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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Describimos el método para el análisis cuantitativo de la distribución de Aspergillus fumigatus conidia (3 μm de tamaño) en las vías respiratorias de ratones. El método también se puede utilizar para el análisis de micropartículas y la distribución de aglomerado de nanopartículas en las vías respiratorias en varios modelos de condiciones patológicas.

Resumen

Aspergillus fumigatus conidia son patógenos en el aire que pueden penetrar en las vías respiratorias humanas. Las personas inmunocompetentes sin alergias exhiben resistencia y tolerancia inmunológica, mientras que en pacientes inmunocomprometidos, los conidios pueden colonizar las vías respiratorias y causar trastornos respiratorios invasivos graves. Varias células en diferentes compartimentos de las vías respiratorias están involucradas en la respuesta inmune que previene la invasión de hongos; sin embargo, los aspectos espacio-temporales de la eliminación de patógenos aún no se comprenden completamente. Las imágenes tridimensionales (3D) de órganos de montaje entero limpiados ópticamente, particularmente los pulmones de ratones experimentales, permiten la detección de patógenos etiquetados fluorescentemente en las vías respiratorias en diferentes puntos de tiempo después de la infección. En el presente estudio, describimos una configuración experimental para realizar un análisis cuantitativo de la distribución de A. fumigatus conidia en las vías respiratorias. Utilizando microscopía fluorescente de barrido láser confocal (CLSM), rastreamos la ubicación de los conidios marcados fluorescentemente en las ramas bronquiales y el compartimiento alveolar 6 horas después de la aplicación orofaríngea a ratones. El enfoque descrito aquí se utilizó previamente para la detección de la ubicación precisa del patógeno y la identificación de las células que interactúan con el patógeno en diferentes fases de la respuesta inmune. La configuración experimental se puede utilizar para estimar la cinética de la eliminación del patógeno en diferentes condiciones patológicas.

Introducción

Diariamente, las personas inhalan patógenos en el aire, incluidas las esporas de hongos oportunistas Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) que pueden penetrar en el tracto respiratorio1. El tracto respiratorio de los mamíferos es un sistema de vías respiratorias de diferentes generaciones que se caracterizan por las diferentes estructuras de las paredes de las vías respiratorias2,3,4. Las paredes traqueobronquiales consisten en varios tipos de células entre las que se encuentran las células ciliadas que proporcionan el aclaramiento mucociliar5. En los alvéolos, no hay células ciliadas y los patógenos espaciales alveolares penetrantes no pueden ser eliminados por el aclaramiento mucociliar6. Además, cada generación de vías respiratorias es un nicho para múltiples poblaciones de células inmunes y subconjuntos de estas poblaciones son únicos para ciertos compartimentos de las vías respiratorias. Así, los macrófagos alveolares residen en los compartimentos alveolares, mientras que tanto la tráquea como las vías respiratorias conductoras están revestidas con las células dendríticas intraepiteliales7,8.

El tamaño aproximado de A. fumigatus conidia es de 2-3.5 μm9. Dado que el diámetro de las vías respiratorias pequeñas en humanos e incluso en ratones supera los 3,5 μm, se sugirió que los conidios pueden penetrar en el espacio alveolar2,10,11. De hecho, el examen histológico mostró el crecimiento fúngico en los alvéolos de los pacientes que sufrían de aspergilosis12. También se detectaron conidios en los alvéolos de ratones infectados utilizando imágenes vivas de las gruesas rodajas pulmonares13. Simultáneamente, se detectaron conidios en el lado luminal del epitelio bronquial de ratones14.

La obtención de imágenes tridimensionales (3D) de los pulmones de ratón de montaje entero ópticamente despejados permite el análisis morfométrico de las vías respiratorias15. En particular, el análisis cuantitativo de la distribución del nervio pleural visceral se realizó utilizando muestras de pulmón de ratón ópticamente despejadas15. Recientemente, Amich et al.16 investigaron el crecimiento de hongos después de la aplicación intranasal de conidios a los ratones inmunocomprometidos utilizando una microscopía de fluorescencia de lámina de luz de muestras de pulmón de ratón ópticamente despejadas. La ubicación precisa de los conidios en reposo en las vías respiratorias en diferentes puntos de tiempo después de la infección es importante para identificar las poblaciones celulares que pueden proporcionar suficiente defensa antifúngica en ciertas fases de la inflamación. Sin embargo, debido al tamaño relativamente pequeño, los aspectos espacio-temporales de la distribución de los conidios de A. fumigatus en las vías respiratorias están mal caracterizados.

