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Resumen

El protocolo presenta los procedimientos generales en el laboratorio requeridos en las pruebas genéticas preimplantacionales para la aneuploidía en una plataforma de secuenciación de próxima generación basada en semiconductores. Aquí presentamos los pasos detallados de la amplificación del genoma completo, la selección de fragmentos de ADN, la construcción de bibliotecas, la preparación de plantillas y el flujo de trabajo de secuenciación con resultados representativos.

Resumen

La secuenciación de próxima generación ha ganado cada vez más importancia en la aplicación clínica en la determinación de variantes genéticas. En la prueba genética preimplantacional, esta técnica tiene sus ventajas únicas en escalabilidad, rendimiento y costo. Para la prueba genética preimplantacional para el análisis de aneuploidías, el sistema de secuenciación de próxima generación (NGS) basado en semiconductores presentado aquí proporciona un enfoque integral para determinar variantes genéticas estructurales a una resolución mínima de 8 Mb. Desde la adquisición de la muestra hasta el informe final, el proceso de trabajo requiere múltiples pasos con un estricto cumplimiento de los protocolos. Dado que varios pasos críticos podrían determinar el resultado de la amplificación, la calidad de la biblioteca, la cobertura de las lecturas y la salida de datos, la información descriptiva con demostración visual distinta de las palabras podría ofrecer más detalles a la operación y manipulación, lo que puede tener un gran impacto en los resultados de todos los pasos críticos. Los métodos presentados en este documento mostrarán los procedimientos involucrados en la amplificación del genoma completo (WGA) de las células de trofoectodermo (TE) biopsiadas, la construcción de bibliotecas genómicas, la gestión del secuenciador y, finalmente, la generación de informes de variantes de número de copias.

Introducción

La aneuploidía es la anomalía en el número de cromosomas por la presencia de uno o más cromosomas adicionales o la ausencia de uno o más cromosomas. Los embriones que portan algún tipo de aneuploidía, como la pérdida de un cromosoma X (síndrome de Turner), copias adicionales de autosomas, como trisomías del autosoma 21 (síndrome de Down), 13 (síndrome de Patau) y 18 (síndrome de Edwards), o cromosomas sexuales adicionales como 47, XXY (síndrome de Klinefelter) y 47, XXX (síndrome de Triple X), pueden sobrevivir a término con defectos de nacimiento1. La aneuploidía es la causa principal de abortos espontáneos en el primer trimestre y fracaso de la fertilización in vitro (FIV)2. Se relata que la tasa de aneuploidías podría oscilar entre el 25,4%-84,5% a través de las diferentes capas de edad del ciclo natural y el grupo control medicado en la práctica de FIV3.

La tecnología de secuenciación de próxima generación se está aplicando enormemente en la determinación clínica de la información genética; Proporciona acceso práctico a la secuencia del genoma con eficiencia y alto rendimiento. En particular, la secuenciación de próxima generación también revolucionó el diagnóstico de trastornos con factores genéticos y pruebas de anormalidad en el genoma4. Utilizando la tecnología de secuenciación de semiconductores para transferir directamente señales químicas en la secuenciación de biorreacción a datos digitales, el sistema de secuencia basado en semiconductores proporciona una detección directa en tiempo real para secuenciar datos en 3-7 h 5,6.

En un procedimiento de FIV, la prueba genética preimplantacional (PGT) investiga el perfil genético del embrión antes de ser transferido al útero para mejorar el resultado de la FIV y reducir el riesgo de trastornos genéticos en los recién nacidos 1,7. En PGT combinado con técnicas NGS, el material genético extraído de menos de 10 células se amplifica con kits de amplificación del genoma completo o un reactivo de amplificación del genoma completo desarrollado independientemente. Esto requiere solo un paso en la fase de amplificación y no requiere preamplificación, para obtener productos de amplificación del genoma completo. Los cebadores o paneles para la variante del número de copias y la secuenciación especial de loci de genes se diseñan y aplican en la biblioteca construida.

Un flujo de trabajo típico de pruebas genéticas preimplantacionales-aneuploidías (PGT-A) en NGS implica procedimientos en serie, y requiere una intensa carga de trabajo del personal de laboratorio8. Algunas malas operaciones causadas por la reversión del procedimiento pueden conducir a una pérdida no deseada de tiempo y recursos del laboratorio. Un procedimiento operativo estándar (POE) conciso y claro para el flujo de trabajo PGS-NGS es útil; Sin embargo, los protocolos de formato de palabra no pueden presentar información más detallada sobre el procesamiento de muestras, la manipulación de dispositivos y la configuración de los instrumentos, que se pueden visualizar en un protocolo de video. En este artículo, un flujo de trabajo validado combinado con una demostración visualizada de detalles operativos podría ofrecer protocolos de referencia más directos e intuitivos en la práctica de PGT en una plataforma de secuenciación de semiconductores.

El protocolo aquí describe un método que admite la agrupación por lotes de hasta 16 biopsias de embriones en paralelo. Para lotes más grandes, se recomienda utilizar un protocolo comercial basado en kits para la secuenciación de semiconductores, como Reproes-PGS.

Protocolo

Todos los protocolos y la biopsia del trofoectodermo (TE) (sección 1.1.1.1) aplicados en este estudio fueron revisados y aprobados por el comité de ética de investigación humana del hospital No. 924 el 18 de septiembre de 2017 (NO: PLA924-2017-59). Los pacientes/participantes dieron su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio.

