10. Análisis estadístico

1. Representar los resultados obtenidos como Media ± DE.
2. Realice el análisis estadístico utilizando Graph pad prism v5.01.
3. Lograr la significación estadística utilizando el análisis unidireccional de varianza (ANOVA) y la prueba post hoc de Dunnet.
4. Considere los valores con p≤0.05 como significativos.

Resultados

Caracterización del andamio NCL y CL cargado dox
En la examinación visual, el ncl y el andamio del CL fueron encontrados para ser crema en color. Además, ambos andamios parecen ser como una esponja, rígidos e inelásticos cuando se examinan físicamente. Las imágenes SEM de los andamios NCL y CL se muestran en la Figura 1. De la figura, estaba claro que había una disminución en el tamaño de los poros después de la reticulación mediante la formación de enlaces i...

Discusión

El objetivo principal de este estudio fue determinar el efecto del andamio COL-CS cargado dox en la curación de DW en ratas. El CL y el NCL fueron preparados y evaluados en términos de morfología, índice de la hinchazón, cinética in vitro del lanzamiento, y biocompatibilidad.

Caracterización del andamio NCL y CL cargado dox
Se encontró que los andamios preparados eran porosos con poros interconectados. Estos poros interconectados aseguran la naturaleza porosa y espo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-ethyl-(3-3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)	Merck Millipore, Mumbai, India	E7750
2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES)	Merck Millipore, Mumbai, India	137074
3-(4, 5 dimethyl thiazole-2 yl) -2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)	Thermo Fisher, Mumbai, India	M6494
Deep freezer verticle	Labline Instruments, Kochi, India
Dialysis sack	Merck Millipore, Mumbai, India	D6191-Avg. flat width 25 mm (1.0 in.), MWCO 12,000 Da
Doxycycline	Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India	D9891
Elisa kit	R&D Systems	RMP900
Escherichia coli (E. coli)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 2567
Ethanol	Merck Millipore, Mumbai, India	100983
Lyophilizer-SZ042	Sub-Zero lab instruments, Chennai, India
Mechanical Stirrer-RQ-122/D	Remi laboratory instruments, Mumbai, India
Medium molecular weight Chitosan	Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India	18824
Microtome-RM2135	Leica, U.K
Mouse embryonic fibroblast cells (3T3-L1)	National Centre for Cell Sciences, Pune, India
Multiple plate reader -Inifinte M200 Pro	Tecan Instruments, Switzerland
N-hydroxy succinimide (NHS)	Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India	130672
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 2036
Scanning Electron Microscopy (SEM)-S-4800	Hitachi, India
Sodium hydroxide (NaOH) pellets	Qualigen fine chemicals, Mumbai, India	Q27815
Staphylococcus aureus (S. aureus)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 5022
Staphylococcus epidermis (S. epidermis)	National Collection of Industrial Microorganisms, Pune, India	NCIM 5270
Streptozotocin (STZ)	Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, India	14653
Type-1 rat Collagen	Sigma chemicals Co. Ltd, Mumbai, India	C7661
Ultraviolet–visible spectroscopy-1700	Shimadzu