Cultivo microbiano automatizado y evolución adaptativa utilizando el sistema de cultivo de microgotas microbianas (MMC)

Resumen

Este protocolo describe cómo utilizar el sistema de cultivo microbiano de microgotas (MMC) para llevar a cabo el cultivo microbiano automatizado y la evolución adaptativa. MMC puede cultivar y subcultivar microorganismos de forma automática y continua y monitorear en línea su crecimiento con un rendimiento relativamente alto y una buena paralelización, reduciendo el consumo de mano de obra y reactivos.

Resumen

Los métodos convencionales de cultivo microbiano generalmente tienen operaciones engorrosas, bajo rendimiento, baja eficiencia y gran consumo de mano de obra y reactivos. Además, los métodos de cultivo de alto rendimiento basados en microplacas desarrollados en los últimos años tienen un estado de crecimiento microbiano deficiente y experimentan paralelización debido a su bajo oxígeno disuelto, mezcla deficiente y evaporación severa y efecto térmico. Debido a muchas ventajas de las microgotas, como el pequeño volumen, el alto rendimiento y la fuerte capacidad de control, la tecnología microfluídica basada en gotas puede superar estos problemas, que se ha utilizado en muchos tipos de investigación de cultivo microbiano de alto rendimiento, cribado y evolución. Sin embargo, la mayoría de los estudios previos permanecen en la etapa de construcción y aplicación del laboratorio. Algunos problemas clave, como los altos requisitos operativos, la alta dificultad de construcción y la falta de tecnología de integración automatizada, restringen la amplia aplicación de la tecnología microfluídica de gotas en la investigación microbiana. Aquí, se desarrolló con éxito un sistema automatizado de cultivo de microgotas microbianas (MMC) basado en tecnología microfluídica de gotas, logrando la integración de funciones como la inoculación, el cultivo, el monitoreo en línea, el subcultivo, la clasificación y el muestreo requeridos por el proceso de cultivo de gotas microbianas. En este protocolo, se tomaron como ejemplos escherichia coli (E. coli) MG1655 de tipo silvestre y una cepa de E. coli esencial de metanol (MeSV2.2) para introducir cómo usar el MMC para llevar a cabo el cultivo microbiano automatizado y de rendimiento relativamente alto y la evolución adaptativa en detalle. Este método es fácil de operar, consume menos mano de obra y reactivos, y tiene un alto rendimiento experimental y una buena paralelización de datos, lo que tiene grandes ventajas en comparación con los métodos de cultivo convencionales. Proporciona una plataforma experimental de bajo costo, fácil de operar y confiable para que los investigadores científicos realicen investigaciones microbianas relacionadas.

Introducción

El cultivo microbiano es una base importante para la investigación científica microbiológica y las aplicaciones industriales, que se utiliza ampliamente en el aislamiento, identificación, reconstrucción, cribado y evolución de microorganismos ^1,2,3. Los métodos convencionales de cultivo microbiano utilizan principalmente tubos de ensayo, matraces de agitación y placas sólidas como contenedores de cultivo, combinados con incubadoras de agitación, espectrofotómetros, lectores de microplacas y otros equipos para el cultivo, detección y detección microbiana. Sin embargo, estos métodos tienen muchos problemas, como operaciones engorrosas, bajo rendimiento, baja eficiencia y gran consumo de mano de obra y reactivos. Los métodos de cultivo de alto rendimiento desarrollados en los últimos años se basan principalmente en la microplaca. Pero la microplaca tiene un bajo nivel de oxígeno disuelto, una propiedad de mezcla deficiente y una evaporación severa y un efecto térmico, que a menudo conducen a un mal estado de crecimiento y paralelización experimental de microorganismos 4,5,6,7; por otro lado, necesita estar equipado con equipos costosos, como estaciones de trabajo de manipulación de líquidos y lectores de microplacas, para lograr el cultivo automatizado y la detección de procesos ^8,9.

