Ensayo de cribado de fármacos y radioterapia de rendimiento medio con organoides derivados del paciente

Resumen

Describimos protocolos detallados para el uso de organoides derivados del paciente para el cribado de la sensibilidad de la terapia de rendimiento medio. Las terapias probadas incluyen quimioterapia, radioterapia y quimio-radioterapia. Los niveles de trifosfato de adenosina se utilizan como lectura funcional.

Resumen

Los modelos de organoides derivados del paciente (PDO) permiten la expansión y el mantenimiento a largo plazo de las células epiteliales primarias cultivadas en tres dimensiones y en un estado casi nativo. Cuando se derivan de tejido tumoral resecado o biopsiado, los organoides recapitulan estrechamente la morfología tumoral in vivo y se pueden usar para estudiar la respuesta terapéutica in vitro. Los biobancos de organoides tumorales reflejan la gran variedad de tumores clínicos y pacientes y, por lo tanto, son muy prometedores para aplicaciones preclínicas y clínicas. En este artículo se presenta un método para el cribado de fármacos de rendimiento medio utilizando organoides de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello y adenocarcinoma colorrectal. Este enfoque puede adoptarse fácilmente para su uso con cualquier modelo de organoide derivado de tejidos, tanto normal como enfermo. Se describen los métodos para la exposición in vitro de organoides a quimioterapia y radioterapia (ya sea como modalidad de tratamiento único o en combinación). La supervivencia celular después de 5 días de exposición al fármaco se evalúa midiendo los niveles de trifosfato de adenosina (ATP). La sensibilidad al fármaco se mide mediante las métricas de concentración inhibitoria media máxima (IC₅₀), área bajo la curva (AUC) y tasa de crecimiento (GR). Estos parámetros pueden proporcionar información sobre si un cultivo de organoides se considera sensible o resistente a un tratamiento en particular.

Introducción

Los modelos de organoides establecidos a partir de células madre adultas y cultivados en una matriz extracelular (MEC) tridimensional (3D) y un cóctel de factor de crecimiento específico (también conocidos como organoides HUB) están ganando terreno como plataformas de cribado oncológico preclínico. Los cultivos de organoides derivados del paciente (PDO) se pueden establecer a partir de biopsias de tejido normal y enfermo en 1-2 semanas y se pueden expandir durante un mínimo de 1-2 meses hasta períodos de tiempo ilimitados. La criopreservación permite el uso a largo plazo de cultivos bien caracterizados. A diferencia de los modelos tradicionales de líneas celulares bidimensionales que se derivan clonalmente, los modelos PDO recapitulan estrechamente el tejido tumoral original, tanto fenotípica como genéticamente, y preservan la heterogeneidad tumoral. Los cribados de fármacos de rendimiento medio en las DOP, que prueban una amplia gama de terapias, proporcionan una plataforma única para la medicina personalizada.

Estudios previos han descrito el uso de modelos de organoides para el cribado terapéutico, específicamente fármacos y radioterapia, en modelos establecidos a partir de diferentes tipos de tumores y muestran el potencial predictivo de los organoides para guiar la toma de decisiones clínicas 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . En este trabajo se describen los métodos de cribado de la terapia oncológica mediante PDOs con una capacidad de rendimiento medio (Figura 1A). Este protocolo se configura en un formato de placa de 384 pocillos con semiautomatización, lo que permite realizar pruebas terapéuticas para hasta ocho modelos de organoides, 16 compuestos y hasta ocho placas de 384 pocillos. Además de los cribados de fármacos compuestos, en este artículo también se describen métodos para analizar la sensibilidad y sensibilización de la radioterapia. Además, se discute el uso de la robótica de alto rendimiento para mejorar el cribado de drogas a la automatización completa. Es importante destacar que los organoides de diferentes tejidos pueden requerir diferentes medios y diferentes manipulaciones.

Aquí se describe un protocolo general de ensayo de cribado de fármacos, que puede necesitar adaptación en función del organoide de interés. En la discusión se incluyen puntos de partida y sugerencias para la optimización, así como recomendaciones generales sobre la configuración experimental y la práctica de organoides. Se dan ejemplos de organoides del carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), que suelen tener una morfología densa, y organoides de cáncer colorrectal (CCR), que pueden tener una morfología quística o densa. Tenga en cuenta que los métodos de cultivo de establecimiento y expansión de organoides primarios no están cubiertos en este protocolo; Para las técnicas básicas de organoides, el lector debe consultar otros protocolos (p. ej., ¹²). Este protocolo visual proporcionará información sobre el proceso de cribado de fármacos de rendimiento medio utilizando modelos de organoides.

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Protocolo

NOTA: Antes de utilizar este protocolo, asegúrese de seguir las pautas del comité de ética de investigación en humanos de la institución. La recogida del tejido del paciente y de los datos descritos en este protocolo se ha realizado siguiendo las directrices de EUREC y siguiendo la legislación europea, nacional y local. Todos los organoides se derivaron de pacientes que dieron su consentimiento, y el consentimiento se puede retirar en cualquier momento.