1. Aislamiento de ADN a partir de biopsia de embrión humano y amplificación genómica completa

  1. Protocolo para la amplificación del genoma completo 9,10
    NOTA: Pico PLEX WGA Kit se utiliza para realizar la amplificación del genoma completo.
    1. Recolección y almacenamiento de muestras
      1. Biopsia de trofoectodermo: extraiga un promedio de seis a nueve células de TE herniada de embrión D5/6 después de la eclosión asistida para obtener una cantidad calificada de ADN para la siguiente amplificación.
      2. Transfiera las células de muestra a un tubo de PCR en 5 μL de PBS.
      3. Congelar inmediatamente las muestras a -80 °C si el protocolo no procede directamente a la extracción de ADN.
    2. Lisis celular
      NOTA: El Archivo Suplementario 1 enumera y sirve como referencia para los volúmenes recomendados de cada componente al preparar la mezcla maestra durante la lisis celular y la amplificación del genoma completo de lotes de 1, 8, 16 y 32 muestras (con excedente para acomodar errores de pipeteo). Al formular otras mezclas maestras de este protocolo, el volumen de cada componente se incrementa adicionalmente para acomodar el consumo de componentes causado por el pipeteo repetido. Toda la centrifugación breve se realiza en una mini centrífuga de mesa durante 2-10 s a temperatura ambiente (RT), con un RPM fijo de 10.000 con una fuerza centrífuga de 5.300 x g. La fuerza centrífuga debe estar entre 2.000 x g y 12.000 x g.
      1. Preparar la mezcla de lisis celular con 4,8 μL del tampón de dilución de la enzima de extracción y 0,2 μL de la enzima de extracción celular por muestra.
      2. Pipetear 5 μL de la lisis celular recién preparada mezclar en cada muestra de 5 μL de células en tubos de PCR, y centrifugar brevemente el tubo a RT durante 5 s. No haga un vórtice del tubo.
      3. Incubar la muestra en un termociclador de la siguiente manera: 75 °C, 10 min; 95 °C, 4 min; 25 °C, 14 min. Centrifugar brevemente (5 s) el tubo después de la incubación.
    3. Preamplificación de todo el ADN del genoma
      1. Preparar la mezcla de preamplificación con 4,8 μL del tampón de preamplificación y 0,2 μL de la enzima de preamplificación por muestra.
      2. Pipetear 5 μL de la mezcla de preamplificación en los tubos de muestra a través de las paredes del tubo, y centrifugar brevemente durante 3 s. Evite que la punta llegue al fondo del tubo y no haga vibrar el tubo.
      3. Incubar la muestra de acuerdo con el programa termociclador mencionado en la Tabla 1.
    4. Amplificación del genoma completo del ADN
      1. Centrifugar brevemente la muestra durante 5 s y colocar el producto de incubación del preamplificador en hielo.
      2. Prepare la mezcla de amplificación del genoma completo con 25 μL del tampón de amplificación, 0,8 μL de la enzima de amplificación y 34,2 μL de agua libre de nucleasa por muestra.
      3. Mezclar 60 μL de la mezcla de amplificación del genoma completo recién preparada con los 15 μL del producto de incubación de preamplificación; el volumen total debe ser de 75 μL. Centrifugar brevemente durante 5 s. Evite que la punta llegue al fondo del tubo y no haga vibrar el tubo.
      4. Coloque el tubo de PCR en el termociclador y ejecute el programa del termociclador mencionado en la Tabla 2.
      5. Centrifugar los tubos brevemente durante 5 s y transferir los productos a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml.
      6. Cuantificar la concentración del producto WGA con un fluorómetro11. Las muestras pueden almacenarse temporalmente a -20 ° C durante menos de 2 meses si no se procede al siguiente paso.
  2. Protocolo de los reactivos WGA desarrollados independientemente.
    1. Recolección y almacenamiento de muestras
      1. Extraer las células del embrión D5/6 después de la eclosión asistida para la siguiente amplificación.
      2. Transfiera las células de muestra con 1,5 μL de PBS a un tubo de PCR que contenga 2 μL de PBS.
        NOTA: PBS está libre de Mg 2+ y Ca2+.
      3. Congelar las muestras inmediatamente a -80 °C si no se procede directamente al protocolo de extracción de ADN.
    2. Lisis celular
      1. Derrita el tampón de lisis celular (40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM etilenglicol ácido tetraacético (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM pirofosfato de sodio, 2 mM β-glicerofosfato, 0,1% SDS) en RT y colóquelo en el hielo. Añadir 2 μL de tampón de lisis celular a cada muestra y centrifugar brevemente (5 s).
        NOTA: No mueva el tubo y evite que la punta de la pipeta toque la superficie del líquido en el tubo para evitar sacar células o ADN del sistema de reacción.
      2. Incubar la muestra en un termociclador de la siguiente manera: 55 °C, 20 min; 95 °C, 10 min; 4 °C, mantener. Centrifugar brevemente el tubo a RT durante 10 s después de la incubación.
    3. Amplificación del genoma completo del ADN
      1. Centrifugar brevemente el producto de lisis celular durante 5 s y colocarlo en hielo.
      2. Preparar la mezcla de amplificación del genoma completo para cada muestra mezclando con 16 μL de solución premezclada de amplificación, 1 μL de enzima de amplificación y 28 μL de agua libre de nucleasas. Mezclar suavemente, centrifugar brevemente (5 s), y colocar la mezcla en hielo. No haga un vórtice del tubo.
      3. pipetear 45 μL de la mezcla de amplificación del genoma completo recién preparada en el producto de lisis celular preparado en la etapa 1.2.2.2; Mezclar suavemente y centrifugar brevemente durante 5 s.
        NOTA: No mueva el tubo y evite que la punta de la pipeta toque el líquido en el tubo.
      4. Coloque el tubo de PCR en el termociclador y ejecute el programa como se detalla en la Tabla 3.
      5. Centrifugar los tubos brevemente durante 5 s y transferir los productos a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml.
      6. Cuantifique la concentración del producto WGA con un fluorómetro11 y registre los resultados en la hoja de QA (análisis de calidad). Los productos con concentraciones calificadas pueden almacenarse temporalmente a -20 °C durante menos de 2 meses si no se procede al siguiente paso.

2. Selección del fragmento de amplificación

NOTA: Los materiales utilizados en esta sección están disponibles en el Kit de preparación de la biblioteca (Tabla de materiales).