Como una rama importante de la tecnología microfluídica, la microfluídica de gotas se ha desarrollado en los últimos años basada en sistemas microfluídicos tradicionales de flujo continuo. Es una tecnología microfluídica de flujo discreto que utiliza dos fases líquidas inmiscibles (generalmente aceite-agua) para generar microgotas dispersas y operar sobre ellas¹⁰. Debido a que las microgotas tienen las características de pequeño volumen, gran área de superficie específica, alta tasa de transferencia de masa interna y sin contaminación cruzada causada por la compartimentación, y las ventajas de una fuerte capacidad de control y alto rendimiento de las gotas, ha habido muchos tipos de investigación que aplican tecnología microfluídica de gotas en el cultivo de alto rendimiento, el cribado y la evolución de microorganismos¹¹ . Sin embargo, todavía hay una serie de cuestiones clave para hacer que la tecnología microfluídica de gotas se popularice y se aplique ampliamente. En primer lugar, el funcionamiento de la microfluídica de gotas es engorroso e intrincado, lo que resulta en altos requisitos técnicos para los operadores. En segundo lugar, la tecnología microfluídica de gotas combina componentes ópticos, mecánicos y eléctricos y debe asociarse con escenarios de aplicación de biotecnología. Es difícil para un solo laboratorio o equipo construir sistemas eficientes de control microfluídico de gotas si no hay una colaboración multidisciplinaria. En tercer lugar, debido al pequeño volumen de microgotas (desde el picolitro (pL) hasta el microlitro (μL)), se necesita mucha dificultad para realizar el control automatizado preciso y la detección en línea en tiempo real de gotas para algunas operaciones microbianas básicas, como el subcultivo, la clasificación y el muestreo, y también es difícil construir un sistema de equipo integrado¹².

Para abordar los problemas anteriores, se desarrolló con éxito un sistema automático de cultivo de microgotas microbianas (MMC) basado en la tecnología microfluídica de^{gotas 13}. El MMC consta de cuatro módulos funcionales: un módulo de reconocimiento de gotas, un módulo de detección de espectro de gotas, un módulo de chip microfluídico y un módulo de muestreo. A través de la integración y control del sistema de todos los módulos, se establece con precisión el sistema de operación automatizado que incluye la generación, cultivo, medición (densidad óptica (OD) y fluorescencia), división, fusión, clasificación de gotas, logrando la integración de funciones como inoculación, cultivo, monitoreo, subcultivo, clasificación y muestreo requeridos por el proceso de cultivo de gotas microbianas. MMC puede contener hasta 200 unidades de cultivo de gotas replicadas de 2-3 μL de volumen, lo que equivale a 200 unidades de cultivo de matraz de agitación. El sistema de cultivo de microgotas puede satisfacer los requisitos de no contaminación, oxígeno disuelto, mezcla e intercambio masa-energía durante el crecimiento de microorganismos, y satisfacer las diversas necesidades de la investigación microbiana a través de múltiples funciones integradas, por ejemplo, medición de la curva de crecimiento, evolución adaptativa, análisis multinivel de un solo factor e investigación y análisis de metabolitos (basados en la detección de fluorescencia)^13,14.

Aquí, el protocolo presenta cómo usar el MMC para llevar a cabo el cultivo automatizado y microbiano y la evolución adaptativa en detalle (Figura 1). Tomamos como ejemplo escherichia coli (E. coli) MG1655 de tipo silvestre para demostrar la medición de la curva de crecimiento y una cepa de E. coli esencial de metanol MeSV2.2¹⁵ para demostrar la evolución adaptativa en MMC. Se desarrolló un software de operación para MMC, lo que hace que la operación sea muy simple y clara. En todo el proceso, el usuario debe preparar la solución inicial de bacterias, establecer las condiciones del MMC y luego inyectar la solución de bacterias y los reactivos relacionados en el MMC. Posteriormente, el MMC realizará automáticamente operaciones como la generación de gotas, el reconocimiento y la numeración, el cultivo y la evolución adaptativa. También realizará la detección en línea (OD y fluorescencia) de las gotas con alta resolución de tiempo y mostrará los datos relacionados (que se pueden exportar) en el software. El operador puede detener el proceso de cultivo en cualquier momento de acuerdo con los resultados y extraer las gotas objetivo para experimentos posteriores. El MMC es fácil de operar, consume menos mano de obra y reactivos, y tiene un rendimiento experimental relativamente alto y una buena paralelismo de datos, lo que tiene ventajas significativas en comparación con los métodos de cultivo convencionales. Proporciona una plataforma experimental robusta, de bajo costo, fácil de operar para que los investigadores realicen investigaciones microbianas relacionadas.