1. Antes de la selección

1. Confirmar la identidad de los modelos recién establecidos (por ejemplo, mediante histología y/o secuenciación de ADN ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11}) para excluir la posibilidad de un sobrecrecimiento celular normal y garantizar que el cribado del fármaco se realice en cultivos de organoides tumorales (véase el ejemplo enFigura 2D).
2. Diseñe la configuración de la placa experimental, haciendo uso de las recomendaciones generales dadas en la sección de discusión (ver ejemplo en la Figura Suplementaria S1).
3. Calcule el número requerido de organoides y prepare suficientes organoides listos para dividir en el día 0 (use la Tabla 1 como referencia).
   NOTA: Dependiendo del GR del tipo y modelo de organoide, se requieren aproximadamente 1-2 placas completas de 6 pocillos por cada placa de cribado completa de 384 pocillos. Como pauta, un pocillo lleno de una placa de 6 pocillos contiene ±20.000 organoides quísticos o hasta 50.000 organoides densos o parecidos a las uvas.
4. Compruebe si el dispensador de células está calibrado con un colorante indicador y calibre de acuerdo con el protocolo del fabricante si es necesario.

2. Preparación de reactivos

1. Prepare el medio base: avanzado DMEM/F12+++ (aDF+++). Agregue 5 mL de 1x sustituto de L-glutamina (v/v), 1 M de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina etanosulfónico (HEPES) y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina a un frasco de 500 mL de DMEM/F12 avanzado. Mantenga aDF+++ a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
2. Prepare el medio de expansión (es decir, crecimiento) del organoide apropiado para el tipo de organoide en uso ^9,10.
3. Prepare el medio de cribado, que podría ser diferente del medio de expansión dependiendo de la configuración experimental. Para ayudar a la recuperación después de dispensar los organoides, agregue 5 μM de inhibidor de la Rho quinasa (ROCK) (Y-27632) al medio de cribado.
4. Prepare una solución de 100 mg/ml de dispasa II en aDF+++.
   NOTA: Una solución 100x de la dispasa es estable a -20 °C durante 2 meses.

3. Día 0: Preparación de organoides

NOTA: Los volúmenes indicados a continuación parten de una placa completa de 6 pocillos de organoides, equivalente a 1200 μL de organoides/ECM (200 μL de organoides/ECM por pocillo).

1. Inspeccione los organoides con un microscopio de campo claro para detectar posibles infecciones, densidad y apariencia general; Tome imágenes de todos los modelos como referencia antes de pasar.
2. Pase los organoides y la semilla de acuerdo con los siguientes pasos. Realice estos pasos a temperatura ambiente para reducir las fluctuaciones de temperatura de los organoides. Siempre que manipule suspensiones de organoides, utilice puntas de baja retención o pipetas y plásticos prehumedecidos para evitar la pérdida de organoides.
   1. Cuando utilice volúmenes más grandes de MEC/organoides (>1200 μL de MEC), considere la digestión de la MEC con dispasa de la siguiente manera para ayudar a la eliminación de organoides de la MEC.
      NOTA: La dispasa desintegra la MEC, pero no afecta a los organoides.
      1. Opcional: Añadir 1 mg/mL de dispasa a cada pocillo e incubar los organoides en una incubadora a 37 °C durante 30 min antes de pasar como de costumbre.
         NOTA: Como la dispasa no es inactivada por los componentes del medio, lávela (usando aDF+++) con al menos 20 veces el volumen de la dispasa agregada.
   2. Recoja los organoides en tres tubos de 15 ml (hasta 400 μl de ECM por tubo). Rellene hasta 12 mL con aDF+++ y centrifugue durante 5 min a RT a 85 × g. Si se granula correctamente, aspire el sobrenadante. Si los organoides no se han granulado claramente, centrifugar a una velocidad más alta (hasta 450 × g; dependiendo del tipo y tamaño del organoide) durante 5 minutos adicionales. Vuelva a suspender el pellet y repita el lavado.
      NOTA: Una capa similar al vidrio sobre el pellet indica la presencia de ECM. Compruebe que no haya organoides atrapados en el ECM utilizando un microscopio de campo claro (puede ser aceptable un número bajo de organoides atrapados) y retire con cuidado el ECM restante con una pipeta p1000. Si hay (demasiados) organoides presentes en el ECM, repita el paso de disociación de la dispasa, o lave el pellet y centrifugue a una velocidad más alta (máximo 450 × g).
   3. Por cada tubo de 15 mL, vuelva a suspender la pelletza de organoide en 1 mL de aDF+++ y disocie cuidadosamente los organoides hasta que hayan alcanzado el tamaño correcto. Utilice el método de disociación que se utiliza para la división regular, según el tipo/morfología (Tabla 1).
      1. En el caso de organoides quísticos y similares a la uva, interrumpirlos mecánicamente, cortándolos en pequeños fragmentos (<100 μm) pipeteando hacia arriba y hacia abajo con un p1000 con una punta p2 en la parte superior, o con una pipeta Pasteur taponada con vidrio prehumedecido cuya punta se ha estrechado en una llama.
         NOTA: Confirme la disrupción de organoides utilizando un microscopio de campo claro después de pipetear hacia arriba y hacia abajo cada 5 veces, con el objetivo de que los organoides sean menores o estén dentro del rango de tamaño de la pantalla (Tabla 1).
      2. En el caso de organoides densos, añadir 1 mL de solución v/v al 50% de TrypLE en aDF+++ para resuspender el pellet celular, e incubar durante un mínimo de 2 min a 37 °C. A continuación, agite el tubo vigorosamente hacia arriba y hacia abajo y compruébelo con un microscopio de campo claro. Utilizando el mismo enfoque que el anterior, altere mecánicamente los organoides con una pipeta, comprobando bajo el microscopio constantemente durante todo el proceso. En el caso de los organoides HNSCC, incubar en una solución al 100% de TrypLE durante 5 min.
         NOTA: Dependiendo del tipo de cultivo, trate de terminar con pequeños grupos de células (p. ej., organoides de CCR, >20 μm) o células individuales (p. ej., organoides HNSCC). Asegúrese de que la incubación proteolítica no supere los 15 minutos, ya que esto puede afectar a la viabilidad del organoide.
   4. Lavar los organoides con 10 mL de aDF+++. Centrifugar los organoides a 85 × g durante 5 min; Aspire el sobrenadante si está correctamente granulado. Alternativamente, si los organoides son difíciles de pelletizar, centrifugar hasta 450 × g durante 5 min.
   5. Organoides de semillas a alta densidad en medio de expansión al 50%/50% ECM (lo que permite una fácil eliminación de la ECM en la sección 4). Apunte a una densidad aproximadamente doble en comparación con una división regular, lo que a menudo resulta en una división 1:1 (vea los ejemplos en la Figura 1). Siembre organoides en gotas de 10 μL (un total de 200 μL por pocillo) de una placa precalentada de 6 pocillos.
      NOTA: Mantenga las placas precalentadas en una incubadora a 37 °C durante la noche o en un horno a 60 °C durante al menos 1 h para garantizar una solidificación rápida de la ECM, evitando la propagación de la ECM y, por lo tanto, asegurando la formación adecuada de la cúpula del hemisferio.
   6. Invierta la placa y devuélvala a una incubadora a 37 °C durante 30 minutos para permitir
   el ECM que se va a configurar. Después de 30-60 min, agregue suavemente el medio de expansión (temperatura ambiente) a los pocillos.

