Disección eficiente y cultivo de células epiteliales de pigmento retiniano de ratón primario

Resumen

Este protocolo, que fue reportado originalmente por Fernandez-Godino et al. en 2016^1,describe un método para aislar eficientemente y cultivo de células RPE del ratón, que forman una monocapa RPE funcional y polarizada dentro de una semana en las placas Transwell. El procedimiento dura aproximadamente 3 horas.

Resumen

Los trastornos oculares afectan a millones de personas en todo el mundo, pero la limitada disponibilidad de tejidos humanos dificulta su estudio. Los modelos de ratón son potentes herramientas para entender la fisiopatología de las enfermedades oculares debido a sus similitudes con la anatomía humana y la fisiología. Las alteraciones en el epitelio pigmentario retiniano (RPE), incluidos los cambios en la morfología y la función, son características comunes compartidas por muchos trastornos oculares. Sin embargo, el aislamiento exitoso y la cultura de las células RPE del ratón primario es muy difícil. Este artículo es una versión audiovisual actualizada del protocolo publicado previamente por Fernandez-Godino et al. en 2016 para aislar eficientemente y cultura células RPE de ratón primario. Este método es altamente reproducible y resulta en cultivos robustos de monocapas RPE altamente polarizadas y pigmentadas que se pueden mantener durante varias semanas en Transwells. Este modelo abre nuevas vías para el estudio de los mecanismos moleculares y celulares subyacentes a las enfermedades oculares. Además, proporciona una plataforma para probar enfoques terapéuticos que se pueden utilizar para tratar enfermedades oculares importantes con necesidades médicas insatisfechas, incluyendo trastornos hereditarios de la retina y degeneraciones maculares.

Introducción

Este protocolo, que fue reportado originalmente por Fernandez-Godino et al. en 2016^1,describe un método para aislar y cultivo eficientemente ratones células de epitelio pigmentario retiniano (RPE), que forman una monocapa RPE funcional y polarizada dentro de una semana en las placas Transwell. El RPE es una monocapa situada en el ojo entre la retina neural y la membrana del Bruch. Esta sola capa consiste en células epiteliales altamente polarizadas y pigmentadas unidas por uniones estrechas, exhibiendo una forma hexagonal que se asemeja a un panal de abeja^2. A pesar de esta aparente simplicidad histológica, el RPE realiza una amplia variedad de funciones críticas para la retina y el ciclo visual normal^2,3,4. Las principales funciones de la monocapa RPE incluyen absorción de luz, nutrición y renovación de fotorreceptores, eliminación de productos finales metabólicos, control de la homeostasis iónica en el espacio subretinal y mantenimiento de la barrera blood -retinal^2,3. El RPE también tiene un papel importante en la modulación local del sistema inmunológico en el ojo^{5,6,7,8,9,10,11.} La degeneración y/o disfunción de la RPE son características comunes compartidas por muchos trastornos oculares como retinitis pigmentosa, amaurosis congénita de Leber, albinismo, retinopatía diabética y degeneración macular^12,13,14,15. Desafortunadamente, la disponibilidad de tejidos humanos es limitada. Dada su homología genética altamente conservada con humanos, los modelos de ratón representan una herramienta adecuada y útil para estudiar los trastornos oculares^16,17,18,19. Además, el uso de células RPE primarias cultivadas proporciona ventajas como la manipulación genética y las pruebas farmacológicas que pueden acelerar el desarrollo de nuevas terapias para estos trastornos potencialmente mortales de la visión^9,11.

Los métodos existentes disponibles para el aislamiento y la referencia cultural RPE del ratón carecen de reproducibilidad y no recapitulan las características RPE in vivo con suficiente fiabilidad. Las células tienden a perder pigmentación, forma hexagonal y resistencia eléctrica transepithelial (TER) en pocos días en el cultivo^13,20. Dado que establecer estos cultivos celulares RPE primarios a partir de ratones es un proceso desafiante, este protocolo optimizado se ha creado sobre la base de otros protocolos para aislar las células RPE de los ojos de rata y humanos^21,22,23 para diseccionar los ojos del ratón, recoger el RPE y cultivar las células RPE del ratón in vitro.