  1. Preparación antes de empezar
    1. Equilibrar las perlas magnéticas (n x 100 μL) para la purificación a RT durante 30 min.
    2. Restaure el producto WGA anterior a RT. Vórtice el producto en RT durante 30 s antes de centrifugarlo brevemente.
    3. Preparar etanol fresco al 70%.
  2. Procedimiento de selección de fragmentos
    1. Pipetear 25 μL de los productos WGA y transferir a un tubo de centrífuga de 1,5 ml con 25 μL de agua libre de nucleasa precargada.
    2. Vortex y mezclar bien las perlas de purificación de ADN. Alícuota 50 μL de ella en cada tubo de muestra (muestra original: perlas (volumen) = 1:1), vórtice y centrífuga brevemente (5 s). Ajuste el tubo durante 5 minutos a RT para el proceso de unión al ADN.
    3. Inserte el tubo de centrífuga de 1,5 ml en un estante magnético y espere hasta que todas las perlas magnéticas sean atraídas a la pared lateral del tubo. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml. Evite pipetear las cuentas.
    4. Según el volumen de muestra original, pipetear 30 μL (muestra original: perlas (volumen) = 1:0,6) de perlas magnéticas, vórtice y centrífuga brevemente (5 s). Ajuste el tubo durante 5 minutos a RT para el proceso de unión al ADN.
    5. Inserte los tubos de centrífuga de 1,5 ml en el estante magnético y espere 5 minutos hasta que todas las perlas magnéticas sean atraídas a la pared lateral del tubo. Retire y deseche con cuidado el sobrenadante. Evite pipetear las cuentas.
    6. Pipetear 300 μL de etanol al 70% en el tubo de centrífuga de 1,5 ml, girar suavemente el tubo dos veces con un ángulo de 180° y mover las perlas a lo largo de la pared del tubo para un lavado completo. Pipetear y desechar el sobrenadante. Evite pipetear las cuentas.
    7. Repita el procedimiento de lavado una vez.
    8. Retire el tubo de centrífuga de 1,5 ml del bastidor de imanes y centrífugo brevemente (5 s). Inserte los tubos de nuevo en el estante del imán y espere hasta que todas las perlas magnéticas sean atraídas a la pared lateral del tubo.
    9. Pipetea cuidadosamente el líquido restante en la parte inferior. Mantenga el tubo abierto para secar las perlas en RT durante 3-5 min. Mantenga la humedad fuera de las perlas.
      NOTA: Cierre la tapa inmediatamente si surgen grietas en la bolita de cuentas.
    10. Retire los tubos de la rejilla magnética, pipete 25-30 μL del tampón de elución de ADN en un tubo y cierre la tapa y el vórtice. Centrifugar brevemente (5 s) para llevar el líquido turbio al fondo del tubo, y ajustar el tubo en RT durante 5 min.
    11. Inserte los tubos de nuevo en los bastidores magnéticos, y espere hasta que todas las perlas sean atraídas por la pared lateral del tubo y el sobrenadante se vuelva transparente. Transfiera cuidadosamente la solución de ADN a nuevos tubos de centrífuga de 1,5 ml. Evite pipetear las cuentas.
    12. Cuantifique la concentración de ADN después de la selección del fragmento con un fluorómetro11, guárdelo a -20 ° C. Típicamente, la concentración del fragmento de ADN seleccionado oscila entre 1.5-2.4 ng/μL.

3. Preparación de la biblioteca de ADN12

NOTA: Los materiales utilizados en esta sección están disponibles en el Kit de preparación de la biblioteca (Tabla de materiales).