Aquí, presentamos una configuración experimental para el análisis cuantitativo de la distribución de A. fumigatus conidia en las vías respiratorias de ratones infectados. Utilizando microscopía fluorescente de barrido láser confocal (CLSM) de pulmones ópticamente despejados de ratones que recibieron una aplicación orofaríngea de los conidios de A. fumigatus marcados fluorescentemente, obtenemos imágenes 3D y realizamos el procesamiento de imágenes. Utilizando imágenes 3D del lóbulo pulmonar de montaje completo, hemos mostrado previamente la distribución de A. fumigatus conidia en la vía aérea conductora de ratones 72 horas después de la aplicación deconidios 8.

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Protocolo

Todos los métodos relacionados con los animales de laboratorio descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Instituto Shemyakin y Ovchinnikov de Química Bioorgánica, Academia de Ciencias de Rusia (número de protocolo 226/2017).

1. Aplicación de A. fumigatus conidia

  1. Para obtener A. fumigatus conidia marcado fluorescentemente, fije 5 × 108 conidios agregando 1 ml de paraformaldehído al 3% al pellet de conidios. Incubar en un tubo de ensayo de 50 ml durante 2 h en un agitador a temperatura ambiente.
  2. Lavar los conidios con 20 ml de solución salina tampón de fosfato (PBS): centrífuga a 1.000 x g durante 15 min, retire suavemente el sobrenadante y agregue PBS fresco en un volumen de 20 ml. Repetir.
  3. Disolver los conidios en 900 μL de 0,1 M NaHCO3.
  4. Disolver el éster de succinimidil del colorante fluorescente de 594 nm en 100 μL de dimetilsulfóxido y añadirlo a los conidios.
  5. Incubar los conidios con el tinte durante 1 h en un agitador a 150 rpm a temperatura ambiente.
  6. Lavar los conidios dos veces con 20 ml de PBS en la centrífuga a 1.000 x g durante 15 min.
  7. Diluir los conidios a una concentración de 1 × 108 conidios/ml en PBS y conservar a 4 °C.
  8. Anestesiar el ratón con 0.5-3% de vapor de isoflurano. Coloque el mouse en el soporte, fije la lengua con forrcepciones lisas y sostenga las narinas. Tome una pipeta de un solo canal y aplique 50 μL de suspensión de conidios a la faringe del ratón. Espere hasta que se inhale la suspensión.

2. Preparación de la muestra

  1. Prepare el tubo de ensayo de 50 ml y llénelo con 15 ml de paraformaldehído fresco al 2%. Coloque los instrumentos médicos (fórceps de disección dentadas de 15 cm, fórceps de punta fina de 8 cm y tijeras de 10 cm con extremos romos) en una solución de etanol al 70%.
  2. Sacrificar al ratón de acuerdo con el protocolo IACUC. Luego coloque el mouse en la posición dorsal y fije las patas del mouse con agujas.
    NOTA: Si usa dislocación cervical para la eutanasia, asegure la integridad de la tráquea.
    1. Trate al ratón con etanol al 70% con un pulverizador.
    2. Haga un corte longitudinal mediano en la piel ventral desde las patas traseras hasta las patas delanteras y la barbilla.
    3. Separe la piel del tejido subcutáneo con fórceps dentados y tijeras cerradas. Fije los extremos superiores de la piel con agujas.
    4. Haga una incisión en la pared abdominal y separe el hígado del diafragma. Escoja cuidadosamente el diafragma con tijeras cerradas y luego corte el diafragma.
    5. Haga un corte medial de los tejidos conectivos del tórax y el cuello hasta que la tráquea sea visible.
  3. Pasar un hilo de seda debajo de la tráquea y hacer un nudo quirúrgico con dos forrceps.
    NOTA: Alternativamente, use hilo dental en lugar de hilo de seda.
    1. Tire con cuidado del hilo y corte los pulmones del tejido conectivo con tijeras. Sostenga las tijeras perpendiculares a la mesa.
    2. Coloque los pulmones en el tubo de ensayo de 50 ml con paraformaldehído al 2%. Deje los extremos del hilo fuera del tubo, coloque la cubierta apretada y gire sobre el tubo para cubrir los pulmones con paraformaldehído. Mantenga los pulmones durante la noche a 4 °C.
  4. Diseccionar los lóbulos pulmonares del corazón y entre sí con un bisturí.
    1. Coloque los lóbulos pulmonares en una placa de 24 pozos, con cada lóbulo en un pozo separado. Lave los lóbulos pulmonares en 1 ml de solución salina tamponada Tris (TBS) pH 7.4, 5 veces durante 1 h cada una en un agitador a 150 rpm.
    2. Reemplace 1 ml de TBS con 1 ml del tampón de bloqueo (1% Triton X 100, 5% de leche en polvo en TBS) y deje la muestra durante la noche a temperatura ambiente en un agitador.
    3. Reemplace el tampón de bloqueo con 1 ml de conjugado de estreptavidina-488 nm fluorcromo diluido 1:30 en TBS. Deje la muestra durante al menos 72 h a temperatura ambiente en un agitador (150 rpm).
  5. Lave la muestra 5 veces durante 1 h cada una en 1 ml de TBS a temperatura ambiente en un agitador (150 rpm). Transfiera la muestra a los nuevos pozos y cúbrala con paraformaldehído al 2% durante la noche a 4 °C para la post-fijación.