4. Día 2 (rango: días 1 - 3): Dispensación de organoides

NOTA: Dependiendo del organoide GR, esto también puede ocurrir en el día 1 o 3. A lo largo de la prueba de detección de drogas, los organoides se mantienen en suspensión. Para ello, se dispensan en una concentración baja de MEC (5-10%) en la que se mantiene el crecimiento de los organoides, pero en la que no se produce ninguna solidificación de la MEC. Esto permite la dispensación automatizada, la interacción óptima entre organoides y compuestos y la lisis celular reproducible, pero también limita la oportunidad de cambiar el medio.

1. Calcule la concentración y la cantidad de suspensión de organoides necesaria para la prueba de detección de drogas.
   1. Dependiendo del dispensador de celdas que se utilice, tenga en cuenta el volumen muerto durante el cálculo.
      NOTA: Al dispensar 40 μL de suspensión de organoide por pocillo, una placa 384 requiere un volumen total de 15,4 mL. En promedio, cada tubo dispensador de celda Multidrop tiene un volumen muerto de ~ 1 mL, lo que resulta en 8 mL de volumen muerto cuando se usan todas las boquillas. Esto da como resultado un total de 23,4 mL para cada modelo de organoide para una placa completa de 384 pocillos. Por lo tanto, la preparación de 25 mL de suspensión de organoide garantiza organoides suficientes para la dispensación, además de para el análisis opcional de seguimiento (polimorfismo de un solo nucleótido, SNP) (véase 4.4.7).
2. Preparación para la recolección de organoides
   1. Para preparar el tampón de lavado, agregue el inhibidor de ROCK (Y-27632) a aDF+++ hasta una concentración final de 10 μM. (se requieren ±100 mL para cada cultivo de organoides que se analizará).
   2. Inspeccione los organoides en todos los pocillos usando un microscopio de campo claro para evaluar la recuperación de organoides después del paso y para excluir posibles infecciones. Verifique si los organoides son del tamaño correcto tomando una imagen microscópica y midiendo los organoides con una barra de escala digital (Tabla 1).
      NOTA: Si los organoides no son del tamaño correcto (demasiado grandes o demasiado pequeños), se perderán en el proceso de filtrado y es posible que no haya suficiente material para realizar la prueba de detección del fármaco. Si este es el caso, se recomienda posponer la prueba de detección de drogas.
   3. Añadir 1 mg/mL de dispasa a cada pocillo e incubar en una incubadora a 37 °C durante 30-60 min (hasta 120 min como máximo) para digerir la MEC. Verifique el progreso de la disociación de la ECM bajo el microscopio para ver si las gotas de ECM están flotando. De lo contrario, pipetee el contenido del pocillo sobre las gotas de ECM, que deberían desprenderse con facilidad cuando se complete la digestión.
3. Prepare los organoides para dispensar en una placa de 384 pocillos de acuerdo con los siguientes pasos. Realice estos pasos a temperatura ambiente (incluida la centrifugación) para reducir las fluctuaciones de temperatura de los organoides.
   1. Recoja la suspensión de organoide de la placa de cultivo con una pipeta p1000.
   2. Dependiendo de los pasos de filtrado requeridos (dependiendo del tipo de organoide, ver Tabla 1), siga el paso correspondiente.
      NOTA: La prehumectación de los filtros con tampón de lavado es esencial para evitar que los organoides se adhieran al filtro.
      1. Realice el filtrado simple cuando incluya todos los fragmentos pequeños y células individuales, por ejemplo, para organoides tumorales HNSCC, filtro para organoides < 70 μm. Recoja los organoides recolectados en un tubo de 15 mL y lávelos dos veces con 12 mL de tampón de lavado. Filtre los organoides sobre un filtro de 70 μm previamente humedecido en un tubo de 50 mL, lave el filtro con 3 x 4 mL de aDF+++ y transfiéralos a un tubo de 15 mL. Si el volumen es demasiado alto, centrifugar a 85 × g durante 5 min y transferir el pellet en 12 mL de aDF+++ a un tubo de 15 mL; Continúe con 4.3.3.
      2. Realice un doble filtrado para eliminar residuos y organoides grandes, por ejemplo, para organoides tumorales de CCR, filtre organoides de >100 μm y <20 μm. Filtre inmediatamente los organoides cosechados sobre un filtro prehumedecido de 100/70/40 μm (Tabla 1) en un tubo de 50 mL y lave el filtro con 2 x 10 mL de tampón de lavado. Utilice un filtro de 20 μm prehumedecido por cada tres pocillos de una placa de organoides de 6 pocillos. Filtre los organoides de <100 μm sobre los filtros de 20 μm y lave el filtro con 2 x 10 ml de tampón de lavado. Recupere los organoides del filtro invirtiéndolo sobre un tubo limpio de 50 mL y lavando con 3 x 4 mL de aDF+++. Transfiera la suspensión de organoides a un tubo de 15 mL; si el volumen es de >15 mL (ya que puede ser necesario lavar más el filtro), centrifugar a 85 × g durante 5 min y transferir el pellet en 12 mL aDF+++ a un tubo de 15 mL.
         NOTA: Los organoides que quedan atrapados en el filtro se pueden recuperar para su uso posterior (passaging); En el siguiente paso se utilizan organoides < 100 μm. Las células y los desechos que pasaron por el filtro se desecharán, los organoides atrapados en el filtro (>20 μm, <100 μm) se utilizan para la detección.