  1. Finalizar la reparación
    1. Equilibre las perlas magnéticas a RT durante 30 min.
    2. Equilibrar el producto de ADN de la selección de fragmentos en el paso 2.2.12 a RT. Compruebe y registre la etiqueta en cada vial que contenga el ADN.
    3. Prepare el sistema de reparación final de ADN con 30 μL de productos de ADN, 10 μL de tampón de reparación final, 0.5 μL de enzima reparadora de extremo y 9.5 μL de agua libre de nucleasas en un tubo de centrífuga de 1.5 ml. Vortex el tubo durante 30 s y centrifugar brevemente (5 s) en RT para que todo el líquido llegue al fondo del tubo.
    4. Incubar a 25 °C durante 30 min, y centrifugar brevemente (5 s) el tubo después de la incubación.
    5. Vórtice o mezcla inversa de las perlas magnéticas y transfiera 75 μL de las perlas magnéticas a un tubo que contenga muestras de ADN reparadas en el extremo (muestra original: perlas (volumen) = 1:1.5). Pipetear o vorátice suavemente para mezclar bien las perlas y centrifugar brevemente (5 s) para hacer girar toda la suspensión hasta el fondo del tubo. Ajuste el tubo durante 5 minutos a RT para el proceso de unión al ADN. Voltee los tubos suavemente para mantener las perlas dispersas.
    6. Inserte los tubos de la centrífuga en el estante del imán y espere 5 minutos hasta que todas las perlas magnéticas sean atraídas por la pared lateral y el sobrenadante se vuelva transparente. Retire el sobrenadante y evite pipetear las perlas, manteniendo los tubos en la rejilla al pipetear.
    7. Transfiera 300 μL del etanol al 70% recién preparado a los tubos, gire suavemente los tubos dos veces en un ángulo de 180 ° y mueva las perlas a lo largo de la pared del tubo para un lavado completo. Pipetear y desechar el sobrenadante. Evite pipetear las cuentas.
    8. Repita el procedimiento de lavado una vez.
    9. Retire los tubos de centrífuga de 1,5 ml del bastidor de imanes y centrifugar brevemente (5 s). Inserte los tubos de nuevo en la rejilla magnética y espere 5 minutos hasta que todas las perlas magnéticas sean atraídas a la pared lateral del tubo.
    10. Pipetea cuidadosamente el líquido restante en el fondo. Abra la tapa de los tubos de centrífuga de 1,5 ml y seque las perlas a RT durante 3-5 min. Mantenga la humedad fuera de las perlas.
      NOTA: Cierre la tapa inmediatamente si surgen grietas en la bolita de cuentas.
    11. Pipetear 33 μL de tampón de elución de ADN en un tubo, cerrar la tapa y vórtice. Centrifugar brevemente (5 s) para llevar la suspensión turbia al fondo del tubo y ajustar el tubo a RT durante 5 min.
    12. Inserte los tubos de nuevo en los bastidores magnéticos, y espere hasta que todas las perlas sean atraídas a la pared lateral y la solución se vuelva transparente. Transfiera cuidadosamente la solución de ADN a nuevos tubos de centrífuga de 1,5 ml con la etiqueta adecuada, evitando pipetear las perlas.
  2. Ligadura de código de barras
    1. Coloque los reactivos de ligadura de códigos de barras en el paso 3.2.2 sobre hielo para derretir todos los reactivos congelados.
    2. Prepare el sistema de ligadura con 32 μL de productos de ADN reparados al final, 10 μL de agua libre de nucleasa, 5 μL de tampón ligasa, 1 μL de ligasa y 1 μL de P1 en un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Pipetear 1 μL de cada reactivo de código de barras en la mezcla de solución en el tubo para una muestra, vórtice durante 5 s y centrifugar brevemente (5 s) para obtener todo el líquido en el fondo del tubo.
      NOTA: Al agregar los códigos de barras, confirme que el número de códigos de barras y muestras corresponden; abrir solo un vial de código de barras a la vez para evitar la contaminación mixta de los códigos de barras; Cambie los guantes por cada cinco o seis códigos de barras agregados.
    3. Incubar los tubos a 25 °C durante 30 min.
    4. Pipetear 75 μL (muestra original: perlas (volumen) = 1:1.5) de las perlas magnéticas en un tubo, y pipetear o vórtice suavemente para mezclar bien las perlas. Centrifugar brevemente (5 s) para girar toda la suspensión hacia abajo, evitando la agregación de cuentas. Ajuste el tubo durante 5 minutos a RT para el proceso de unión al ADN. Voltee suavemente los tubos para mantener las perlas dispersas.
    5. Inserte los tubos de la centrífuga en el estante del imán y espere 5 minutos hasta que todas las perlas magnéticas sean atraídas a la pared lateral y el sobrenadante se vuelva transparente. Retire el sobrenadante y evite pipetear las perlas, manteniendo los tubos en la rejilla al pipetear.
    6. Transfiera 300 μL del etanol al 70% recién preparado en tubos, gire suavemente los tubos dos veces en un ángulo de 180 ° y mueva las perlas a lo largo de la pared del tubo para un lavado completo. Pipetear y desechar el sobrenadante. Evite pipetear las cuentas.
    7. Repita el procedimiento de lavado una vez.
    8. Retire los tubos de centrífuga de 1,5 ml del bastidor de imanes y centrífugo brevemente (5 s). Inserte los tubos de nuevo en el estante de imanes y espere 5 minutos hasta que todas las perlas magnéticas sean atraídas por la pared lateral del tubo. Pipetea cuidadosamente el sobrenadante restante en la parte inferior.
    9. Mantenga la tapa del tubo abierta para secar las perlas en RT durante 3-5 min. Mantenga la humedad fuera de las perlas.
      NOTA: Cierre la tapa inmediatamente si surgen grietas en la bolita de cuentas.
    10. Pipetear 15 μL del tampón de elución del ADN en el tubo. Enjuague la bolita de las perlas hasta el fondo del tubo, selle la tapa y el vórtice. Centrifugar brevemente (5 s) para llevar la suspensión turbia al fondo del tubo y mantener el tubo estable a RT durante 5 min.
  3. Amplificación de fragmentos
    1. Coloque los reactivos del edificio de la biblioteca en hielo cuando el reactivo congelado se disuelva.
    2. Transfiera 47.5 μL de la mezcla enzimática y 2.5 μL de la mezcla de cebador al tubo que contiene ADN eluydo y perlas, vórtice durante 5 s y centrifugar brevemente (5 s) para obtener todo el líquido al fondo del tubo.
    3. Ajuste el tubo en RT durante 5 min. Inserte los tubos de nuevo en bastidores magnéticos, y espere hasta que todas las cuentas sean atraídas a la pared lateral y el sobrenadante se vuelva transparente. Transfiera cuidadosamente la solución de ADN a tubos de PCR de 0,2 ml con etiquetas marcadas claramente y evite pipetear las perlas.
    4. Incubar la muestra en un conjunto termociclador con el siguiente programa: 72°C, 20 min; 98 °C, 2 min; 98 °C, 15 s; 62 °C, 15 s; 70 °C, 1 min (6 ciclos); 70 °C, 5 min. Centrifugar brevemente (5 s) el tubo cuando finalice la reacción y almacenar los productos a 4 °C.
    5. Transfiera los productos de PCR a un tubo de centrífuga de 1,5 ml (inmovilización baja). Añadir 97,5 μL (volumen de muestra original: perlas (volumen) = 1:1,5) de perlas magnéticas en el tubo cuando termine la reacción, pipetear o vórtice suavemente para mezclar bien las perlas, y centrifugar brevemente (5 s) para hacer girar todo el líquido hasta el fondo. Evite la agregación de cuentas. Ajuste el tubo en RT durante 5 min. Voltee suavemente los tubos para mantener las perlas dispersas.
    6. Inserte los tubos de la centrífuga en el estante del imán y espere 5 minutos hasta que todas las perlas magnéticas sean atraídas por la pared lateral y el sobrenadante se vuelva transparente. Retire el sobrenadante, evite pipetear las perlas y mantenga los tubos firmes en la rejilla.
    7. Transfiera 300 μL del etanol al 70% recién preparado en tubos, gire suavemente los tubos dos veces en un ángulo de 180 ° y mueva las perlas a lo largo de la pared del tubo para un lavado completo. Pipetear y desechar el sobrenadante. Evite pipetear las cuentas.
    8. Repita el procedimiento de lavado una vez.
    9. Retire el tubo de centrífuga de 1,5 ml del bastidor de imanes y centrífugo brevemente (5 s). Inserte el tubo de nuevo en el estante del imán y espere 5 minutos hasta que todas las perlas magnéticas sean atraídas a la pared lateral del tubo. Pipetea cuidadosamente el líquido restante en el fondo.
    10. Mantenga la tapa del tubo abierta para secar las perlas en RT durante 3-5 min. Mantenga la humedad fuera de las perlas.
      NOTA: Cierre la tapa inmediatamente si surgen grietas en el pellet de las perlas.
    11. Pipetear 22 μL del tampón de elución del ADN en el tubo, enjuagar el pellet de las perlas y cerrar la tapa y el vórtice. Centrifugar brevemente (5 s) para llevar el líquido turbio al fondo del tubo y ajustar el tubo a RT durante 5 min.
    12. Cuantificar la concentración de la biblioteca de ADN construida con un fluorómetro11 y almacenar la biblioteca de ADN construida a -20 °C; la concentración del fragmento de ADN seleccionado oscila entre 0,6 y 10 ng/μL. Recodifique la información de la biblioteca en la base de datos de la biblioteca y almacene las muestras en consecuencia.

4. Preparación de la plantilla de secuenciación13,14

NOTA: Los materiales utilizados en esta sección están disponibles en el conjunto de kits de preparación de plantillas (reactivos/soluciones/materiales) del kit universal de reacciones de secuenciación (tabla de materiales).

