Imágenes de adhesión molecular en laminación celular mediante ensayo de huella de adhesión

Resumen

Este protocolo presenta los procedimientos experimentales para realizar el ensayo de huella de adhesión para obtener imágenes de los eventos de adhesión durante la adhesión rápida de rodadura celular.

Resumen

La adhesión rodante, facilitada por interacciones mediadas por selectina, es una motilidad pasiva altamente dinámica en el reclutamiento de leucocitos en el sitio de la inflamación. Este fenómeno ocurre en las vénulas postcapilares, donde el flujo sanguíneo empuja a los leucocitos en un movimiento rodante sobre las células endoteliales. El laminado estable requiere un delicado equilibrio entre la formación de enlaces de adhesión y su disociación impulsada mecánicamente, lo que permite que la celda permanezca unida a la superficie mientras rueda en la dirección del flujo. A diferencia de otros procesos de adhesión que ocurren en entornos relativamente estáticos, la adhesión de rodadura es altamente dinámica ya que las células de rodadura viajan a través de miles de micras a decenas de micras por segundo. En consecuencia, los métodos de mecanobiología convencionales, como la microscopía de fuerza de tracción, no son adecuados para medir los eventos de adhesión individuales y las fuerzas moleculares asociadas debido a la corta escala de tiempo y la alta sensibilidad requerida. Aquí, describimos nuestra última implementación del ensayo de huella de adhesión para obtener imágenes de las interacciones P-selectina: PSGL-1 en la adhesión rodante a nivel molecular. Este método utiliza amarres de medición de tensión irreversibles basados en ADN para producir una historia permanente de eventos de adhesión molecular en forma de pistas de fluorescencia. Estas pistas se pueden visualizar de dos maneras: (1) uniendo miles de imágenes limitadas por difracción para producir un gran campo de visión, lo que permite la extracción de la huella de adhesión de cada célula rodante sobre miles de micras de longitud, (2) realizando DNA-PAINT para reconstruir imágenes de superresolución de las pistas de fluorescencia dentro de un pequeño campo de visión. En este estudio, el ensayo de huella de adhesión se utilizó para estudiar las células HL-60 rodando a diferentes tensiones de cizallamiento. Al hacerlo, pudimos obtener imágenes de la distribución espacial de la interacción P-selectina: PSGL-1 y obtener información sobre sus fuerzas moleculares a través de la intensidad de la fluorescencia. Por lo tanto, este método proporciona la base para la investigación cuantitativa de las diversas interacciones célula-superficie involucradas en la adhesión rodante a nivel molecular.

Introducción

La cascada de adhesión rodante describe cómo las células circulantes se atan y ruedan a lo largo de la pared de los vasos ^sanguíneos1. El laminado pasivo está mediado principalmente por selectinas, una clase importante de moléculas de adhesión celular (CAM)¹. Bajo el flujo de cizallamiento de la sangre, los leucocitos que expresan el ligando de glicoproteína P-selectina-1 (PSGL-1) forman enlaces altamente transitorios con P-selectina, que pueden expresarse en la superficie de las células endoteliales inflamadas. Este proceso es crítico para que los leucocitos migren a un sitio de ^{inflamación2}. Además, PSGL-1 es también un receptor mecanosensible capaz de desencadenar la etapa de adhesión firme posterior de la cascada de adhesión rodante tras su compromiso con P-selectina3.

Las mutaciones genéticas que afectan a la función CAM pueden afectar gravemente al sistema inmunitario, como en la rara enfermedad de deficiencia de adhesión leucocitaria (LAD), donde el mal funcionamiento de las moléculas de adhesión que median el rodar conduce a individuos gravemente inmunocomprometidos4,5,6. Además, se ha demostrado que las células tumorales circulantes migran siguiendo un proceso de rodadura similar, lo que lleva a metástasis7,8. Sin embargo, debido a que el laminado celular es rápido y dinámico, los métodos experimentales convencionales de mecanobiología no son adecuados para estudiar las interacciones moleculares durante el laminado celular. Si bien los métodos de manipulación de una sola célula y una sola molécula, como la microscopía de fuerza atómica y la pinza óptica, pudieron estudiar interacciones moleculares como la interacción dependiente de la fuerza de P-selectina con PSGL-1 a nivel de molécula ^única9, no son adecuados para investigar eventos de adhesión en vivo durante el rodaje celular. Además, la interacción caracterizada in vitro no puede responder directamente a la pregunta sobre la adhesión molecular in vivo. Por ejemplo, ¿qué rango de tensión molecular es biológicamente relevante cuando las células funcionan en su entorno nativo? Los métodos computacionales como la simulación de dinámica ^adhesiva10 o el modelo simple de estado ^{estacionario11} han capturado ciertos detalles moleculares y cómo influyen en el comportamiento de rodadura, pero dependen en gran medida de la precisión de los parámetros y suposiciones de modelado. Otras técnicas como la microscopía de fuerza de tracción pueden detectar fuerzas durante la migración celular, pero no proporcionan suficiente resolución espacial o información cuantitativa sobre la tensión molecular. Ninguna de estas técnicas puede proporcionar observaciones experimentales directas de la dinámica temporal, la distribución espacial y la heterogeneidad de magnitud de las fuerzas moleculares, que se relacionan directamente con la función y el comportamiento celular en su entorno nativo.