   3. Centrifugar a 450 × g durante 3 min y aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet con cuidado en 1 mL de medio de cribado, rellene con otro medio de 1-9 mL (dependiendo del tamaño del pellet; trate de tener ~75-150 organoides/10 μL) y vuelva a suspender pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica prehumedecida.
      NOTA: Se recomienda añadir 5 μM de inhibidor de ROCK al medio de cribado.
   4. Mezcle bien la suspensión de organoides pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica prehumedecida 5x, y cuente el número de organoides en 10 μL de la suspensión pipeteando una línea en una placa de Petri y contándolos bajo el microscopio. Para organoides más pequeños (<70 μm), agregue 10 μL de la suspensión de organoide a un portaobjetos de 10 cámaras con una rejilla de hemocitómetro y cuente el número de organoides. Calcule el número de organoides/mL siguiendo las instrucciones del fabricante.
   5. Prepare la cantidad requerida de medio dispensador agregando 5% (v/v) de ECM al medio de cribado helado (por ejemplo, para 25 mL de medio dispensador, agregue 1,25 mL de ECM a 23,75 mL de medio de tamizado helado). Solo agregue ECM a un medio helado para evitar que el ECM se solidifique. Al examinar varios modelos de organoides, prepare el medio de dispensación a granel para garantizar la consistencia del % de ECM en todos los modelos.
   6. Agregue el número requerido de organoides (consulte la Tabla 1 para obtener pautas y la discusión para notas) a un nuevo tubo de 15 mL y centrifugue a 450 × g durante 3 min. Aspire con cuidado sin alterar el pellet y vuelva a suspender completamente el pellet en 100 μL de medio de cribado con una pipeta p200. Asegúrese de que el pellet sea homogéneo y se resuspenda completamente sin ningún grupo de organoides. A continuación, rellene la suspensión con la cantidad necesaria de medio dispensador helado y mantenga la suspensión de organoides en hielo a partir de ahora.
4. Dispense los organoides en placas de 384 pocillos utilizando un dispensador de células (por ejemplo, Multidrop).
   1. Configure el dispensador de células para dispensar 40 μL de suspensión de células por pocillo.
      1. Menú principal | Seleccione el tipo de placa | DE ACUERDO | Norma 384 | DE ACUERDO
      2. Tipo de cassette, casete de tubo estándar (lado derecho) | seleccione el volumen con las flechas hacia arriba y hacia abajo (40 μL).
      3. Seleccione Placa completa o Columnas, según el diseño de la placa.
   2. Lave el tubo con etanol (EtOH) al 70%, seguido de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS); use >15 mL por lavado. Deje que entre un poco de aire entre cada líquido para visualizar el inicio y el final de cada lavado. Compruebe si todos los cabezales dispensadores están dispensando "rectos" y lave de nuevo cuando este no sea el caso.
   3. En el menú Configuración , seleccione pre-dispensación y ajústelo a 60 μL para pre-dispensar la suspensión de organoides después de la cebación y antes de la dispensación.
   4. Prepare el dispensador con la suspensión de organoides mientras mantiene la suspensión en hielo. Vuelva a suspender pipeteando continuamente con una pipeta p1000. Tenga cuidado de evitar la generación de burbujas de aire en la solución. Una vez cebado y la placa esté en posición, dispense los organoides pulsando Inicio.
      NOTA: Este paso es más fácil de realizar con dos personas: una persona que resuspende y la otra que opera el dispensador.
   5. Si es necesario, para cada modelo de organoide incluido en la criba, dispense al menos 5 pocillos más en una placa de cribado adicional.
      NOTA: Esto permitirá una lectura T = 0 más tarde este día (consulte la sección 7 y la discusión). Esta dispensación también se puede hacer manualmente si se prefiere.
   6. Vuelva a colocar la tapa de la placa inmediatamente para evitar la contaminación de los pocillos. Confirme bajo el microscopio que todos los pocillos se llenaron correctamente y si los organoides están distribuidos uniformemente por toda la placa.
   7. Si es necesario, una vez finalizado el enchapado, recupere la suspensión de organoides del tubo (haga clic en Vaciar) y gire los organoides restantes hacia abajo. Transfiera a un tubo de 1,5 ml y congele a presión para un análisis posterior de SNP.
      NOTA: Si el aire entró en la tubería durante la dispensación y algunos pocillos no se llenaron correctamente, llene los pocillos manualmente agregando 40 μL por pocillo.
   8. Si se dispensan varios modelos de organoides, enjuague el tubo con PBS, EtOH y PBS, y repita los pasos 4.4.4-4.4.8 para cada modelo.
   9. Transfiera las placas a una atmósfera de CO₂ al 5% en una incubadora a 37 °C hasta que estén listas para la dispensación del medicamento. Para eliminar las diferencias en el intercambio de aire entre las diferentes placas, evite apilar las placas en la incubadora.
   10. Limpie el tubo lo antes posible con PBS y luego con EtOH. Asegúrese de secar completamente el tubo haciendo correr aire a través del sistema.