  1. Mezcla de bibliotecas
    1. Complete el formulario de una hoja de registros previa a la ejecución en el sistema del servidor y etiquete el tubo de muestra con la concentración de la biblioteca y el número de código de barras. Evite usar los mismos códigos de barras en diferentes muestras en una sola ejecución.
    2. Vortex y mezclar la muestra de la biblioteca, y centrifugar brevemente (5 s). Diluir todas las muestras a 100 pM con agua libre de nucleasa, vórtice durante 30 s y centrifugar brevemente la muestra.
      NOTA: Dado que el ADN tiene una longitud media de 260 pb, y 1 pb es 660 g/mol, calcule la conversión de ng/μL a pM utilizando la siguiente ecuación: 1 ng/μL = 5.827,5 pM/L.
    3. Pipetear 10 μL de biblioteca diluida de 100 pM en un tubo centrífugo de 1,5 ml, vórtice durante 30 s y centrífuga breve durante 2 s. Mantenga la biblioteca mixta en hielo.
  2. Preparación de plantillas
    1. Inicie el sistema de amplificación de plantillas y elija el programa limpio. Agregue el aceite de reacción a 1/2 del tubo y agregue la solución de ruptura del emulsionante a 1/3 del tubo.
    2. Confirme que la placa de amplificación y el adaptador de lavado estén colocados en la posición ON . Limpie la botella de desecho y coloque una aguja en un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml para recolectar los desechos. Confirme los pasos procesados en la pantalla del sistema de amplificación de plantillas. Presione SIGUIENTE para iniciar un programa limpio, que tomará aproximadamente 15 minutos.
    3. Reemplace la placa de amplificación por una nueva después del programa limpio, inserte los tubos de recolección que contienen 150 μL de solución de rotura II en el rotor y coloque el puente sobre los tubos de recolección. Agregue el aceite de reacción a 1/2 del tubo y la solución de ruptura del emulsionante a 1/3 del tubo.
    4. Emulsionar la preparación del reactivo de PCR: Equilibre el tampón de PCR emulsionado en RT hasta que se disuelva, centrifugue brevemente (5 s) todos los reactivos y colóquelos en hielo antes de usarlos.
    5. Pipetear 120 μL de la mezcla enzimática de PCR emulsionada, 100 μL de tampón de partículas de esfera iónica (ISP), 170,5 μL de agua libre de nucleasas y 9,5 μL de la biblioteca mixta (100 pM) en un tubo que contiene 2.000 μL de tampón de PCR emulsionado. Mezclar bien la solución con pipeteo repetido.
      NOTA: La solución mixta debe cargarse en el sistema de amplificación de la plantilla en un plazo de 15 minutos; realizar todos los procedimientos en RT.
    6. Coloque un nuevo filtro para la preparación de la plantilla estable en el bastidor de tubos con el portal de muestras hacia arriba. Vortex la solución durante 5 s, centrifugar brevemente (5 s) y transferir la solución al portal de muestras del filtro después de pipetear repetidamente 800 μL tres veces. Centrifugar el tubo para disminuir las burbujas antes de la última inyección. Evite inyectar aire en el filtro. Inyectar 200 μL de aceite de reacción II después de la solución mezclada.
    7. Gire el portal de muestras del filtro hacia abajo y reemplace el adaptador de lavado con el filtro. Inserte la aguja de muestra en el orificio central de la tapa del rotor y luego presione la aguja hacia abajo.
    8. Pulse el botón EJECUTAR en la pantalla, elija el programa de acuerdo con el kit correspondiente y presione ASSISTED para verificar todos los pasos. Presione SIGUIENTE hasta que se inicie la ejecución; Se tarda aproximadamente 4,5 h en terminar.
    9. Presione SIGUIENTE cuando el programa haya terminado; El sistema iniciará una centrifugación de 10 minutos. Cuando se detenga la centrifugación, pulse el botón Open Tap y mueva los tubos de recogida a los bastidores. Si el procedimiento no pasa al siguiente paso en 15 minutos, presione Final Spin para volver a centrifugar.
    10. Retire el sobrenadante en el tubo de recolección, dejando 100 μL de solución en el tubo. Mezclar la muestra restante pipeteando y transferir la muestra a los nuevos tubos centrífugos de 1,5 ml marcados como OT (sistema One touch 2).
      NOTA: Al pipetear el sobrenadante, evite tocar el fondo del tubo a lo largo del costado.
    11. Pipetear 100 μL de agua libre de nucleasa en cada uno de los tubos colectores y transferir la solución al tubo OT lavada con pipeteo repetido. Agregue 600 μL de agua libre de nucleasas al tubo OT para hacer que el volumen total sea de 1 ml, vórtice durante 30 s y centrifugar a 15,500 x g durante 8 min.
    12. Retire suavemente el sobrenadante en el tubo OT con 100 μL restantes y use la punta para desechar bien la capa de aceite. Añadir 900 μL de agua libre de nucleasas, vórtice durante 30 s y centrifugar a 15.500 x g durante 8 min.
    13. Retire el sobrenadante hasta que queden 20 μL, agregue la solución de resuspensión de la plantilla para hacer que el volumen sea de 100 μL, el vórtice durante 30 s y una centrífuga breve durante 2 s.
      NOTA: La solución obtenida en este paso debe pasar al siguiente paso en menos de 12 h.
    14. Ejecute el programa limpio en el sistema de amplificación de plantillas antes de apagar su alimentación.
  3. Enriquecimiento de plantillas
    1. Preparar la mezcla de fusión con 280 μL de interpolación 80 y 40 μL de NaOH 1 M.
    2. Lave las perlas C1. Vortex la solución de perlas C1 durante 30 s. Transfiera 100 μL de perlas a un tubo de centrífuga de 1,5 ml, inserte el tubo en una rejilla magnética durante 2 minutos y deseche el sobrenadante.
    3. Transfiera 1 ml de la solución de lavado de perlas C1 al tubo y el vórtice durante 30 s. Centrifugar brevemente (5 s), insertar el tubo en la rejilla magnética durante 2 minutos y desechar el sobrenadante. Pipetear 130 μL de solución de resuspensión de perlas C1 en el tubo y mezclar las perlas mediante pipeteo repetido. Evita crear burbujas.
    4. Cargue 100 μL de la biblioteca diluida, 130 μL de perlas C1, 300 μL x 3 de solución de lavado de plantilla y 300 μL de la solución de fusión en las tiras de ocho pocillos, como se muestra en la Figura 1.
    5. Instale las tiras de ocho pocillos en el módulo de enriquecimiento, cargue la punta de pipeteo y coloque el tubo de centrífuga de 200 μL en la posición de recolección. Presione START para ejecutar el programa; Se tarda unos 35 min.
    6. La muestra se recogerá automáticamente en el tubo de centrífuga de 200 μL; Cierre la tapa y centrifugarla a 15.500 x g durante 5 min. Verifique el fondo del tubo para verificar si quedan perlas C1.
    7. Si quedan perlas C1, pipetear repetidamente la solución plantilla 10x e insertar el tubo en la rejilla magnética durante 4 minutos. Transfiera todo el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 0,2 ml y centrífuga a 15.500 x g durante 5 min.
    8. Si no quedan perlas C1 visibles, deseche el sobrenadante hasta que queden 10 μL, agregue 200 μL de agua libre de nucleasa y mezcle pipeteando 10x. Centrifugadora a 15.500 x g durante 5 min.
    9. Desechar el sobrenadante con 10 μL restantes y añadir 90 μL de agua libre de nucleasa para alcanzar un volumen total de 100 μL. Pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar la solución, vórtice durante 5 s y centrifugar brevemente (5 s). La solución puede conservarse a 2-8 °C durante menos de 3 días.