3. Limpieza óptica del lóbulo pulmonar del ratón

  1. Coloque la muestra en la botella de vidrio de 5 ml llena de 3 ml de solución de metanol-agua al 50% y colóquela en el mezclador de muestras a temperatura ambiente durante 1 h.
  2. Reemplace 3 ml de metanol al 50% con 3 ml de metanol al 100% y póngalo en el mezclador de muestras durante 2 h. Preparar una mezcla 1:2 v/v de alcohol bencílico y benzoato de bencilo (BABB) en un volumen total de 1 ml.
  3. Transfiera la muestra a una placa de 24 pozos y cúbrala con 1 ml de mezcla de BABB durante al menos 30 minutos. No deje la muestra en BABB durante mucho tiempo; BABB puede dañar la placa de plástico y hacer que la muestra sea demasiado rígida.
  4. Coloque la muestra en la cámara de fondo de vidrio de la cubierta de imágenes celulares. La muestra está lista para la obtención de imágenes.

4. Imágenes del lóbulo pulmonar del ratón con CLSM

  1. Encienda el sistema de microscopio. Abra el software del microscopio. Encienda la luz de transmisión en la pestaña Localizar. Seleccione el objetivo 10x.
    NOTA: Para un análisis más detallado, utilice el objetivo 20x, pero aumenta el tiempo del experimento y el tamaño del archivo de imagen.
  2. Coloque la cámara con la muestra en el soporte deslizante de la cubierta. Coloque el soporte en el escenario XY sobre el objetivo. Centra la muestra usando los controles XY del escenario en la parte superior del objetivo. Utilice la luz de transmisión y el ocular para encontrar manualmente el plano Z de la muestra.
  3. Cambie el software a la pestaña Adquisición. Seleccione CLSM λ-mode. Encienda los láseres de 488 nm y 561 nm. Seleccione el espejo dicroico de 488/561 nm. Cambie el rango espectral del detector a 490-695 nm. Ajuste la potencia del láser al rango apropiado (10-50 μW). Ajuste la ganancia del detector entre el rango de 750-900.
    NOTA: Los ajustes de ganancia más altos no son deseables debido al ruido.
  4. Reduzca el agujero de alfiler a 1 unidad Airy haciendo clic en el botón 1 UA. Establezca la resolución de píxeles en 512 × 512 píxeles.
  5. Encienda el modo Z-stack. Inicie Live Imaging. Seleccione el plano focal en el que ambos tintes son visibles.
    NOTA: Si es necesario, ajuste la potencia del láser para normalizar el brillo de los dos tintes fluorescentes. Utilice el modo Galería y el modo de un solo canal para evitar el recorte y para que coincida con precisión con la intensidad de la fluorescencia.
  6. Expanda el panel Z-stack que aparece. Utilice la rueda de enfoque y encuentre el plano más bajo de la muestra. Utilice el botón Primero del panel Z-stack. Mueva el plano focal hacia arriba para encontrar el límite superior de la muestra y guarde la posición mediante el botón Último. Compruebe la representación de la profundidad de la muestra en el panel Z-stack.
    NOTA: Aparecerá una representación de la profundidad de la muestra en el panel Z-stack después de elegir las posiciones Primera y Última.
  7. Coloque el objetivo utilizando la rueda de enfoque cerca de la parte inferior de la muestra, mirando el panel Z-stack. Esto es aproximadamente 20 μm desde el fondo de la muestra.
  8. Desactive el modo Z-stack y active el modo Tile Scan. Adquirir la imagen con un número adecuado de azulejos para el tamaño del espécimen. 5 × 5 azulejos son un buen punto de partida.
  9. Ajuste el número de mosaicos y la posición XY de la muestra hasta que todo el pulmón quepa dentro de la imagen en mosaico. Vuelva a comprobar la corrección de las posiciones de la pila Z con la posición XY recién obtenida del centro de la muestra.
  10. Active los modos Z-stack y Tile Scan. Establezca el paso Z (en el panel Z-stack) en 5 μm. Establezca la velocidad de escaneo en 6. Active la función De guardado automático. Active la opción Guardar iconos separados. Asigne un nombre al archivo. Pulse el botón Iniciar experimento.
  11. Verifique que el experimento no exceda el tiempo asignado en el microscopio; si es así, ajuste la velocidad.
    NOTA: El tamaño aproximado del archivo es superior a 10 Gb; asegúrese de que haya suficiente espacio en el disco duro.