5. Día 2 (rango: días 1 - 3): Dispensación de medicamentos utilizando un dispensador de medicamentos (por ejemplo , D300e)

NOTA:. Dependiendo de la pregunta de investigación, la impresión de medicamentos también se puede realizar un día después de la siembra.

1. Configurar el dispensador de medicamentos
   1. Inicie el software del dispensador y seleccione el formato de placa deseado utilizado para la pantalla resaltando la Placa 1 y seleccionando la herramienta de lápiz para que aparezca el editor de placas.
   2. Seleccione el tipo de placa y establezca el volumen adicional de cada pocillo (volumen de líquido (suspensión de organoides) que ya está en la placa). Para el formato de 384 pocillos, utilice 40 μL/pocillo.
   3. En la barra de la izquierda, use el símbolo + para agregar cada solución de medicamento que se usará en la pantalla.
   4. Edite cada fluido seleccionando la herramienta lápiz . Edite el nombre del medicamento, la clase de medicamento (p. ej., a base de DMSO o acuoso (p. ej., agua, PBS)) y la concentración de stock del medicamento.
      NOTA: No exceda la concentración de caldo de 10 mM de cada medicamento. Idealmente, la concentración máxima de solvente debe ser de 0.8% para DMSO y 3% para PBS/0.3% de detergente (por ejemplo, Tween) (consulte la normalización a continuación y la discusión).
   5. Una vez que se hayan agregado todos los medicamentos en el programa, seleccione los pocillos para agregar los medicamentos resaltando un pocillo en el diseño de la placa y arrastrándolo. Haga clic con el botón derecho en los pozos seleccionados y agregue la concentración.
      1. Establezca el valor para definir la concentración deseada de cada fármaco (μM).
      2. Para la valoración, defina la concentración más alta y más baja deseada de cada fármaco (μM), la distribución (logarítmica o lineal), las repeticiones por nivel (por ejemplo, 3) y el patrón de valoración.
      3. Para la valoración dirigida, defina la concentración más alta y más baja de cada fármaco, la distribución (logarítmica o lineal), la concentración objetivo (μM), la región objetivo (niveles), el rango objetivo (log), las réplicas por nivel (p. ej., 3) y el patrón de valoración.
   6. Normalice todos los pocillos de medicamentos a su solvente apropiado (por ejemplo, DMSO o acuoso + Tween-20). En el caso de los fármacos disueltos en soluciones acuosas, añadir Tween-20 (concentración final del 0,3% en el stock de fármacos) para asegurar la tensión superficial adecuada de la solución del fármaco para su dispensación utilizando el D300e (véase 5.2.6). Seleccione todos los pocillos, incluidos los que no tienen fármaco (controles negativos), haga clic con el botón derecho, seleccione Normalización y, a continuación, Normalizar. Seleccione el disolvente adecuado y seleccione Normalizar al volumen de la clase más alta para normalizar a la concentración más alta del fármaco seleccionado.
      NOTA: Ahora aparecen triángulos negros en la esquina inferior izquierda de cada pocillo para confirmar la normalización. Trate de tener un mínimo de 6 (idealmente >9) pocillos de control negativo para cada solvente de medicamento utilizado.
   7. Seleccione un mínimo de 3 pocillos (idealmente >6) para utilizar reactivos citotóxicos conocidos, como la estaurosporina, como controles positivos (1-5 μM) en función de los cultivos. Si se desconoce la concentración citotóxica del control positivo, opte por una concentración alta para matar todos los organoides en los pocillos de control positivo.
      NOTA: Alternativamente, Navitoclax (20 μM) se puede utilizar para asegurar la muerte de los organoides durante la detección del fármaco.
   8. Una vez que se complete el diseño de la placa, seleccione Ejecutar (si la máquina está encendida) en la esquina superior izquierda. Guarde el protocolo para continuar.
      NOTA: El programa ya ha calculado el volumen requerido de cada medicamento para la dispensación. Como esto incluye el error de pipeteo, esta es la cantidad exacta de medicamento necesaria para todo el protocolo. Opcional: Al seleccionar Simular , se simulará todo el protocolo (sin agregar fármacos) para observar cómo se ejecutará el protocolo. Tanto en el modo de ejecución como en el de simulación , se genera un informe que documentará el tiempo, el pedido y los volúmenes de medicamentos añadidos a cada pocillo. Esto puede ser útil para asegurarse de que el protocolo es correcto y para determinar el volumen exacto y el número de casetes que se necesitarán antes de continuar con el experimento.
2. Preparación e impresión de medicamentos
   1. Agregue 0.3% (v/v) de Tween-20 a las reservas acuosas (p. ej., agua o PBS) para garantizar la tensión superficial adecuada de la solución del medicamento para dispensar con el D300e. Asegúrese de que la concentración de Tween-20 no supere el 3 % de PBS/0,3 % de Tween-20 (v/v) y mantenga la concentración final de Tween-20 por debajo del 0,01 %.