Por lo tanto, la implementación de un sensor de fuerza molecular capaz de medir con precisión las interacciones mediadas por selectina es crucial para mejorar nuestra comprensión de la adhesión rodante. Aquí, describimos el protocolo para el ensayo de huella de ^adhesión12 donde las perlas recubiertas de PSGL-1 se enrollan sobre una superficie presentando ataduras de medidor de tensión funcionalizadas con p-selectina (TGT)¹³. Estos TGT son sensores de fuerza irreversibles basados en ADN que dan como resultado una historia permanente de eventos de ruptura en forma de lectura de fluorescencia. Esto se logra a través de la ruptura del TGT (dsDNA) y luego el posterior etiquetado del TGT roto (ssDNA) con una hebra complementaria marcada fluorescentemente. Una de las principales ventajas de este sistema es su compatibilidad con imágenes de difracción limitada y de superresolución. La hebra complementaria marcada fluorescentemente puede estar unida permanentemente (>12 pb) para imágenes limitadas por difracción o enlazada transitoriamente (7-9 pb) para imágenes de superresolución a través de DNA PAINT. Este es un sistema ideal para estudiar la adherencia a la rodadura ya que los TGT se rompen durante el laminado activo, pero la lectura de fluorescencia se analiza después del laminado. Los dos métodos de imagen también proporcionan al usuario más libertad para investigar la adherencia rodante. Por lo general, las imágenes limitadas por difracción son útiles para extraer la fuerza de ruptura molecular a través de la intensidad de la ^{fluorescencia13}, mientras que las imágenes de superresolución permiten el análisis cuantitativo de la densidad del receptor. Con la capacidad de investigar estas propiedades de la adhesión rodante, este enfoque proporciona una plataforma prometedora para comprender el mecanismo de regulación de la fuerza en la adhesión molecular de las células rodantes bajo flujo de cizallamiento.