5. Secuenciación de próxima generación 9,15

NOTA: Todos los procedimientos de esta sección se realizan en la plataforma de secuenciación DA8600. Los materiales utilizados en esta sección están disponibles en el Conjunto de Kits de Secuenciación (Reactivos/Soluciones/Materiales) del Kit Universal de Reacciones de Secuenciación (Tabla de Materiales).

  1. Compruebe todos los reactivos y materiales necesarios en una plataforma de secuenciación de ejecución.
    1. Reactivo de secuenciación: Compruebe la disponibilidad de solución enzimática de secuenciación (6 μL), cebadores de secuenciación (20 μL), plantilla de control de calidad (5 μL) y dGTP/dCTP/dATP/dTTP (70 μL), almacenados entre -30-10 °C.
    2. Solución de secuenciación: Compruebe la disponibilidad de la solución de secuenciación II (100 ml), la solución de secuenciación III (50 ml), el tampón de recocido (1.015 μL), el tampón de carga (10 μL), el agente espumante (2 μL), el comprimido de cloro (1 comprimido) y las perlas de estreptavidina (100 μL), almacenadas a 4 °C.
    3. Materiales: Verifique la disponibilidad de tubo de reactivos de 250 ml (8), tapa de tubo de 250 reactivos (8), sorbo II (8), sorbo (1), botella de reactivo de 2 L (1) y chip de secuenciación (1), almacenados en RT.
  2. Lave el chip antes de usarlo.
    1. Coloque un chip estable en una placa de trabajo, inyecte 100 μL de agua libre de nucleasa en el orificio de la muestra, retire la solución en el portal de salida y repita el procedimiento.
    2. Inyectar 100 μL de solución de NaOH 0,1 M en el chip e incubar durante 1 min a RT.
    3. Inyecte 100 μL de isopropanol en el orificio de la muestra, retire la solución adicional en el portal de salida y repita el procedimiento nuevamente.
    4. Cubra el portal de salida con un papel de filtro, fluya el nitrógeno para secar el isopropanol restante en la celda de flujo del chip y mantenga el chip listo para usar en RT.
  3. Inicio del secuenciador
    1. Encienda la válvula de nitrógeno y ajuste la presión a 30 psi. Inicie el secuenciador, presione CLEAN en la pantalla principal y elija agua o cloruro para lavar la máquina en consecuencia.
      NOTA: Lavar con agua antes de cada corrida, lavar con cloruro cada semana o el tiempo que la máquina esté parada con reactivos durante 48 h.
    2. Lavado de cloruro: Elija una botella de reactivo especificada para el lavado de cloruro, lave la botella dos veces con 18 MΩ de agua y llene la botella con 1 L de 18 MΩ de agua. Ponga una tableta de cloruro en el frasco, disuelva la tableta durante 10 minutos, agregue 1 ml de NaOH 1 M y luego invierta el frasco para mezclar la solución. Use la solución de cloruro dentro de las 3 h después de la preparación.
    3. Filtrar 100 ml de solución de cloruro con un filtro de 0,45 μm y recoger con dos tubos. Instale los dos tubos de cloruro en las posiciones C1 y C2. Presione CLEAN en la pantalla principal y equipe un chip para el lavado de cloruro.
    4. Presione SIGUIENTE y verifique todos los pasos en la pantalla para iniciar el programa de lavado; El programa finalizará en 30 min. Comience un lavado con agua después del lavado de cloruro.
    5. Lavado con agua: Marque dos tubos específicos para agua con C1 y C2, y lave los tubos con agua de 18 MΩ dos veces. Agregue 100 ml de agua de 18 MΩ a cada uno de los tubos de lavado con agua y colóquelos en las posiciones C1 y C2, respectivamente.
    6. Elija el programa CLEAN , instale el chip preparado para el lavado con agua, presione SIGUIENTE y luego verifique todos los pasos en la pantalla para iniciar el programa de lavado.
  4. Inicialización
    1. Limpie la botella de lavado con la solución de lavado II, márquela como W2 y lávela tres veces con 18 MΩ de agua.
    2. Limpie el tubo de nitrógeno con papel colocado por aire, insértelo en el fondo del tubo y ajuste el flujo de aire a 0,5 L/min. Descargue el oxígeno en la botella y llene la botella con 1,920 ml de agua de 18 MΩ. Agregue la solución secuencial II y 10 μL de NaOH 1 M al frasco, cierre la tapa e invierta el frasco varias veces para mezclar la solución.
    3. Marque dos tubos nuevos como W1 y W3. Añadir 32 μL de NaOH 1 M a W1, añadir 40-50 ml de solución de secuencia 1x III a W3 y cerrar las tapas.
      NOTA: 1x solución de secuencia III debe estar en un baño de agua a 37 °C durante 30 minutos cuando se utiliza por primera vez. La solución secuencial II debe protegerse de la luz y almacenarse en RT. La botella de lavado debe ser reemplazada por una nueva después de haber sido utilizada 20 veces.
    4. Presione INITIALIZE en la pantalla principal, cambie el sorbo en las posiciones W1, W2 y W3, coloque los tubos en su posición correspondiente y séllelos firmemente girando. Instale un chip para la inicialización y verifique los parámetros de estado de la máquina.
    5. Pulse SIGUIENTE para iniciar el programa de inicialización; Se tarda 40 minutos en la primera sección.
      NOTA: Los guantes deben cambiarse antes de cambiar el nuevo sorbo para evitar contaminar el cuerpo del sorbeador. Una vez utilizados para el lavado con agua y la inicialización, los chips se pueden aplicar a la inicialización, pero no utilice los chips utilizados para los chips de cloruro para la inicialización.
    6. Disuelva dGTP, dCTP, dATP y dTTP en hielo y mezcle el vórtice. Marque cuatro tubos nuevos como G, C, A y T, y pipete 70 μL de la solución de acuerdo con la etiqueta del tubo.
  5. Prepare la biblioteca para ejecutarla.
    1. Coloque la plantilla de control de calidad, los cebadores y la solución enzimática en hielo.
    2. Prepare la biblioteca de ADN cuando le queden unos 20 minutos al programa de inicialización. Vórtice la plantilla de control de calidad durante 30 s para mezclar, y centrifugar brevemente durante 2 s. Transfiera 5 μL de la plantilla de control de calidad a la solución de plantilla, vórtice durante 5 s y centrifugar el tubo durante 15.500 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante pipeteando cuidadosamente, evite tocar el pellet y deje un volumen de 10 μL en el tubo.
    3. Añadir 15 μL de tampón de recocido en el tubo; el volumen total de la solución es de 25 μL.
    4. Vortex los cebadores de secuencia cuando se disuelva completamente en hielo y centrifugar brevemente durante 2 s. Transfiera 20 μL de los cebadores de secuencia al tubo desde el paso anterior, vórtice durante 5 s, centrifugar brevemente durante 2 s y luego guárdelo en RT antes de su uso.
  6. Carga de la muestra y secuenciación
    1. Pipetear 55 μL de la solución de muestra preparada en el paso anterior e inyectarla en el orificio de muestra del chip.
    2. Coloque el chip en la centrífuga; Mantenga la muesca hacia el exterior y el portal de muestras en el interior, equilibrándolo con otro chip usado y centrifugar durante 10 minutos.
    3. Prepare la solución de carga.
      1. Mezclar 0,5 ml del tampón de recocido y 0,5 ml de agua libre de nucleasas en un tubo de centrífuga de 1,5 ml. Márquelo como tampón de recocido al 50% y úselo dentro de los 7 días.
      2. Mezclar 0,5 ml de solución de isopropanol y 0,5 ml de tampón de recocido. Márquelo como tampón de lavado al 50% y úselo dentro de las 24 horas.
      3. Mezclar 6 μL de enzima secuencial y 60 μL de tampón recocido al 50%. Márquelo como tampón de reacción enzimática y coloque la solución en hielo después de la preparación.
      4. Mezclar 49 μL de tampón de recocido al 50% y 1 μL de agente espumante, y márquelo como solución espumante.
    4. Sople 100 μL de aire en la solución espumante, pipetear repetidamente la solución hasta que las burbujas estén en un estado de espuma densa y mantener el volumen de espuma alrededor de 250 μL.
    5. Coloque el chip en el banco después de la centrifugación, inyecte 100 μL de espuma en el orificio de muestra y retire la solución extruida en el portal de salida. Vuelva a colocar el chip en la centrífuga y centrifugar brevemente durante 30 s.
    6. Repita los pasos 5.6.4-5.6.5.
    7. Inyecte 100 μL de tampón de lavado al 50% dos veces y retire la solución extruida en el portal de salida después de cada inyección.
    8. Inyecte 100 μL de tampón de recocido al 50% tres veces y retire la solución extruida en el portal de salida después de cada inyección.
    9. Inyecte 65 μL de tampón de reacción enzimática al 50%, evite burbujas y retire la solución extruida en el portal de salida.
    10. Estabilice el chip cargado en RT durante 5 minutos e instale el chip en el portal del chip secuenciador. Elija el plan programado en el paso 6, verifique la información y comience la ejecución; Se tarda aproximadamente 1,5 h en terminar.
    11. Realice el programa de lavado con agua dentro de las 72 h posteriores a la finalización de la carrera. Realizar el lavado de cloruro antes del lavado con agua cuando el tiempo supere las 72 h. Apague el secuenciador y cierre la válvula del nitrógeno.