Protocolo

1. Instalación de instrumentos y software

1. Elija un ambiente limpio y estéril (como un banco limpio) como un espacio permanente dedicado para MMC. Instale el MMC de forma constante en el espacio.
   NOTA: Mantenga el MMC alejado de la interferencia de campos eléctricos fuertes, campos magnéticos y fuentes de radiación de calor fuertes. Evite que las vibraciones severas afecten a los componentes de detección óptica. Proporcione la fuente de alimentación de AC220 V, 50 HZ al MMC. Para obtener más información sobre MMC, consulte la Tabla de materiales y el sitio web de MMC¹⁶.
2. Instale el software de operación desde el archivo MMC.zip
   Nota : póngase en contacto con los autores para el archivo MMC.zip.
   1. Cree una carpeta dedicada y guarde el archivo zip en ella.
   2. Cree otra carpeta dedicada como el "Directorio de instalación". Descomprima el MMC.zip y guarde los archivos en la nueva carpeta.
      NOTA: La configuración de la computadora es la mejor para cumplir: (1) Sistema operativo Windows 7 de 64 bits o superior; (2) CPU: i5 o superior; (3) memoria: 4 GB o más; (4) disco duro: 300 GB o más (velocidad de rotación superior a 7200 rpm o disco de estado sólido).

2. Preparativos

1. Conecte la aguja de la jeringa (el diámetro interior es de 0,41 mm y el diámetro exterior es de 0,71 mm), el conector rápido A y el frasco de reactivo (Figura 2C), y póngalos en autoclave a 121 °C durante 15 min.
   NOTA: Desenrosque ligeramente la tapa del frasco de reactivo durante la esterilización. Se pueden preparar algunas botellas de reactivos más cada vez para su uso.
2. Utilice un filtro de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de 0,22 μm para filtrar el aceite MMC. Coloque el chip microfluídico (Figura 2B) y el aceite MMC en el banco limpio con anticipación y esterilícelos por irradiación ultravioleta durante 30 minutos antes de su uso.
   NOTA: Para obtener los detalles del conector rápido A, la botella de reactivo, el aceite MMC y el chip microfluídico, consulte la Tabla de materiales.
3. Instalar el chip microfluídico
   1. Abra la puerta de la cámara de operación (Figura 2A) y levante la sonda de fibra óptica.
   2. Alinee los orificios del campo eléctrico con las agujas del campo eléctrico y coloque suavemente el chip en el pedestal del chip. A continuación, inserte las dos columnas de posicionamiento en los orificios de posicionamiento y coloque la sonda de fibra óptica (Figura 2D).
   3. Conecte el conector rápido A del chip al puerto correspondiente del MMC según el número de posición (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Luego cierre la puerta de la cámara de operación.
4. Reponga el aceite MMC (a unos 80 ml) en la botella de aceite y vacíe el líquido residual en la botella de desecho antes de usarlo.
   NOTA: El líquido residual suele ser un residuo orgánico. Consulte la ley y el reglamento regionales en el momento de la eliminación, sujetos a cambios basados en la configuración experimental.