Protocolo

1. Etiquetado e hibridación de oligonucleótidos

1. Reducción de los enlaces disulfuro de proteína G
   1. Disolver 10 mg de Proteína G (ProtG) en 1 ml de agua ultrapura.
      NOTA: La proteína G aquí se modifica con un solo residuo de cisteína en el extremo C y una etiqueta de polihistidina N-terminal.
   2. Intercambio de búfer ≥20 μL de ProtG (10 mg/mL) en 1x PBS (pH 7.2) con una columna P6.
   3. Mida la concentración de proteína después del intercambio tampón.
      NOTA: Concentración típica de 7-8 mg/ml.
   4. Preparar 120 mM Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) disolviendo 3 mg de TCEP en 90 μL de 1x PBS (pH 7.2) seguido de 10 μL de 0.5 M EDTA.
      NOTA: El TCEP debe estar recién preparado.
   5. Añadir 4 μL de TCEP de 120 mM (480 nmol) a 20 μL de ProtG (4-5 nmol).
      NOTA: Apunte a una relación molar de ~ 100: 1 TCEP a proteína.
   6. Deje que la reacción continúe durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT).
   7. Elimine el exceso de TCEP del ProtG reducido con una columna P6 (búfer intercambiado en 1x PBS, pH 7.2).
   8. Mida la concentración del ProtG reducido con un espectrofotómetro UV/Vis y guarde los espectros.
      NOTA: Concentración típica de 3.5-4.5 mg/mL.
2. Reacción de ssDNA marcada con amina con Sulfo-SMCC
   1. Disolver el ssDNA marcado con aminas (amina-ssDNA) en agua libre de nucleasas a una concentración de 1 mM. Verifique la concentración de la hebra con un espectrofotómetro UV/Vis.
   2. Preparar 11,5 mM de solución de sulfo-SMCC (un reticulador hetero-bifuncional con éster de sulfo-NHS y maleimida) fresca disolviendo 2 mg de sulfo-SMCC en 400 μL de agua ultrapura y vórtice para mezclar.
   3. Añadir 6 μL del 1 mM de amina-ssDNA (6 nmol) a 5,2 μL de 11,5 mM de sulfo-SMCC (60 nmol) y 88,8 μL de 1x PBS (pH 7,2). Vórtice durante 5 s seguido de centrifugación a 8600 x g durante 3 min.
   4. Permita que la reacción continúe durante 30 minutos en RT.
   5. Eliminar el exceso de sulfo-SMCC del SMCC conjugado amina-ssDNA (mal-ssDNA) con una columna P6 (tampón intercambiado en 1x PBS, pH 7.2).
   6. Mida la concentración del mal-ssDNA con un espectrofotómetro UV/Vis y guarde los espectros.
      NOTA: Concentración típica de 35-45 μM.
3. Conjugación ProtG-ssDNA
   1. Añadir 21 μL de 4,5 mg/ml de ProtG reducido (3 nmol) al mal-ssDNA (~4-5 nmol).
      NOTA: Los volúmenes y las concentraciones aquí son valores típicos. Ajuste de acuerdo con la medición experimental individual. Siempre asegure una cantidad excesiva de mal-ssDNA sobre ProtG en una proporción de ~ 1.5: 1.
   2. Vórtice durante 5 s y permita que la reacción continúe durante 3 h en RT.
4. Purificación y caracterización de ProtG-ssDNA
   1. Purifique el ProtG-ssDNA conjugado a través de su aislamiento de etiqueta con perlas magnéticas de ácido níquel-nitrilotriacético (Ni-NTA).
   2. Elimine el exceso de imidazol (tampón de elución de Ni-NTA) del producto con una columna P6 (tampón intercambiado en 1x PBS, pH 7.2).
      NOTA: Este paso es esencial para cuantificar la conjugación, ya que el imidazol tiene una absorción significativa a 280 nm.
   3. Utilice un espectrofotómetro UV/Vis para registrar los espectros del producto ProtG-ssDNA, así como el tampón de elución Ni-NTA (1x).
      NOTA: La absorbancia típica de ProtG-ssDNA a 260 nm y 280 nm es de 0,8 y 0,6, respectivamente.
   4. Para determinar la eficiencia de conjugación y la relación entre ProtG y ssDNA, utilice el script MATLAB escrito a medida (Supplemental Coding File 1) para descomponer el espectro del producto final en función de los tres espectros recopilados previamente (ProtG, SMCC-strand, búfer de elución de cuentas de Ni-NTA).
      Nota : brevemente, el código funciona como se describe en los pasos 1.4.5-1.4.8. La concentración típica es de 4 μM de ProtG-ssDNA con ProtG y ssDNA en una relación molar de ~1:1 (Figura 2A).
   5. Introduzca ProtG, SMCC-strand, búfer de elución de perlas Ni-NTA y los espectros ProtG-ssDNA UV/Vis en el script matlab
   6. Realizar una minimización no lineal multidimensional sin restricciones para reconstruir los espectros ProtG-ssDNA a partir de los espectros de origen (espectros de búfer de elución de cuentas ProtG, SMCC-strand y Ni-NTA)
      NOTA: La función de minimización produce tres factores de transformación, uno para cada espectro de fuente.
   7. Reconstruir los espectros ProtG-ssDNA multiplicando los espectros por su factor correspondiente y combinando los espectros de fuente transformados.
   8. Multiplique la concentración inicial de la cadena ProtG y SMCC por los factores de transformación correspondientes para determinar las concentraciones de la cadena SMCC y ProtG en el producto ProtG-ssDNA.
   9. (OPCIONAL) Ejecute PAGE nativo de acuerdo con la Figura 2B para ayudar a garantizar que cada componente y paso funcione como se esperaba.
5. Hibridación TGT
   1. Hibridar ProtG-ssDNA (hebra superior) con hebra inferior biotinilada a una relación molar de 1.2:1 con concentraciones de 240 nM y 200 nM respectivamente en tampón T50M5 (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM _MgCl2) para hibridar la construcción completa de TGT. Deja hibridar en RT ≥1 h.