6. Planificar una ejecución de secuenciación instruida en el sistema del servidor de reporteros16

NOTA: Todos los procedimientos de esta sección se realizan en Ion Proton Sequencer con el sistema del servidor informador.

  1. Inicie sesión en el sistema del servidor, seleccione la pestaña Plan y haga clic en Ejecutar plantilla de plan. Elija Genoma completo como tipo de ejecución y seleccione la plantilla adecuada de la lista de plantillas de ejecución planificadas.
  2. En la pestaña Plan , escriba o realice las siguientes selecciones:
    1. Introduzca un nuevo nombre de plan de ejecución según el lote de muestras, seleccione hg19 (Homo sapiens) en la lista desplegable Biblioteca de referencia y seleccione Ninguno en las listas desplegables Regiones de destino y Regiones de punto crítico .
    2. Introduzca el número de códigos de barras utilizados en el conjunto de muestras, seleccione un código de barras de la lista desplegable para cada muestra e introduzca un nombre único y descriptivo, que puede ser útil para agrupar y realizar un seguimiento de la muestra. Evite el uso del ejemplo predeterminado 1 y así sucesivamente.
    3. Seleccione Ninguno en la pestaña Ion Reporter , haga clic en Siguiente y seleccione ADN en la aplicación y Genoma completo como técnica de destino.
    4. En la pestaña Kits , compruebe las selecciones o realice cambios mientras sea apropiado para una ejecución.
      1. Seleccione Ion Plus Fragment Library Kit en la lista desplegable Library Kit Type (Tipo de kit de biblioteca ). Seleccione Ion PI HI-Q OT2 200 kit en la lista desplegable Kit de plantilla y elija OneTouch como predeterminado. Seleccione Ion PI HI-Q Sequencing 200 kit en la lista desplegable Sequencing Kit .
      2. Ingrese 300 flujos, seleccione Ion PITM Chip en la lista desplegable Tipo de chip y seleccione IonXpress en la lista desplegable Conjunto de código de barras .
      3. Cancele la selección de Marcar como lecturas duplicadas y la selección de Habilitar realineación.
    5. Elija el complemento apropiado en la pestaña Complementos para realizar el análisis de datos en el paso 7. Complete las selecciones en el paso de proyectos, haga clic en Siguiente y haga clic en Planificar ejecución en la esquina inferior derecha para enumerar las ejecuciones planificadas.
    6. En la pestaña Ejecuciones planificadas , seleccione la ejecución recién creada y compruebe todos los ajustes en la ventana de revisión.