3. Medición de la curva de crecimiento en MMC

1. Preparación para la solución bacteriana inicial
   1. Siga las regulaciones estándar relacionadas para preparar el medio Luria-Bertani (LB) y el autoclave a 121 ° C durante 15 min.
      NOTA: Componentes del medio LB: NaCl (10 g/L), extracto de levadura (5 g/L) y triptona (10 g/L).
   2. Saque la cepa de E. coli MG1655 de la cepa de glicerol y cultive en un matraz de agitación de 50 ml con 10 ml de LB medio en una incubadora de agitación (200 rpm) a 37 °C durante 5-8 h.
      NOTA: El tiempo de cultivo depende de las cepas específicas. Es óptimo cultivar la cepa hasta el período/fase logarítmica.
   3. Diluya la solución cultivada de E. coli MG1655 con medio fresco a un OD₆₀₀ de 0.05-0.1 para obtener una solución inicial de bacterias (prepare aproximadamente 10 ml).
2. Haga clic en Inicialización para inicializar el MMC. Después de que aparezca la interfaz de inicialización, establezca la temperatura de cultivo en 37 °C y el valor de la señal fotoeléctrica en 0,6 (Figura 3A). La inicialización tardará unos 20 minutos.
3. Encienda la lámpara UV (longitud de onda 254 nm) durante la inicialización.
4. Inyecte la solución inicial de bacterias y el aceite MMC en la botella de reactivo.
   1. Saque una botella de reactivo esterilizada en el banco limpio y apriete la tapa.
   2. Use una jeringa estéril de 10 ml para inyectar 3-5 ml de aceite MMC de la aguja de la jeringa del tubo lateral. Incline y gire la botella de reactivo lentamente para que el aceite se infiltre completamente en la pared interior.
   3. Inyecte aproximadamente 5 ml de solución inicial de bacterias y luego llene la botella de reactivo inyectando 5-7 ml de aceite nuevamente.
   4. Extraiga el conector rápido independiente A e inserte el conector rápido A del frasco de reactivo en su conector rápido B para completar la operación de inyección de muestra (Figura 4A).
5. Espere a que finalice la inicialización y, a continuación, apague la lámpara UV (longitud de onda 254 nm).
6. Abra la puerta de la cámara de operación y coloque la botella de reactivo en el baño de metal.
7. Extraiga el conector C2 del chip y el conector rápido A de la botella de reactivo. Conecte el conector de tubo lateral de la botella de reactivo al conector C2 y el conector de tubo superior al conector de O2. Luego cierre la puerta de la cámara de operación.
8. Haga clic en Curva de crecimiento para elegir la función de medición de la curva de crecimiento (Figura 3A). En la interfaz de configuración de parámetros, ingrese el Número como 15, encienda el interruptor de detección OD y establezca la Longitud de onda como 600 nm. Haga clic en Iniciar para iniciar la generación de gotas. Tardará unos 10 min.
   NOTA: Aquí, Número se refiere al número de gotas que se generarán. La longitud de onda se refiere a la longitud de onda del OD a detectar. Establezca el número (máximo 200) y la longitud de onda (350-800 nm) de acuerdo con los requisitos del experimento.
9. Cuando aparece una ventana emergente en la interfaz principal que indica "Retire la botella de reactivo entre C2 y O2, luego haga clic en el botón Aceptar después de la finalización", abra la puerta de la cámara de operación para sacar la botella de reactivo y conecte los conectores C2 y O2.
10. Cierre la puerta y haga clic en el botón Aceptar en la ventana emergente para cultivar automáticamente las gotas y detectar los valores de OD.
    NOTA: El MMC detecta el valor OD cuando la gota pasa por la sonda de fibra óptica. Por lo tanto, el período de detección depende del número de gotas generadas.
11. Cuando la curva de crecimiento alcance la fase estacionaria, haga clic en el botón Exportar datos para exportar los datos OD. Seleccione la ruta de guardado de datos y exporte el valor de OD registrado durante el período de cultivo en el formato .csv, que se puede abrir con el software adecuado (por ejemplo, Microsoft Excel). Luego use un software de mapeo (por ejemplo, EXCEL y Origin 9.0) para trazar la curva de crecimiento.
    NOTA: Durante el proceso de cultivo, es factible hacer clic en la Exportación de datos en cualquier momento para exportar los datos OD de todas las gotas actuales.