2. PEGilación superficial

1. Limpieza de superficies
   1. Limpie un matraz Erlenmeyer y dos frascos de tinción por cada 8 fundas. Llene cada recipiente con una solución de KOH de 1 M y sonice durante 1 h en RT. Lave bien cada recipiente con agua ultrapura y séquelo con _N2 o en un horno.
      NOTA: Llene el KOH hasta la parte superior para tocar la tapa, de modo que también se limpien.
   2. Enjuague bien cada funda con agua ultrapura y colóquelas en uno de los frascos de manchas limpias.
      NOTA: Asegúrese de que no estén pegados entre sí o a la pared de los frascos de tinción.
   3. En una campana extractora de humos, prepare recién una solución de piraña agregando 30 ml de peróxido de hidrógeno (30%) a 90 ml de ácido sulfúrico concentrado (95% -98%) en un vaso de precipitados de 250 ml.
      PRECAUCIÓN: El ácido sulfúrico concentrado es altamente corrosivo. Agregue el peróxido de hidrógeno muy lentamente al ácido sulfúrico y revuelva cuidadosamente para mezclar.
   4. Sumerja completamente las cubiertas en el frasco de tinción con la solución de piraña. Deje las fundas en piraña durante 30 minutos en la campana de humos.
      PRECAUCIÓN: Enfríe la solución de piraña a no más de 80 ° C antes de verterla para evitar que se agriete el frasco de manchas.
   5. Deseche la solución de piraña en un vaso de precipitados de 1000 ml y neutralice con el 1 M KOH de la limpieza de vidrios.
   6. (OPCIONAL) Repita la limpieza de pirañas (pasos 2.1.3-2.1.5) con una solución de piraña fresca.
   7. Enjuague las fundas con abundantes cantidades de agua ultrapura para eliminar toda la solución residual de piraña. Agite suavemente el frasco de tinción durante cada subida para facilitar la eliminación (se recomiendan 10 enjuagues).
   8. Enjuague las fundas con metanol 3 veces para eliminar el agua de la superficie de la funda y mantener las fundas sumergidas en metanol.
2. Silanización de superficies
   1. Prepare una solución de aminosilano al 1% mezclando a fondo 94 ml de metanol, 1 ml de aminosilano y 5 ml de ácido acético glacial en el matraz Erlenmeyer limpio y seco. Vierta en el segundo frasco de tinción limpia y ^seco14.
   2. Transfiera los cubrehojas sumergidos debajo de la solución de metanol al frasco de tinción que contiene una solución de aminosilano al 1% y mantenga el frasco cubierto.
      NOTA: No permita que las fundas se sequen mientras se transfieren a aminosilano para limitar la exposición de la superficie del vidrio al aire.
   3. Incubar el frasco de tinción que contiene fundas en aminosilano durante 1 h a 70 °C en un ^horno15.
   4. Deseche cuidadosamente la solución de aminosilano en un recipiente de desecho separado y enjuague las hojas de cubierta en el frasco de tinción con metanol 5 veces para eliminar la solución de aminosilano.
   5. Enjuague las hojas de cubierta en el frasco de tinción con agua ultrapura 5 veces y séquelas con _N2.
   6. Hornea las fundas secas en el frasco de tinción en un horno a 110 °C durante 20 min. Deje que las cubiertas se enfríen a RT, luego colóquelas en el bastidor PEGylation.
      NOTA: Cubra el frasco de tinción con una tapa durante el horneado para minimizar la deposición particular y química en la ^superficie15.
3. Preparación de la solución PEG
   1. Descongele PEG (polietilenglicol) y PEG-biotina a RT durante unos 30 min.
      NOTA: Este paso minimiza la condensación de humedad que puede degradar el éster del NHS en PEG.
   2. Haga tampón PEG agregando 84 mg de bicarbonato de sodio a 10 ml de agua ultrapura. Esta formulación debe proporcionar un tampón a pH 8.4.
   3. Para 8 cápsulas, cada una con un lado PEGilado con 20:1 PEG:PEG-biotina: mida 100 mg de PEG y 5 mg de PEG-biotina para agregar a 400 μL de tampón PEG. Vórtice la solución durante 30 s y centrífuga durante 1 min a la velocidad máxima (≥18000 x g).
      NOTA: Este paso es sensible al tiempo, ya que la hidrólisis de éster SVA NHS comienza inmediatamente y tiene una vida media de 34 min a pH 8.0, con una vida media más corta a pH 8.4.
4. Incubación de PEG y almacenamiento de coverslip
   1. Configure la cámara de humedad y coloque los cobertores en el interior.
   2. Agregue 90 μL de solución de PEG a una cubierta en la cámara de humedad y coloque una segunda cubierta sobre la solución de PEG utilizando pinzas de sujeción de la cubierta para extender uniformemente la solución de PEG.
   3. Asegúrese de que no haya burbujas en la solución que caigan sobre la cubierta. Baje un extremo de la segunda cubierta en la primera cubierta y deje caer lentamente el otro extremo para que no haya burbujas intercaladas entre las cubiertas.
      NOTA: Las burbujas harán que ciertas áreas estén mal PEGiladas.
   4. Repita hasta que todas las fundas tengan PEG (es decir, 8 fundas = 4 sándwiches de PEG). Incubar las soluciones peg durante la noche (~12 h) en RT en una cámara de humedad en la ^oscuridad16.
   5. Separe los pares de fundas y colóquelos en un frasco de tinción. Tenga en cuenta los lados PEGilados.
   6. Enjuague bien las fundas con agua ultrapura y séquelas con _N2.
      NOTA: Sostenga las cubiertas con pinzas y sople _N2 a través de la superficie hacia la pinza para evitar que los contaminantes se sequen en la superficie.
   7. Marque el lado no PEGylated con un punto en una esquina usando un marcador permanente o un bolígrafo de diamante.
   8. Coloque 2 hojas de cubierta PEGylated en tubos de correo con los lados PEGylated uno frente al otro para ayudar a identificar el lado PEGylated antes de su uso.
   9. Aspire el tubo durante 5 minutos y rellene con _N2. Selle el tubo con parafilm.
   10. Guarde las cubiertas PEGylated a -20 °C en los tubos de correo sellados durante un máximo de 6 meses.
       NOTA: Caliente los tubos de almacenamiento a RT antes del ensamblaje del chip. La condensación en las cubiertas durante el sellado causará fugas.