Protocolo

Se siguieron las directrices de la Declaración arvo para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión.

NOTA: Este método ha demostrado ser exitoso con ratones de diferentes orígenes genéticos, incluyendo C57BL/6J, B10. D2-Hc^o H2^d H2-T18^c/oSnJ, y ratones albino, a varias edades. Preferiblemente utilizar ratones de 8 a 12 semanas de edad para obtener células RPE. Las células RPE de ratones mayores proliferan menos en el cultivo y los ratones más jóvenes tienen cada vez menos células más pequeñas, lo que requiere agrupar los ojos de diferentes animales para tener cultivos viables.

1. Preparación de reactivos e insertos de membrana

1. Prepare los siguientes reactivos.
   1. Preparar HBSS-H− (HBSS sin calcio, sin amortiguador de magnesio + 10 mM HEPES): Añadir 1 ml de 1 M HEPES a 99 ml de búfer HBSS- (sin Ca/Mg). Conservar a 4 °C hasta 1 mes.
   2. Preparar HBSS-H+ (HBSS con calcio, con tampón de magnesio + 10 mM HEPES): Añadir 1 ml de 1 M HEPES a 99 ml de búfer HBSS+ (con Ca/Mg). Conservar a 4 °C hasta 1 mes.
   3. Preparar solución de hialuronidasa (1 mg/ml): Añadir 10 mg de hialuronidasa a 10 ml de HBSS-H- y filtrarla con un filtro de jeringa estéril de 0,4 μm utilizando una jeringa de 10 ml. Preparar fresco antes de su uso y dejarlo a temperatura ambiente (RT; 20-25 °C).
   4. Preparar la solución FBS: Mezcle 20% FBS con HBSS-H+. Agregue 2 ml de FBS a 8 ml de HBSS-H+. Preparar fresco antes de su uso.
   5. Preparar medio RPE: N1 Suplemento medio 1/100 (v/v), glutamina 1/100 (v/v), penicilina-estreptomicina 1/100 (v/v) y solución de aminoácidos no esenciales 1/100 (v/v), hidrocortisona (20 μg/L), taurina (250 mg/L) y triiodo-thyronina (0,013 μg/L) en alfa MEM + 5% FBS o sin FBS^1,23,24. Si lo desea, FBS puede estar desactivado por calor; no se han observado diferencias. Prepárese fresco para el aislamiento RPE. Para el mantenimiento de cultivo celular, almacenar a 4 °C hasta 1 mes.
   6. Preparar trypsin-EDTA: Preparar pequeños aliquesas de un solo uso (~8 ml) de trypsin-EDTA fresca (0,25 %) y congelarlos a -20 oC. Descongelarlos en RT antes de cada uso. Evite los ciclos de congelación y descongelación.
2. Preparar las plaquitas de membrana (por ejemplo, insertos de transposo).
   1. Equilibrar las plaquitas de membrana de 6,5 mm con medio RPE durante al menos 30 minutos a 37 °C, en una incubadora aireada de CO₂al 5%. Utilice una plaquita de membrana para sembrar células RPE de dos ojos del ratón.
   2. Después de la incubación, reemplace el medio del compartimento inferior por 700 μL de PBS.
   3. Retire el medio del compartimento superior y cubra la plaquita de membrana con 100 μL de 10 μg/ml de laminin del ratón (en PBS) durante al menos 2 h en RT (las incubaciones más cortas pueden conducir a un apego deficiente de las células a la plaquita).
   4. Cubra una plaquita de membrana adicional para usarla como espacio en blanco para las mediciones TER.