      NOTA: Solo agregue Tween-20 a las existencias de medicamentos justo antes de agregarlo al casete de la impresora de medicamentos, ya que la alta concentración de Tween-20 en las existencias puede inactivar medicamentos (basados en proteínas) (por ejemplo, medicamentos basados en anticuerpos). Este paso no es necesario para los medicamentos disueltos en DMSO; sin embargo, asegúrese de que el porcentaje final de DMSO en cada pozo no supere el 0,8-1%.
   2. Tenga listos los casetes D8+ de bajo volumen y D4+ de alto volumen. Marque Usar casetes de alto volumen en el programa cuando se utilicen grandes volúmenes de fluido de normalización.
   3. Ejecute el protocolo para comenzar a dispensar los medicamentos.
      NOTA: El programa ejecutará el protocolo paso a paso e indicará cuándo y cuánto de cada compuesto se debe agregar. Use puntas de filtro para manejar altas concentraciones de drogas. Tenga cuidado de desechar los desechos químicos y las puntas usadas siguiendo las pautas de bioseguridad.
   4. Una vez finalizado el protocolo, utilice sellos adhesivos permeables al aire y a los líquidos (p. ej., sellos de placa de poliuretano de grado médico; Tabla de Materiales) para cubrir las placas, y volver a colocar las placas a 37 °C, 5% CO₂.
      NOTA: El uso de estos sellos evita la evaporación por "efecto de borde" (consulte la discusión). Si no usa los sellos, asegúrese de que los bordes exteriores de la placa no se usen en la pantalla de detección de medicamentos. No apile placas una encima de la otra y asegúrese de que las placas se mantengan hacia la parte posterior de la incubadora, o use una incubadora que no esté abierta (con frecuencia) para evitar fluctuaciones de temperatura.
   5. Si la radioterapia se combina con fármacos impresos, se debe continuar con la sección 6. De lo contrario, deje las placas en la incubadora durante 5 días.
      NOTA: Dependiendo del tipo de organoide y del tipo de fármaco, algunos experimentos pueden durar más de 5 días. Para experimentos que duren >7 días, cambie cuidadosamente el medio y los compuestos a la mitad del procedimiento experimental (por ejemplo, reemplazando el 50% del medio con medio de cribado nuevo) para evitar la muerte celular extensa en los pocillos de control negativos.

6. Día 2 (rango: días 2 - 4): Tratamiento de organoides mediante radiación por haz de fotones

NOTA: Los siguientes pasos describen la irradiación de organoides. Para evaluar los efectos radiosensibilizantes de los compuestos farmacológicos, se realiza irradiación 24 horas después de que los organoides se exponen a la quimioterapia. El mismo protocolo se utiliza para evaluar los efectos de la irradiación sola, en la que los organoides se siembran e irradian 24 horas después de la siembra. Esto puede requerir cierta optimización dependiendo de la hipótesis y los cultivos de organoides. Los siguientes pasos describen el proceso utilizado para irradiar organoides utilizando haces de fotones de 6 MV generados específicamente (Tabla de Materiales). Esta máquina está optimizada para aplicaciones clínicas y, por lo tanto, refleja la práctica clínica real. Diferentes máquinas pueden requerir una configuración diferente y también pueden requerir la optimización de la dosificación, ya que la dosis eficiente puede diferir de la seleccionada.

1. Retire las placas de la incubadora a 37 °C y vuelva a colocar las tapas en cada placa encima de los sellos; No retire los sellos. Lleve la placa 0 Gy en este proceso para asegurarse de que la placa de control se haya sometido a condiciones idénticas.
2. Transporta los organoides al irradiador. Configure el dispositivo de irradiación llenando una caja de plástico con agua tibia del grifo y fíjelo en el soporte de la placa para evitar que la placa flote.
3. Sumerja la placa en agua para que el agua quede nivelada con la superficie superior de la placa. Fije la placa en su posición usando un aparato que no permita que la placa flote (como se muestra en el video). Salga de la habitación e irradie las placas a dosis crecientes (por ejemplo, 1, 2, 4, 6, 8 y 10 Gy). Irradie solo una placa a la vez, ya que una pila de placas no permite una dispersión uniforme de la radiación.
   NOTA: Asegúrese de elegir las dosis de irradiación adecuadas para lograr una curva dosis-respuesta.
4. Seque bien las placas después de la irradiación con pañuelos desechables y vuelva a colocar la tapa dura. Transporta las placas de vuelta a la sala de cultivo. Retire la tapa dura y limpie el exterior de cada placa con pañuelos de papel EtOH ligeramente rociados. No retire los sellos transpirables.
5. Coloque las placas en la parte posterior de la incubadora para evitar fluctuaciones de temperatura debido a la apertura de la puerta; No apile los platos.