3. Preparación de la cámara de flujo

1. Montaje de chips
   1. Extienda finamente una pequeña cantidad de epoxi en ambos lados de cinta de doble cara con una cuchilla de afeitar.
      NOTA: Demasiado epoxi puede propagarse en el canal durante el montaje.
   2. Corte con láser la cinta recubierta de epoxi para crear 4 canales. Cree el chip de flujo intercalando la cinta epoxi entre una corredera de 4 orificios y una cubierta PEG (Figura 1A).
   3. Usando una punta de pipeta, aplique una presión suave a lo largo de los canales para crear un buen sello. Curar el epoxi durante ≥1 h.
      NOTA: No corte el vidrio para evitar deslizarse contra el epoxi.
2. Asamblea de cámara
   1. Alinee el chip de modo que la abertura de cada canal se coloque en los centros del adaptador (Figura 1A). Coloque dos espaciadores acrílicos transparentes en la parte superior del chip, aplique una presión firme en el medio del bloque y atornille dos tornillos de 4-40 en los extremos de cada espaciador.
      NOTA: No fuerce el tornillo ni presione demasiado fuerte sobre los espaciadores, o el chip puede agrietarse.
   2. En el otro lado del soporte, atornille las entradas en los orificios roscados. Controle la condición de sellado a través del bloque de acrílico transparente.
   3. A medida que el tubo hace contacto con la abertura del chip, selle la conexión girando suavemente el tubo en el sentido de las agujas del reloj.
      NOTA: Las entradas demasiado apretadas pueden causar obstrucción del flujo, mientras que los contactos sueltos causarán fugas.

4. Preparación de la superficie

NOTA: Consulte la Figura 1B para ver el flujo de trabajo general.