2. Disección y enucleación de los ojos del ratón

1. Eutanasia a los ratones por asfixia de CO₂ colocándolos en una cámara de CO₂ y liberando lentamente CO₂ a una tasa de llenado del 30-70% del volumen de la cámara por minuto.
2. Coloque las puntas en ángulo y serradas de micro-fórceps a cada lado del ojo del ratón y presione suavemente para proponer el globo ocular (enucleación).
3. Cierre las fórceps colocadas alrededor del globo ocular. Luego, tire suavemente mientras avanza hacia adelante y hacia atrás para separar todo el ojo con el nervio óptico de los músculos oculares, asegurándose de que no quede tejido conectivo unido a la esclerótica.
4. Enjuague el globo ocular en un 70% de etanol antes de colocarlos en un pozo de una placa de seis pozos con 3 ml de HBSS-H- sobre hielo.
5. Repita los pasos del 2.2 al 2.4 para extraer el segundo ojo del ratón. Continúe con los siguientes pasos en un plazo de 30 minutos.
   NOTA: Se recomienda enuclear/diseccionar solo dos ojos a la vez hasta que se adquiere alguna experiencia.

3. Colección de la RPE

NOTA: Realice los siguientes pasos en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. Para evitar incubaciones prolongadas en el hielo, que pueden resultar en la muerte celular RPE, no recoja más de dos ojos a la vez.

1. Utilice un estereomicroscopio diseccionador, fórceps #5 Dumont y tijeras en ángulo para limpiar cuidadosamente todo el tejido conectivo, la sangre y los músculos que permanecen unidos al globo ocular sin hacer ningún corte en la esclerótica. Cambie los 3 ml de búfer HBSS-H- regularmente, según sea necesario, para mantener el ojo fresco y limpio, y evitar la contaminación de los cultivos RPE.
2. Utilice el nervio óptico como mango para sostener el globo ocular y hacer un agujero en el centro de la córnea con una hoja de #11 de acero al carbono afilado.
3. Utilice tijeras Dumont #5 para hacer tres incisiones en la córnea a través del agujero antes mencionado, asegurándose de que haya suficiente espacio para quitar la lente.
4. Sujete el nervio óptico y aplique una ligera presión a la ora serrata con la base de las tijeras en ángulo hasta que la lente salga por completo. Deje el epitelio del iris en su lugar para evitar el desprendimiento de la retina neural y la RPE durante la incubación. Coloque el ojo en el búfer HBSS-H.
5. Repita los pasos 3.1-3.4 para diseccionar el segundo ojo.
6. Incubar los ojos sin lentes en solución hialuronidasa en una placa de 12 pozos a 37 °C durante 45 min en una incubadora aireada de CO₂al 5% (1,5 ml/pozo) para separar la retina neuronal de la RPE.
7. Coloque cada ojo en un nuevo pozo e incubarlo en hielo durante 30 minutos con 1,5 ml de amortiguador frío HBSS-H+ por pozo para detener la actividad hialuronidase. No extienda la incubación durante más de 45 minutos.
8. Lave y coloque cada ojo en un plato de cultivo de 35 mm con tampón HBSS-H+ fresco y corte la córnea a través de las incisiones originales hasta llegar a la serrata de ora usando tijeras Vannas de 8 cm. A continuación, corte debajo de la ora serrata para eliminar el epitelio del iris y la córnea.
9. Sujete el borde del ocular/ora serrata con pinzas curvas y, usando microforceps en ángulo, tire de la retina neuronal asegurándose de que la capa RPE no esté cortada. A continuación, corte el accesorio interno al nervio óptico. Si algunas células RPE permanecen unidas a la retina neuronal, extienda el tiempo de incubación pero no exceda el total de 45 minutos.
10. Corte el nervio óptico y transfiera cada ocular a una placa diferente de 12 pozos que contenga 1,5 ml de trypsin-EDTA fresca por pozo. Asegúrese de que los oculares permanezcan abiertos y completamente sumergidos en la triptina. Incubar los oculares a 37 °C durante 45 min en una incubadora de CO₂ al 5%.
11. Recoger cada ocular junto con cualquier hoja RPE desprendida durante la incubación de trypsin y transferirlos a una placa de 12 pozos que contiene 1,5 ml de solución FBS por pozo. Si las hojas RPE permanecen en la solución trypsin, utilice un micropipette para transferirlas al pozo con solución FBS.