7. Día 2. Opcional: Placa de medición del ensayo de viabilidad celular (CTG) CellTiter-Glo 3D T=0 (necesaria para el análisis GR)

1. Si tiene como objetivo calcular las métricas de GR (consulte 11.3.5 y discusión), mida los valores de CTG en la placa T = 0 siguiendo los pasos 9.1-10.4.

8. Un día antes de la lectura de la prueba de detección de drogas: preparación

1. Calcule el volumen total de CTG requerido. Para una placa de 384 pocillos, use 40 μL de CTG por pocillo (agregue CTG 1:1 según la recomendación del fabricante). Tenga en cuenta el volumen muerto para la dispensación multigota (1 ml por tubo). Descongele el CTG durante la noche a 4 °C, protegido de la luz.
2. Pruebe si el dispensador requiere calibración.

9. Día 7 (rango: días 7 a 14): Lectura de detección de drogas: Ensayo CTG

1. Deje que CTG alcance la temperatura ambiente. Inspeccione visualmente todos los pocillos de la placa de 384 pocillos antes de la lectura, registre si se ha producido alguna infección.
2. Tome imágenes de los pocillos relevantes bajo un microscopio de campo claro. Incluyen controles positivos (estaurosporina), controles negativos (pocillos de normalización) y la concentración más alta de cada fármaco.
3. Lave y cebe la máquina multigota de acuerdo con los pasos descritos en la sección 4.4. Dispense 40 μL de CTG a cada pocillo, de acuerdo con la configuración de la placa. Agitar con el agitador de platos del dispensador multigota (Shake) durante 5 min, e incubar a temperatura ambiente, protegido de la luz durante 25 min.
   NOTA: La reacción CTG es una reacción enzimática y, por lo tanto, se ve afectada por la temperatura y el tiempo de incubación. Se supone que la señal es estable durante 30-60 min; sin embargo, utilizar el mismo tiempo de incubación para todas las placas, especialmente cuando se calculan las métricas de GR, aumenta la precisión.

10. Mediciones de bioluminiscencia CTG

1. Encienda el lector de placas de bioluminiscencia con capacidad de 384 pocillos y la computadora. En este caso, se utilizó un lector de placas Spark.
2. Abra el software editor de métodos Spark (consulte la Tabla de materiales). Seleccione el formato de la placa: COS384fb-Corning 384 negro mate | sin tapa | sin casete de humedad; Seleccione los pozos que se deben medir.
3. En el menú inferior izquierdo, selecciona Detección | Luminiscencia, y arrastre por debajo de la placa. Tipo: atenuación, segundo menú: ninguno. Establezca el tiempo de integración [ms]: 500.
4. Coloque la placa, selecciónela y ejecute el método haciendo clic en Inicio. Guarde la hoja de cálculo exportada.