5. Desmezcla espectral y costura

  1. Utilice el software para el procesamiento inicial de imágenes. Para la desmezcla espectral, seleccione la opción Desmezclar. Seleccione dos regiones correspondientes a la estreptavidina/vías respiratorias y los conidios para adquirir los espectros de la imagen. Haga clic en Iniciar desmezcla .
    NOTA: Alternativamente, utilice los espectros existentes para fluorocromos de 488 y 594 nm.
  2. Abra el archivo para el procesamiento de imágenes y seleccione la pestaña Procesamiento. En la sección Métodos, seleccione Geometría y costura. En la sección Parámetro, seleccione la opción Nueva salida y marque la opción Fusionar mosaicos. Utilice el modo de referencia con el canal seleccionado correspondiente a la fluorescencia de las vías respiratorias. Aplique la costura haciendo clic en Aplicar.

6. Procesamiento de imágenes: renderizado de superficies

  1. Abra la imagen como una vista 3D de superación. Cree una superficie de las vías respiratorias con la opción Superficie para el canal que se utilizó para la visualización de las vías respiratorias. Elija el parámetro Suavizado de 10 μm.
    NOTA: Elija también el valor de umbral automático.
  2. Inspeccione visualmente la superficie. Elija los umbrales para reducir la señal de salida. Retire las superficies de pleura y vasos.
  3. Cree una máscara para la superficie de las vías respiratorias mediante las opciones Editar y Enmascarar todo. Seleccione el canal de las vías respiratorias y establezca Vóxeles fuera de la superficie en 0,001.
  4. Guarde el archivo con la máscara de vía aérea como una serie TIFF en la carpeta. Guarde el archivo con el canal de conidios como una serie TIFF en la carpeta independiente.

7. Procesamiento de imágenes: corrección de máscaras

  1. Abra el archivo con la máscara de las vías respiratorias en una plataforma de código abierto para el análisis de imágenes biológicas17 como una imagen de 8 bits. Hacer que la imagen sea binaria haciendo clic en Procesar | | binaria Hacer binario.
    NOTA: Si es necesario, corrija la máscara: elimine las superficies excesivas mediante la selección de polígono y la pestaña Eliminar. Como alternativa, utilice la herramienta Relleno de inundación.
  2. Dibuje las superficies que faltan usando varias veces Dilate (3D):haga clic en Plugins | | de proceso Dilato (3D). Rellene los taladros haciendo clic en Procesar | | binaria Rellenar agujeros. Utilice la interpolación del gestor de selección y ROI para rellenar manualmente los orificios residuales de la máscara. Aplicar varias opciones de Erode (3D) (Plugins | | de proceso Erosionar (3D)) para volver a muestrear el grosor de la máscara.
    NOTA: Crear macros mediante plugins | Opciones de macros para múltiples repeticiones de dilatación (3D) y erosión (3D).
    Asegúrese de que el número de Erode (3D) sea igual al número de aplicaciones de Dilate (3D).
  3. Guarde la máscara en una carpeta nueva como una serie TIFF.