4. Aislamiento de las células RPE del ratón primario

1. Sostenga cada ocular por el nervio óptico y agite boca abajo en la placa de 12 pozos que contiene 1,5 ml de 20% FBS en HBSS-H+ hasta que se logre el desprendimiento completo de las hojas RPE.
2. Recoge cualquier hoja RPE y racimos RPE con un micropipette y colócalos en un tubo de 15 ml. Evite cualquier trozo blanco de esclerótica o coroidea, que pueda contaminar las culturas. Piscina dos ojos del mismo ratón en un tubo.
3. Centrífuga la mezcla a 340 x g durante 2 minutos en RT y deseche el sobrenadante.
4. Resuspend suavemente el pellet RPE en 1 ml de trypsin-EDTA (0,25%) e incubar la mezcla durante 1 min en un baño de agua a 37 °C para desagregar las hojas RPE en células individuales. Después de la incubación, canaliza suavemente hacia arriba y hacia abajo 10x con un micropipette, evitando la formación de burbujas durante la pipeteo.
5. Añadir 9 ml de medio RPE recién preparado para diluir e inactivar la trypsin y centrifugar la mezcla a 340 x g durante 2 minutos en RT.
6. Aspirar el sobrenadante y resuspend cuidadosamente el pellet celular en 150 μL de medio RPE con 5% FBS mediante el uso de un micropipette, asegurando que las células se resuspenden homogéneamente y evitando la formación de burbujas durante la pipeteo.
7. Tome la plaquita de membrana recubierta de laminin del paso 1.2, retire PBS de la cámara inferior y agregue 700 μL de medio RPE.
8. Retire la laminin de la cámara superior de la plaquita de membrana y distribuya la suspensión de la célula RPE de forma paralela y uniforme al centro de la cámara, evitando la formación de burbujas durante la pipeteo.
9. Coloque la plaquita de membrana en una incubadora de CO_{2 al} 5% a 37 °C y deje sin perturbar durante al menos 24 h.
10. Después de 24 h, compruebe la plaquita de membrana debajo del microscopio para asegurarse de que la mayoría de las células RPE están unidas a la plaquita y la confluencia es de al menos 50% (Figura 1A). Es fundamental no cambiar de medio durante las primeras 72 h.

5. Cultura de monocapas RPE polarizadas

1. Mantenga las células RPE aisladas en el cultivo durante al menos 72 h antes de actualizar el medio RPE para permitir el apego celular. Una confluencia celular del 50% o más en la siembra es fundamental para la formación de una monocapa RPE polarizada adecuada.
2. Cambie el medio de cultivo dos veces por semana utilizando el medio RPE fresco y precalientado (paso 1.1.5) después de que se unen las células. El suero se puede eliminar del medio de cultivo después de las primeras 72 h.
   NOTA: Después de una semana en cultivo, las células deben ser confluentes, hexagonales, bincleadas, pigmentadas y polarizadas(Figura 1B),con números de células esperados que rondan las 50.000 células por inserción de transposular de 6,5 mm. Después de dos semanas en el cultivo, RPE monocapas que comprenden de células sanas se observan. Las referencias culturales RPE muestran microvilli apicales, infoldings basales y uniones estrechas(Figura 1C).

6. Medición ter

NOTA: Realice mediciones TER de las células RPE después de un mínimo de 4 días en cultivo para garantizar una buena integridad y polarización de la monocapa RPE.