1. Agentes de bloqueo para evitar la unión inespecífica
   1. Utilice una pipeta para hacer fluir 200 μL de tampón de lavado (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM _MgCl2 y 2 mM _CaCl2, 0,05% Tween 20) en la cámara para comprobar si hay fugas. Si se forman burbujas en el canal, empuje agresivamente 200 μL adicionales para eliminar las burbujas.
      NOTA: Las burbujas de aire grandes que no se eliminan en este paso pueden desalojar y destruir la funcionalización de la superficie más adelante.
   2. Añadir 40 μL de BSA (1% p/v) a la cámara de flujo para evitar la unión inespecífica e incubar durante 10 min.
   3. Asegúrese de agregar suficiente volumen durante cada período de incubación para llenar las cámaras de flujo y formar gotas en las entradas y salidas. Ajuste los volúmenes de incubación en consecuencia y realice todas las incubaciones en una cámara de humedad.
   4. Añadir 40 μL de Tween 20 (5% v/v) a la cámara de flujo. Incubar durante 10 min para reducir aún más la unión inespecífica.
   5. (OPCIONAL) Compruebe la superficie para una pasivación adecuada haciendo fluir las perlas de poliestireno a través del canal. Añadir 40 μL de perlas de poliestireno recubiertas de ProtG (0,01% p/v) e imagen con un microscopio de campo oscuro con un objetivo 10x. Si las cuentas no se adhieren a la superficie, continúe con el siguiente paso.
   6. Lave el canal con 200 μL de tampón de lavado para eliminar todos los agentes de pasivación.
2. Funcionalización de la superficie de la cámara
   1. Añadir 40 μL de estreptavidina (100 μg/ml) a la cámara de flujo e incubar durante 20 min. Luego, lavar con 200 μL de tampón de lavado.
   2. Añadir 40 μL de ProtG-TGT hibridado (100 nM) a la cámara de flujo e incubar durante 20 min. Luego, lavar con un tampón de lavado de 200 μL.
   3. Agregue 40 μL de hebra superior ProtG-TGT (100 nM) durante 20 minutos para completar cualquier hebra inferior TGT no hibridada en la superficie. Lavar con 200 μL de tampón de lavado.
   4. Añadir 40 μL de P-selectina-Fc (10 μg/mL) a la cámara de flujo e incubar durante 60 min. Luego, lavar con 200 μL de tampón de lavado.
      NOTA: La duración de la incubación es crítica.