11. Análisis de datos

1. Calcule el factor Z (Z') para evaluar la calidad de la pantalla.
   1. Calcule el promedio (Av) y las desviaciones estándar (SD) de los controles negativos (Ctrl^neg, p. ej., DMSO) y positivos (Ctrl^pos, p . ej., Staurosporina).
   2. Calcule el factor Z = 1 - (3 × SD[Ctnl^neg] + 3 × SD[Ctrl^pos]/mean[Ctrl^neg] -mean[Ctrl^pos]).
      NOTA: Z' expresa la variación dentro y el espacio radiométrico entre los controles positivo y negativo y, por lo tanto, es una medida para el rango dinámico del ensayo¹³. Excluir los resultados de las pruebas de detección de drogas con un Z' inferior a 0,3; Se recomienda utilizar datos con un > Z' de 0,5. El promedio de Z' generalmente varía entre 0,5 y 0,7 (dependiendo de los modelos de organoides utilizados). Para que el Z' sea informativo, todos los organoides de los pocillos de control positivo deben haber muerto.
2. Calcule la viabilidad relativa del organoide para cada pozo estableciendo Ctrl^neg en 100% y Ctrl^pos en 0% viabilidad.
   1. Utilice esta fórmula para calcular la viabilidad de un organoide.
      Viabilidad del organoide = 100% × (valor del pozo experimental - Av Ctrl^pos) / (Av Ctrl^neg - Av Ctrl^pos)
      1. En el caso de los organoides irradiados, calcule el valor porcentual.
         Porcentaje de viabilidad del organoide = 100% × (valor del pozo experimental de x GY) / (valor del pozo Av Ctrl^negativo de 0 GY)
   2. Visualice los datos en un programa de software de análisis de datos copiando los datos de viabilidad en una tabla xy, seleccionando el número adecuado de valores replicados por concentración.
   3. En el caso de las concentraciones logarítmicas de fármacos, transforme las concentraciones de fármacos y copie estos valores en la primera columna de la tabla.
   4. Para formatear el gráfico, seleccione el tipo de gráfico (XY), seleccione el error estándar de la media (SEM) y establezca el origen en la parte inferior izquierda.
3. Determine el IC₅₀ relativo, el área bajo la curva (AUC) y las métricas GR.
   1. Para la regresión no lineal, en la pestaña Analizar , seleccione ajustar una curva con regresión no lineal. Elija la opción logaritmo (inhibidor) frente a respuesta normalizada - pendiente variable para crear una curva de muerte.
   2. Haga clic en la pestaña Resultados para mostrar el IC₅₀ relativo para cada medicamento.
      NOTA: Esta es la concentración de fármaco que da una respuesta a medio camino entre la parte inferior y la parte superior de la curva. La parte inferior y superior son mesetas en las unidades del eje Y.
   3. En Área bajo la curva (AUC), en la pestaña Analizar , seleccione Área bajo la curva, use la configuración predefinida y seleccione Aceptar.
   4. Haga clic en la pestaña Resultados para mostrar el AUC (área total) de cada medicamento.
      NOTA: El AUC es una medición integrada de un efecto medible, que se utiliza como medida acumulativa del efecto de un medicamento. Con algunas moléculas, como los anticuerpos, la curva dosis-respuesta no tiene forma sigmoidal y los valores de IC₅₀ son difíciles de interpretar. En tal situación, los valores de AUC pueden proporcionar más información como métrica para comparar las diferencias entre las líneas de organoides.
   5. Alternativamente, si las mediciones de CTG se toman en el día 2 (pasos opcionales 4.4.5 y sección 7), calcule las métricas GR. Analice las métricas de GR utilizando una calculadora de GR en línea¹⁴, teniendo en cuenta las diferencias en la tasa de proliferación entre los modelos de organoides a lo largo de un cribado de fármacos para garantizar mediciones más reproducibles y sensibles.

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Resultados

El objetivo de este experimento fue examinar la sensibilidad de los organoides HNSCC a la quimioterapia y la radioterapia como agentes únicos. También probamos la reproducibilidad de los resultados ejecutando el experimento varias veces con un intervalo de una semana, lo que resultó en varias réplicas biológicas (experimentos 1-3) (Figura 2). Siguiendo el protocolo, en el día 0, se cosecharon PDOs de HNSCC de 6 pocillos de una placa de 6 pocillos y se ...

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Discusión

En este artículo y vídeo se describe cómo realizar el cribado de fármacos de rendimiento medio mediante PDO. Este protocolo puede, con optimización, adoptarse para el cribado de organoides derivados de diferentes tipos de tejidos a los descritos aquí. Es importante determinar el período de tiempo de paso ideal antes de la criba, ya que variará para los cultivos de organoides individuales y dependerá del tipo de tejido. La densidad y el tamaño de los organoides sembrados por poc...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required equipment
384-well bioluminescence platereader; e.g. Tecan Spark 10M plate reader	Tecan
Brightfield microscope with large field of view lens (2.5x)
Digital dispenser; e.g. Tecan D300e	Tecan		Drug dispensing
6 MV photon beam irradiator	Elekta model Synergy, Elekta Sweden
Liquid handler with large nozzle (“standard tube”) cassettes;
e.g. Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Scientific
Plastic container with plate holder insert for radiotherapy	Home-made
Spark control method editor software
Standard tissue culturing equipment (LAF cabinet, incubator, centrifuge, waterbath, etc)
Required materials
1.5 mL plastic tubes
15- and 50-mL plastic tubes
5, 10- and 25-mL sterile plastic pipets
6-well cell culture plates
Black 384-well ultra-low-attachment clear-bottom plate; e.g.. Corning 384 flat black	Corning	4588
Breathe-Easy sealing membrane	Merck		pre-cut polyurethane medical-grade membrane with acrylic adhesive
Glasstic slide			10-chambered slide with hemocytometer grid
Multidrop Combi Reagent Dispenser standard tube dispensing cassette	Thermo Scientific
Plugged Pasteur’s pipet of which the tip has been tightened in a flame
Reversible 20/40/70/100 µm filters: PluriStrainer	Pluriselect	e.g. 43-50020-03
Sterile P1000, P200, P20 and P2 pipet tips and low-retention filter tips ( e.g. Sapphire tips)	Greiner	750266
T8 Plus and D4 Plus casettes	HP/Tecan
Required reagents
100 x Glutamax			L-glutamine substitute
1 M HEPES
30% (v/v) Tween-20 diluted in PBS
70% EtOH
Advanced-DMEM/F12	Thermo Scientific	12634-010
CellTiter-Glo 3D cell viability assay	Promega	G9681
Compounds to test screen, including Staurosporin or other positive control
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693
DMSO
ECM for CRC: growth-factor reduced Matrigel, phenol-free	Corning	356231
ECM for HNSCC PDOs: BME, Cultrex RGF Basement membrane extract, Type R1	R&D Systems	3433-005-R1
Expansion growth medium (specific for each organoid type)
Organoid growth factors (specific for each organoid type)
PBS
Pen/Strep (100 U/mL)
ROCK inhibitor: Y-27632	Abmole	M1817
TrypLE
Required Software Packages:
GraphPad Prism
Microsoft Excel