8. Análisis cuantitativo de conidios

  1. Abra la aplicación en la plataforma de programación y computación numérica: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/84525-conidia_counter.
  2. Pulse el botón Agregar archivos. Seleccione la carpeta de máscara de vías respiratorias y la carpeta de conidios.
  3. Establezca un umbral personalizado entre 0 y 1. Pulse el botón OK.
  4. Guarde la tabla de salida en el archivo de .xls personalizado.
  5. Analizar los datos con software para el análisis estadístico.

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Resultados

Siguiendo el protocolo anterior, se obtuvo la imagen 3D que muestra las vías respiratorias y los conidios de A. fumigatus en el lóbulo pulmonar de un ratón (Figura 1A). La estreptavidina (que se utilizó para la visualización de las vías respiratorias) etiquetó bronquios y bronquiolos15. Además, los vasos grandes, que son fácilmente distinguibles de las vías respiratorias por su morfología, y la pleura se visualizan en el canal de las vías respirat...

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Discusión

La obtención de imágenes 3D de órganos completos permite obtener los datos sin disección del espécimen, lo que es de gran importancia para investigar los aspectos espaciales de la distribución anatómica del patógeno en el organismo. Existen varias técnicas y modificaciones de limpieza óptica de tejidos que ayudan a superar la dispersión de la luz láser y permiten la obtención de imágenes de todo el órgano15,16,18,...

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Divulgaciones

Los autores no reportan conflictos de interés en este trabajo.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Prof. Sven Krappmann (Hospital Universitario de Erlangen y FUA Erlangen-Nürnberg, Alemania) por proporcionar la cepa AfS150 de Aspergillus fumigatus conidia. Los autores agradecen a la Oficina de Prensa del MIPT. V.B. reconoce al Ministerio de Ciencia y Educación Superior de la Federación de Rusia (#075-00337-20-03, proyecto FSMG-2020-0003). El trabajo relativo a la obtención y cuantificación de los conidios de A. fumigatus fue apoyado por RSF No 19-75-00082. El trabajo relacionado con las imágenes de las vías respiratorias fue apoyado por RFBR No 20-04-60311.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 594 NHS EsterThermoFisherA20004
Aspergillus fumigatus conidiaATCC46645The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative
Benzyl alcoholPanreac141081.161198.0-100 %
Benzyl benzoateAcrosAC10586-001099+%
C57Bl/6 micePushchino Animal Breeding Centre (Russia)Male. 12 - 30 week old.
CatheterVenisystemsG715-A0118G
Cell imaging coverglass-bottom chamberEppendorf307420284 or 8 well chamber with coverglass bottom
CentrifugeEppendorf5804RAny centrifuge provided 1000 g can be used
Confocal laser scanning microscopeZEISSZEISS LSM780
Dimethyl sulfoxideSigma-Aldrich276855≥99.9%
FIJI image processing packageFIJIFree software
ForcepB. Braun AesculapBD557RToothed
ForcepB. Braun AesculapBD321RFine-tipped
ForcepBochem1727Smooth
Glass bottleDURAN242101304With ground-in lid
Graphic Editor PhotoshopAdobe IncAdobe Photoshop CS
GraphPad SoftwareGraphPadPrism 8
Imaris Microscopy Imaging SoftwareOxford InstrumentsFree trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
IsofluraneKarizoo
NaHCO3Panreac141638
ObjectiveZEISS420640-9800-000 Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3)
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
PBSPanecoP060Π
PipetteProLine7220205 to 50 μL
Powdered milkRothT145.2
Sample mixerDynalMXIC1
ScissorsB. BraunBC257RBlunt
ShakerApexlabGS-2050-300 rpm
SkalpelBochem12646
Silk threadB. Braun3 USP
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugateThermoFisherS11223
Test tubeSPL Lifesciences5005050 mL
Tris (hydroxymethyl aminomethane)HeliconH-1702-0.5 Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1
Triton X-100AmrescoAm-O694-0.1
ZEN microscope softwareZEISSZEN2012 SP5https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html

Referencias

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