4. Evolución adaptativa en MMC

1. Preparación para la solución bacteriana inicial
   1. Siga las regulaciones estándar relacionadas para preparar el medio líquido especial y las placas sólidas para el MeSV2.2 y el autoclave a 121 ° C durante 15 min.
      NOTA: Para los componentes del medio especial, consulte la Tabla 1 y la Tabla de Materiales.
   2. Cultive el MeSV2.2 utilizando la placa sólida (diámetro = 90 mm) en una incubadora de temperatura constante de 37 °C durante 72 h. Luego elija una colonia independiente y cultive en un matraz de agitación de 50 ml con 10 ml del medio líquido especial en una incubadora de agitación (200 rpm) a 37 ° C durante 72 h.
   3. Diluya la solución de MeSV2.2 cultivada con el medio a un OD₆₀₀ de 0.1-0.2 (asegúrese de que el volumen total no sea inferior a 10 ml) y continúe cultivándola en el matraz de agitación durante 5 h para obtener la solución inicial de bacterias.
      NOTA: La MeSV2.2 es una cepa de E. coli esencial para el metanol. El medio líquido especial contiene 500 mmol / L de metanol, que es un fuerte estrés para MeSV2.2, lo que resulta en un crecimiento muy lento. Tenga en cuenta que la obtención de la solución inicial de bacterias aquí es diferente de la descrita en el paso 3.1.
2. Inicialice el MMC como se explica en los pasos 3.2, 3.3 y 3.5.
3. Saque dos botellas de reactivo esterilizadas, una de las cuales es para la solución inicial de bacterias y la otra es para el medio fresco. Inyecte la solución inicial de bacterias (5 ml), el medio fresco (12-15 ml) y el aceite MMC en los frascos de reactivos como se explica en el paso 3.4.
   NOTA: Como la evolución adaptativa es un proceso a largo plazo que involucra múltiples subcultivos, almacene la mayor cantidad posible de medio fresco en MMC. El medio no se puede reponer durante la ejecución del experimento.
4. Instale las dos botellas de reactivo en MMC como se explica en el paso 3.6. Instale el uno para la solución de bacterias inicial entre el conector C2 y O2 y el otro para el medio fresco entre el conector C4 y O4.
5. Haga clic en ALE para elegir la función de evolución adaptativa (Figura 3B). En la interfaz de configuración de parámetros, active el interruptor de detección de OD .
6. Establezca el número como 50, la longitud de onda como 600 nm, la concentración como 0%, el tipo como tiempo, el parámetro como 30 h y las repeticiones como 99. Haga clic en Iniciar para iniciar la generación de gotas. Tardará unos 25 min.
   NOTA: Aquí, "Concentración" se refiere a la concentración máxima de factores químicos para la evolución adaptativa. Para diferentes gotas, es realizable en MMC introducir diferentes concentraciones de factores químicos para proporcionar diferentes condiciones de crecimiento. Calcule las concentraciones introducidas utilizando la siguiente ecuación:
   