7. Análisis de datos

  1. Analice las variantes de número de copia (CNV) utilizando un flujo de trabajo bioinformático.
    NOTA: Los CNVs fueron analizados en el flujo de trabajo bioinformático con la implementación de un algoritmo basado en un modelo oculto de Markov (HMM)17; El modelo utiliza la cobertura de lectura en todo el genoma para predecir el número de copias o el estado de ploidía del número entero (es decir, 0, 1, 2, 3, etc.). La canalización bioinformática general se creó en el complemento de un sistema servidor de secuencias, que se muestra en la Figura 2. El paso de análisis bioinformático tarda un promedio de 4 horas en completarse.

Resultados

A medida que el plan de secuencias finaliza después del proceso de ejecución en la máquina, el sistema del servidor de secuencias informa del resumen con información descriptiva de los datos generados, el estado del chip, la velocidad de carga del ISP y la calidad de la biblioteca, como se muestra en la Figura 2. En esta demostración de resultados, se obtuvieron datos de 17.6 G en la base total, y la tasa de carga general de ISP fue del 88% en los pocillos totales del chip; el mapa de c...

Discusión

La aneuploidía cromosómica de los embriones es la causa de una gran proporción de la pérdida del embarazo, ya sea concebido de forma natural o de la fecundación in vitro (FIV). En la práctica clínica de la FIV, se propone que el cribado de la aneuploidía embrionaria y la transferencia del embrión euploide podrían mejorar el resultado de la FIV. La hibridación fluorescente in situ es la técnica más temprana adoptada para la selección del sexo y PGT-A; Sin embargo, esta técnica requiere má...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer al Dr. Zhangyong Ming y al Sr. Rongji Hou por su asesoramiento sobre la aplicación ampliada de LIMS. Este estudio cuenta con el apoyo de los Proyectos Especiales de Investigación del PLA para la Planificación Familiar (17JS008, 20JSZ08), el Fondo del Laboratorio Clave de Investigación de Enfermedades Metabólicas de Guangxi (No.20-065-76) y el Proyecto de Investigación de Ciencia y Tecnología de Salud Ciudadana de Guangzhou (201803010034).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm Syringe Filter UnitMerkmilliporeMillex-HV
1.5 mL DNA LoBind TubesEppendorf30108051
15 mL tubesGreiner Bio-One188261
2.0 mLDNA LoBind TubesEppendorf30108078
50 mL tubesGreiner Bio-One227261
5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)FAPON
 Anstart Tap DNA PolymeraseFAPON
AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding)BeckmanA63881https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881
Cell Lysis bufferSouthern Medical UniversityCell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS
ClinVarNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
DNA elution bufferNEBT1016L
dNTPVazymeP031-AA
DynaMag-2 MagnetLife Technologies12321D
Ethyl alcoholGuangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientifichttp://www.chemicalreagent.com/
Independently developed whole genome amplification reagentsSouthern Medical UniversityThe reagents consist of the following components:
1. Cell Lysis
2. Amplification Pre-mixed solution
    1) Primer WGA-P2 (10 μM)
    2) dNTP (10 mM)
    3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus)
3. Amplification Enzyme
    1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL)
Ion PI Hi-Q OT2 200 KitThermo Fisher ScientificA26434Kit mentioned in step 4.2.8
Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit  Thermo Fisher ScientificA26433
Ion Proton SystemLife Technologies4476610
Ion Reporter Server SystemLife Technologies4487118
isopropanolGuangzhou Chemical Reagent Factoryhttp://www.chemicalreagent.com/
Library Preparation KitDaan Gene Co., Ltd114https://www.daangene.com/pt/certificate.html
NaOHSigma-AldrichS5881-1KG
Nuclease-Free WaterLife TechnologiesAM9932
Oligo WGA-P2Sangon Biotech5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN
NNNNATGTGG-3'
OneTouch 2 SystemLife Technologies4474779 Template amplification and enrichment system
PCR tubesAxygenPCR-02D-C
PicoPLEX WGA KitTakara Bio USAR300671
Pipette tipsQuality Scientific Productshttps://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
Portable Mini Centrifuge LX-300QilinbeierE0122
Qubit 3.0 FluorometerLife TechnologiesQ33216Fluorometer
Qubit Assay TubesLife TechnologiesQ32856
Qubit dsDNA HS Assay KitLife TechnologiesQ32851
Sequencer server systemThermo Fisher ScientificTorrent Suite Software
Sequencing Reactions Universal KitDaan Gene Co., Ltd113https://www.daangene.com/pt/certificate.html
This kit contains the following components:
1. Template Preparation Kit Set

1.1 Template Preparation Kit:
Emulsion PCR buffer
Emulsion PCR enzyme mix
Template carrier solution

1.2 Template Preparation solutions:
Template preparation reaction oil I
emulsifier breaking solution II
Template Preparation Reaction Oil II
Nuclease-free water
Tween solution
Demulsification solution I
Template washing solution
C1 bead washing solution
C1 bead resuspension solution
Template resuspension solution

1.3 Template Preparation Materials:
Reagent tube I
connector
Collection tube
Reagent tube pipette I
Amplification plate
8 wells strip
Dedicated tips
Template preparation washing adapter
Template preparation filter

2. Sequencing Kit Set

2.1 Sequencing Kit:
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
Sequencing enzyme solution
Sequencing primers
Quality control templates

2.2  Sequencing Solutions:
Sequencing solution II
Sequencing solution IIII
Annealing buffer
Loading buffer
Foaming agent
Chlorine tablets
C1 bead

2.3 Sequencing Materials:
Reagent Tube II
Reagent tube cap
Reagent tube sipper  II
Reagent bottle sipper
Reagent bottles

3. Chip
Sodium hydroxide solutionSigma72068-100ML
Thermal CyclerLife Technologies4375786

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  10. PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019)
  11. . Qubit® 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf (2014)
  12. Ion AmpliSeq™ DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf (2019)
  13. Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf (2015)
  14. Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf (2017)
  15. Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf (2017)
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