1. Limpie los electrodos del voltohmómetro con un 70% de etanol y séquelos cuidadosamente.
2. Tome los transposos de la incubadora y realice la medición ter en un plazo de 3 minutos para evitar alteraciones debido a las fluctuaciones de temperatura. Para medir ter, sumerja el electrodo corto del voltohmómetro en la cámara superior y el electrodo largo en la cámara inferior de la plaquita de membrana. Evite el contacto con la monocapa RPE para evitar el desprendimiento celular.
3. Para calcular ter, deducir el valor del espacio en blanco (inserción de membrana recubierta con laminin sin células) de la muestra. A continuación, multiplique el valor obtenido (en ohmios) por la superficie de la plaquita de membrana (0,33 cm² en el caso de la plaquita de membrana de 6,5 mm). El producto debe ser de al menos 200 Ω x cm² después de 72 h en cultivo. Los valores TER deben medir por encima de 400 Ω x cm² después de dos semanas. Deseche las referencias culturales RPE con valores TER bajos.

Resultados

Este protocolo se ha utilizado para aislar y cultivo células RPE de ratones genéticamente modificados¹. No se han observado diferencias entre las cepas del ratón o el género. Los resultados han ayudado a entender algunos aspectos importantes del mecanismo subyacente a las enfermedades oculares, como la degeneración macular relacionada con la edad, que es la causa más común de pérdida de visión entre los ancianos^{de 9 años.} Las células RPE aisladas siguiendo este p...

Discusión

Mientras que varios métodos para el aislamiento y cultivo celular RPE del ratón se habían desarrollado antes^{de 1,13,20,22,26,27}, el método de Fernández-Godino utilizó por primera vez insertos de membrana que permiten el crecimiento eficiente de las células RPE en el cultivo durante las semanas^1,...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 ml BD Luer-Lok tip syringe, disposable	BD Biosciences	309604
15 ml centrifuge tube	VWR International	21008-103
50 ml centrifuge tube	VWR International	21008-951
Alpha Minimum Essential Medium	Sigma-Aldrich	M4526-500ML
Angled micro forceps	WPI	501727
Bench-top centrifuge	any
CO2 incubator	Thermo	HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
Dissecting microscope	Any
Dulbecco’s Phospate Buffered Saline no Calcium, no Magnesium	Gibco	14190144
Dumont #5 45° Medical Biology tweezers, 0.05 x 0.01 mm tip, 11 cm length	WPI	14101
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Falcon Easy-Grip Clear Polystyrene Cell Culture Dish, 35mm	BD Biosciences	353001
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03	Heat inactivated.
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red	Life Technologies	14175095
Hank’s Balanced Salt Solution plus Calcium and Magnesium, no Phenol Red B6	Life Technologies	14025092
HEPES 1M	Gibco	15630106
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H-3506 1G
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H-0396
Laminar flow hood	Thermo	CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA
Laminin 1mg/ml	Sigma-Aldrich	L2020-1 MG	Dilute in PBS at 37C to 1mg/ml
McPherson-Vannas Micro Scissors 8 cm long	WPI	503216
Non-essential amino acids 100X	Gibco	11140050
N1 Supplement 100X	Sigma-Aldrich	N6530-5ML
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-148
Sterile Bard-Parker Carbon steel surgical blade size 11	Fisher-Scientific	08-914B
Taurine	Sigma-Aldrich	T-0625
Tissue culture treated 12-well plates	Fisher-Scientific	08-772-29
Tissue culture treated 6-well plates	Fisher-Scientific	14-832-11
Transwell supports 6.5 mm	Sigma-Aldrich	CLS3470-48EA
Triiodo-thyronin	Sigma-Aldrich	T-5516
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Gibco	25200056
Tweezer, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, curved, stainless steel 0.02 x 0.06 mm Mod tips	WPI	500232
Vannas Scissors 8cm long, stainless steel	WPI	501790
Whatman Puradisc 25mm Syringe Filters 0.45μm pore size	Fisher-Scientific	6780-2504