   Aquí "C" se refiere a la concentración de factores químicos introducidos en las gotas; "a" se refiere a la concentración de factores químicos en las botellas de reactivo entre el conector C4 y O4; "b" se refiere a la concentración de factores químicos en las botellas de reactivo entre el conector C6 y O6; y "i" se refiere a la concentración disponible. Hay ocho concentraciones disponibles en MMC. Dado que el factor químico aquí tiene una sola concentración (500 mmol / L de metanol) y es uno de los ingredientes del medio, solo se instala una botella de reactivo que contiene el factor químico aquí, y la concentración se establece como 0%. El tipo se refiere al modo de subcultivo, que se divide en tres tipos: modo de tiempo, modo de valor OD y modo de fluorescencia. El primero significa cultivar las gotas durante un tiempo fijo y luego subcultivar, mientras que los dos últimos significan cultivar las gotas a un valor OD predefinido / intensidad de fluorescencia y luego subcultivar. Parámetro se refiere al parámetro relacionado requerido al elegir un modo de subcultivo. Las repeticiones se refieren al número de subcultivos.
7. Retire el frasco de reactivo colocado entre el conector C2 y O2 como se explica en el paso 3.8.
8. Observe si los valores máximos de OD de las gotas durante cada período de subcultivo han aumentado significativamente. Si se produce el aumento y cumple con los requisitos del experimento, haga clic en el botón Exportar datos para exportar los datos de OD como se explica en el paso 3.9.
   NOTA: Aquí, el período de subcultivo depende del parámetro. Por ejemplo, al establecer Tipo como Tiempo y Parámetro como 30 h, el período de subcultivo es de 30 h. Durante cada período de subcultivo, hay los valores máximos de OD de las gotas. Estimar si la evolución adaptativa cumple con los requisitos del experimento mediante el aumento de los valores máximos de OD (el aumento depende del proceso de cultivo real de la cepa, por ejemplo, aumentado en más del 20%).
   PRECAUCIÓN: Preste atención a si el medio fresco almacenado está agotado. Si el aumento significativo no se ha producido incluso después de que se agote el medio, extraiga las gotas que crecen mejor y lleve a cabo una nueva ronda de evolución adaptativa.
9. Extraiga las gotas de destino del MMC.
   1. Haga clic en el botón Screening para elegir la función de extracción de gotas (Figura 3C). Elija la opción Recopilar , haga clic en el número de gotas de destino y luego haga clic en Aceptar.
      NOTA: El cribado de gotas incluye "Recolectar", "Descartar" y "Extraer solución de semillas". Por "solución de semilla de extracto" se entiende la recogida de las gotas restantes¹³ después de la operación de subcultivo.
   2. Espere a que la ventana emergente le indique: "Saque el conector rápido CF y colóquelo en el tubo EP". Coloque el conector rápido CF en el tubo de la microcentrífuga para su recolección de acuerdo con el mensaje del software y luego haga clic en Aceptar (Figura 4D).
   3. Después de 1-2 minutos, la interfaz del software aparecerá en una nueva ventana que le pedirá: "Vuelva a insertar el conector y haga clic en Aceptar si ha terminado". Luego, inserte el conector rápido CF de nuevo y haga clic en Aceptar para que MMC continúe ejecutándose (Figura 4D). Cuando la siguiente gota objetivo llegue al sitio de reconocimiento de gotas, repita 4.9.2-4.9.3 para recogerla.
      NOTA: Después de recolectar todas las gotas objetivo, el MMC continuará cultivando las gotas restantes. Si el cultivo no es necesario, haga clic en Detener para finalizar directamente la operación.
   4. Extraiga la gota con una pipeta de 2,5 μL, déjela caer sobre la placa de agarosa de 90 mm y extiéndala uniformemente con una varilla triangular de vidrio con una longitud lateral de 3 cm. Luego cultivarlo en una incubadora de temperatura constante de 37 °C durante 72 h.
   5. Elija 3-5 colonias independientes y cultive por separado en los matraces de agitación de 50 ml con 10 ml de medio fresco en una incubadora de agitación (200 rpm) a 37 ° C durante 48-72 h. Siga las regulaciones estándar relacionadas para almacenar la solución de bacterias cultivadas en el tubo de glicerol para experimentos posteriores.

5. Limpieza del MMC

1. Después de completar el experimento, haga clic en Detener para detener todas las operaciones. Luego haga clic en Limpiar para limpiar el chip y los tubos. Tardará unos 15 min.

Resultados

Este protocolo utiliza E. coli MG1655 y una cepa MeSV2.2 como ejemplos para demostrar el cultivo microbiano y la evolución adaptativa esencial del metanol con una estrategia automatizada y de rendimiento relativamente alto en MMC. La medición de la curva de crecimiento se utilizó principalmente para caracterizar el cultivo microbiano. La evolución adaptativa se llevó a cabo mediante el subcultivo continuo automatizado y la adición de una alta concentración de metanol como presión selectiva durante cada s...