5. Experimento e imágenes

1. Configuración del sistema de flujo
   1. Llene una jeringa de vidrio de 5 ml con el tampón de laminación (HBSS con 2 mM _CaCl2, 2 mM _MgCl2, 10 mM HEPES, 0,1% BSA). Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la jeringa golpeando los lados de la jeringa para desalojar las burbujas y empujándolas hacia afuera a medida que flotan hacia la punta.
   2. Inserte una aguja estéril (26 G, 5/8 pulgadas de longitud) en un tubo de polietileno de ~200 mm (I.D: 0.38 mm; O.D: 1,09 mm) y conecte la aguja a la jeringa de vidrio.
      NOTA: Asegúrese de que no quepa aire en ninguna parte del conector de la aguja.
   3. Fije la jeringa en la bomba de la jeringa e incline la bomba de la jeringa de tal manera que el lado del émbolo esté elevado para evitar que las burbujas de aire entren en el canal. Inserte el extremo del tubo en la entrada de la cámara de flujo.
      NOTA: Asegúrese de que el contacto de líquido a líquido al realizar la conexión deposite gotas en las entradas y tenga gotas al final del tubo de la jeringa. Asegúrese de que no entren burbujas de aire en el canal permitiendo que se forme una pequeña gota en el extremo del tubo de la jeringa antes de insertarlo en la entrada.
   4. Inserte un extremo de otros 200 mm de la tubería de polietileno en la salida, y el otro extremo sumergido en un vaso de precipitados de desecho.
2. Configuración para el laminado de celdas
   1. Cultivar células HL-60 en matraces de cultivo ventilados de ^{25 cm2} en medios IMDM suplementados con suero fetal bovino al 20% y antibióticos al 1% a 37 °C con 5% de _CO2. Mantenga densidades celulares entre 1 x ^105-2 × ¹⁰⁶ células/ml.
   2. (OPCIONAL) Diferenciar las células HL-60 en un medio IMDM completo que contenga 1,25% de DMSO a una densidad inicial de 2 x ¹⁰⁵ células/ml. Incubar las células para que estén más activas durante 5-6 días.
   3. Tome una muestra (1-2 ml) de la suspensión celular y la centrífuga (200 x g, 3 min) para granular las células.
   4. Retire el medio y vuelva a suspender suavemente las células en 500 μL del tampón rodante. Repita el paso de lavado dos veces para eliminar los desechos celulares.
   5. Mide la densidad celular con un hemocitómetro. Resuspendir los gránulos celulares con tampón rodante a una densidad de 2 x ¹⁰⁵ celdas/ml.
   6. Desconecte cuidadosamente el tubo de las entradas/salidas y pipete 40 μL de la suspensión celular en la cámara de flujo. Vuelva a conectar el tubo como se describió anteriormente, asegúrese de que no se introduzcan burbujas en el canal de flujo.
   7. Comience el experimento de rodadura de celdas iniciando la bomba de jeringa a los caudales deseados.
      NOTA: La intensidad de las pistas fluorescentes depende de la tensión de cizallamiento, y la menor tensión de cizallamiento de velocidad celular / velocidad celular generalmente producirá pistas más tenues (Figura 4A). Evite la alta densidad de celdas en la superficie o la duración excesiva del laminado para garantizar pistas separables de una sola celda (Figura 4B, C).
   8. Use un microscopio de campo oscuro con un objetivo 10x para asegurarse de que se observe el balanceo celular.
   9. Una vez que se complete el experimento, retire las células del canal infundiendo el tampón rodante a 100 ml / h hasta que la superficie esté libre de células.
3. Imágenes de pistas locales por "DNA-based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography" (DNA-PAINT)
   1. Añadir 40 μL de hebra de dna-PAINT imager (500 pM) en el tampón DNA-PAINT (0,05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM _MgCl2, 1 mM EDTA) al canal.
   2. Realice microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) utilizando una lente de objetivo TIRF de inmersión en aceite 100x. Adquiera más de 40000 fotogramas con un tiempo de exposición de 25 ms por fotograma a una ganancia de multiplicación de electrones (EM) de 300 utilizando una cámara de dispositivo de carga acoplada multiplicadora de electrones (EMCCD).
   3. Utilice el paquete de software ^Picasso17 para localizar y renderizar las imágenes de superresolución (Figura 4D) siguiendo los pasos 5.3.4-5.3.5.
   4. Cargue la película DNA-PAINT en el programa Localize para determinar la localización de cada fluoróforo en cada fotograma.
      NOTA: Optimice la longitud del lado de la caja y los parámetros de gradiente neto mínimo hasta que solo se rastreen con precisión los fluoróforos. El parámetro De gradiente neto mínimo a menudo puede superar los 100000 para lograr un seguimiento óptimo. Ajuste: MLE, método gaussiano integrado produce el mejor resultado. Por último, si la película es demasiado larga, divídala en pilas de 10000 fotogramas para que el seguimiento de la vista previa en Localize funcione correctamente antes de recombinarlos en un archivo hdf5 final.
   5. A continuación, cargue el archivo hdf5 resultante en el programa Render para realizar la corrección de deriva y la representación.
      NOTA: Realice la corrección de deriva múltiple a través de Undrift by RCC para mejorar el resultado final.
4. Obtención de imágenes de pistas largas mediante etiquetado permanente
   1. Agregue la hebra de generador de imágenes permanente e incube durante 120 s en el búfer T50M5. Lave el canal infundiendo 200 μL de tampón de lavado.
   2. Grabe una imagen con el láser de excitación desactivado para obtener el ruido de fondo de la cámara. Imagen de un área grande en un patrón de cuadrícula mediante microscopía TIRF.
      NOTA: Se recomienda la superposición de marco sobre marco de ≥10% para costuras posteriores.
   3. Programe el microscopio para escanear sobre el área de 400 x 50 imágenes (20000 imágenes en total). Usando el programa FIJI, divida los datos sin procesar en archivos tiff individuales, cada uno con un máximo de 10000 imágenes.
   4. Acople todas las imágenes utilizando el perfil de iluminación (Figura 3A-C) siguiendo los pasos 5.4.5-5.4.7.
   5. Reste el ruido de la cámara de fondo de cada fotograma. Obtenga la proyección media de la pila (perfil de iluminación) de cada fotograma restado de fondo.
   6. Normalice el perfil de iluminación por su valor máximo. Divida cada fotograma restado de fondo por el perfil de iluminación normalizado.
   7. Vuelva a escalar los fotogramas corregidos al rango apropiado para la profundidad de bits correspondiente.
   8. Utilice ^MIST18 para coser las imágenes (Figura 3D, E).

Resultados

El protocolo anterior describe el procedimiento experimental del ensayo de huella de adhesión. El flujo de trabajo general del experimento se ilustra en la Figura 1, desde el conjunto de la cámara de flujo (Figura 1A) hasta la funcionalización de la superficie (Figura 1B) y los pasos de experimento e imagen (Figura 1C).

La Figura 2 es un resul...

Discusión

El ensayo de huella de adhesión permite la visualización de los eventos de adhesión molecular entre PSGL-1 y P-selectina durante la adhesión de rodadura celular. Este proceso se inicia mediante la captura mediada por P-selectina seguida de laminación bajo tensión de cizallamiento fluídico. Los problemas potenciales durante el experimento generalmente involucran un rodado celular deficiente o pistas fluorescentes faltantes, incluso cuando las células ruedan bien. Estos problemas a menudo son el resultado de contro...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-channel drill guide	Custom made		3D printed with ABS filament
4-holes slide	Custom made		Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.
Acetone	VWR	BDH1101-4LP
Acrylic spacer	Custom made		Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.
Aluminium chip holder	Custom made		Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.
Aminosilane	AlfaAesar	L14043	CAS 1760-24-3
Antibiotic/antimycotic solution	Cytiva HyClone	SV3007901	Pen/Strep/Fungiezone
Beads, ProtG coated polystyrene	Spherotech	PGP-60-5
Bovine serum albumin	VWR	332
Buffer, DNA PAINT			0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA
Buffer, T50M5			10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2
Buffer, Rolling			HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA
Buffer, Wash			10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20
Calcium chloride	VWR	BDH9224
Cell culture flasks	VWR	10062-868
Concentrated sulfuric acid	VWR	BDH3072-2.5LG	95-98%
Coverslip holding tweezers	Techni-Tool	758TW150
Diamond-coated drill bits	Abrasive technology	C5250510	0.75 mm diamond drill
DNA, amine-ssDNA (top strand)	IDT DNA	Custom oligo	CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/
DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)	IDT DNA	Custom oligo	/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG
DNA, imager strand for DNA-PAINT	IDT DNA	Custom oligo	GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/
DNA, imager strand for permanent labelling	IDT DNA	Custom oligo	CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/
Double-sided tape	Scotch	237	3/4 inch width, permanent double-sided tape
EDTA	Thermofisher	15575020	0.5 M EDTA, pH 8.0
Epoxy	Gorilla	42001	5 minute curing time
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	97068-085
GelGreen	Biotium	41005
Glacial acetic acid	VWR	BDH3094-2.5LG
Glass, Coverslips	Fisher Scientific	12-548-5P
Glass, Microscope slide	VWR	48300-026	75 mm x 25 mm x 1 mm
Glass, Staining jar	VWR	74830-150	Wheaton Staining Jar (900620)
Hanks' Balanced Salt solution (HBSS)	Lonza	04-315Q
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629-1EA
HL-60 cells	ATCC	CCL-240
Humidity chamber slide support	Custom made		3D printed with ABS filament
Hydrogen peroxide	VWR	BDH7690-1	30%
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
Inlets/outlets	Custom made		Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm  polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	Lonza	12-722F
Magnesium chloride	VWR	BDH9244
Magnetic Ni-NTA beads	Invitrogen	10103D
Mailer tubes	EMS	EMS71406-10
Methanol	VWR	BDH1135-4LP
Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns	Biorad	7326200	In SSC Buffer
PEG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000
PEG-biotin	Laysan Bio	Biotin-PEG-SVA-5000
Potassium hydroxide	VWR	470302-132
Protein, Protein G	Abcam	ab155724	N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine
Protein, P-selectin-Fc	R&D System	137-PS	Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF
Protein, Streptavidin	Cedarlane	CL1005-01-5MG
Pump Syringe	Harvard Apparatus	704801
Sodium bicarbonate	Ward’s Science	470302-444
Sodium chloride	VWR	97061-274
Sulfo-SMCC	Thermofisher	22322
Syringe	Hamilton	81520	Syringes with PTFE luer lock, 5 mL
Syringe needles	BD	305115	Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length
TCEP	Sigma-Aldrich	C4706-2G
Tris	VWR	BDH4502-500GP
Tubing, Adaptor	Tygon	ABW00001	Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32”
Tubing, Polyethylene	BD Intramedic	427406	Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm
Tween-20	Sigma-Aldrich	93773