Discusión

Este protocolo presenta cómo utilizar el sistema de cultivo microbiano de microgotas (MMC) para realizar el cultivo microbiano automatizado y la evolución adaptativa a largo plazo. MMC es un sistema de cultivo microbiano miniaturizado, automatizado y de alto rendimiento. En comparación con los métodos e instrumentos de cultivo microbianos convencionales de alto rendimiento, MMC tiene muchas ventajas, como un bajo consumo de mano de obra y reactivos, operación simple, detección en línea (OD y fluorescencia), recopi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm PVDF filter membrane	Merck Millipore Ltd.	SLGPR33RB	Sterilize the MMC oil
4 °C refrigerator	Haier	BCD-289BSW	For reagent storage
Agar	Becton, Dickinson and Company	214010	For solid plate preparation
CaCl2·2H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	20011160	Component of the special medium for MeSV2.2.
Clean bench	Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.	DL-CJ-INDII	For aseptic operation and UV sterilization
CoCl2·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10007216	Component of the special medium for MeSV2.2.
Computer	Lenovo	E450	Software installation and MMC control
Constant temperature incubator	Shanghai qixin scientific instrument co., LTD	LRH 250	For the microbial cultivation using solid medium
CuSO4·5H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10008218	Component of the special medium for MeSV2.2.
Electronic balance	OHAUS	AR 3130	For reagent weighing
EP tube	Thermo Fisher	1.5 mL	For droplet collection
FeCl3·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10011928	Component of the special medium for MeSV2.2.
Freezing Tube	Thermo Fisher	2.0 mL	For strain preservation
Gluconate	Sigma-Aldrich	S2054	Component of the special medium for MeSV2.2.
Glycerol	GENERAL-REAGENT	G66258A	For strain preservation
High-Pressure Steam Sterilization Pot	SANYO Electric	MLS3020	For autoclaved sterilization
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG)	Biotopped	420322	Component of the special medium for MeSV2.2.
Kanamycin sulfate	Solarbio	K8020	Component of the special medium for MeSV2.2.
KH2PO4	MACKLIN	P815661	Component of the special medium for MeSV2.2.
Methanol	MACKLIN	M813895	Component of the special medium for MeSV2.2.
MgSO4·7H2O	BIOBYING	1305715	Component of the special medium for MeSV2.2.
Microbial Microdroplet Culture System (MMC)	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-I	Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Microfluidic chip	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-ALE-OD	For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MMC oil	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-M/S-OD	The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	20026118	Component of the special medium for MeSV2.2.
NaCl	GENERAL-REAGENT	G81793J	Component of the LB medium
Na2HPO4·12H2O	GENERAL-REAGENT	G10267B	Component of the special medium for MeSV2.2.
NH4Cl	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10001518	Component of the special medium for MeSV2.2.
Petri dish	Corning Incorporated	90 mm	For the preparation of solid medium
Pipette	eppendorf	2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL	For liquid handling
Quick connector A	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	—	For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Reagent bottle	Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	MMC-PCB	Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Shake flask	Union-Biotech	50 mL	For microbial cultivation
Shaking incubator	Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd.	SKY-210 2B	For the microbial cultivation in shake flask
Streptomycin sulfate	Solarbio	S8290	Component of the special medium for MeSV2.2.
Syringe	JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD	10 mL	Draw liquid and inject it into the reagent bottle
Syringe needle	OUBEL Hardware Store	22G	Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.
Tryptone	Oxoid Ltd.	LP0042	Component of the LB medium
Ultra low temperature refrigerator	SANYO Ultra-low	MDF-U4086S	For strain preservation (-80 °C)
UV–Vis spectrophotometer	General Electric Company	Ultrospec 3100 pro	For the measurement of OD values
Vitamin B1	Solarbio	SV8080	Component of the special medium for MeSV2.2.
Yeast extract	Oxoid Ltd.	LP0021	Component of the LB medium
ZnSO4·7H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.	10024018	Component of the special medium for MeSV2.2.