Huellas dactilares cardiolipina en leucocitos por espectrometría de masas para un diagnóstico rápido del síndrome de Barth

Resumen

Este protocolo muestra cómo obtener una "huella digital" espectrométrica de masas de cardiolipina leucocitaria para el diagnóstico del síndrome de Barth. La evaluación de la relación monolisocardiolipina a cardiolipina elevada discrimina a los pacientes con síndrome de Barth de los pacientes con insuficiencia cardíaca de control con 100% de sensibilidad y especificidad.

Resumen

La cardiolipina (CL), un fosfolípido dimérico que lleva cuatro cadenas de ácidos grasos en su estructura, es el marcador lipídico de las mitocondrias, en el que desempeña un papel crucial en el funcionamiento de la membrana interna. Su metabolito monolisocardiolipina (MLCL) está fisiológicamente casi ausente en el extracto lipídico de células animales y su aparición es el sello distintivo del síndrome de Barth (BTHS), una enfermedad genética rara y a menudo mal diagnosticada que causa miocardiopatía grave en la infancia. El método descrito aquí genera una "huella dactilar de cardiolipina" y permite un ensayo simple de los niveles relativos de las especies de CL y MLCL en los perfiles lipídicos celulares. En el caso de los leucocitos, solo se requiere 1 ml de sangre para medir la relación MLCL / CL a través de la ionización por desorción por láser asistida por matriz: tiempo de vuelo / espectrometría de masas (MALDI-TOF / MS) justo dentro de las 2 h posteriores a la extracción de sangre. El ensayo es sencillo y se puede integrar fácilmente en el trabajo de rutina de un laboratorio de bioquímica clínica para detectar BTHS. La prueba muestra una sensibilidad y especificidad del 100% para BTHS, lo que la convierte en una prueba de diagnóstico adecuada.

Introducción

El síndrome de Barth (BTHS) es una enfermedad rara ligada al cromosoma X caracterizada por miocardiopatía de inicio temprano, miopatía del músculo esquelético, retraso en el crecimiento, neutropenia, disfunción variable de la cadena respiratoria mitocondrial y estructura mitocondrial anormal 1,2,3,4,5. BTHS tiene una prevalencia de un caso por millón de hombres con actualmente menos de 250 casos conocidos en todo el mundo, aunque es ampliamente aceptado que la enfermedad está infradiagnosticada ^2,6. BTHS resulta de mutaciones de pérdida de función del gen Tafazzin (TAFAZZIN) localizado en el cromosoma Xq28.12 ^7,8 que causan una remodelación deficiente del fosfolípido mitocondrial cardiolipina (CL), un proceso que normalmente conduce a una composición de acilo altamente simétrica e insaturada ^9,10. Cl ha sido considerado el lípido característico de las mitocondrias, donde es un componente importante de la membrana interna, vital para la fosforilación oxidativa (es decir, el metabolismo energético mitocondrial), la formación de supercomplejos, la importación de proteínas y está involucrado en la dinámica mitocondrial, la mitofagia y la apoptosis ^{11,12,13,14,15,16} . Tras la pérdida de la función de TAFAZZIN, la remodelación de CL falla y surgen anomalías específicas de fosfolípidos en las mitocondrias de pacientes con BTHS: el nivel maduro de CL (CLm) disminuye, mientras que se produce un aumento de los niveles de monolisocardiolipina (MLCL) y una composición alterada de CL acilo (es decir, especies de CL inmaduras, CLi). Esto lleva a un aumento dramático de la relación MLCL/CL¹⁷.

El diagnóstico de BTHS es a menudo difícil, ya que el trastorno presenta características clínicas y bioquímicas extremadamente variables y puede diferir entre los individuos afectados de la misma familia y dentro de un paciente a lo largo del tiempo ^3,5. Muchos niños BTHS muestran un nivel muy alto de excreción urinaria de ácido 3-metilglutacónico (3-MGCA), pero el nivel de orina puede ser normal o solo un aumento leve en pacientes con el tiempo³. Sin embargo, el aumento de 3-MGCA es una característica de varios otros trastornos mitocondriales y no mitocondriales, como la deficiencia de 3-metilglutaconil-CoA hidratasa (defecto AUH), aciduria 3-metilglutacónica, distonía-sordera, encefalopatía, síndrome de Leigh (MEGDEL), síndrome de Costeff y miocardiopatía dilatada con ataxia (DCMA)^18,19 . Por lo tanto, la escasa especificidad del 3-MCGA como marcador de BTHS y la enorme variabilidad en los pacientes hacen que el diagnóstico bioquímico sea ambiguo.

Además, se han descrito más de 120 mutaciones diferentes de TAFAZZIN que causan el trastorno⁵ y, por lo tanto, un diagnóstico genético puede ser complicado, lento y costoso. Además, el análisis molecular del gen TAFAZZIN puede dar lugar a resultados falsos negativos en presencia de mutaciones en secuencias no codificantes o reguladoras³. BTHS puede ser probado inequívocamente determinando las cantidades relativas y la distribución de las especies (monolyso-)CL y confirmado por secuenciación del gen TAFAZZIN o viceversa.

Una prueba práctica para el diagnóstico es la medición de la relación MLCL/CL mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y análisis de ionización por electropulsión / espectrometría de masas (ESI/MS) en el punto sanguíneo^20,21. La medición del nivel de CL por sí sola no es adecuada para el diagnóstico, ya que algunos pacientes tienen niveles casi normales de CL pero alteran la relación MLCL/CL. Por lo tanto, la medición de la relación MLCL/CL tiene una sensibilidad y especificidad del 100% para el diagnóstico de BTHS²¹. Se ha establecido otro método validado basado en el análisis de HPLC y ESI/MS sobre leucocitos²², pero las complejas técnicas cromatográficas para la separación de lípidos previamente extraídos y la cara de los instrumentos restringen este análisis a unos pocos laboratorios clínicos. Todos estos factores, junto con la falta de una prueba diagnóstica directa, han contribuido al infradiagnóstico de la afección.

MALDI-TOF/MS es otra herramienta válida en el análisis de lípidos^23,24. Esta técnica analítica se puede utilizar para obtener directamente perfiles lipídicos de diversas muestras biológicas, saltándose así los pasos de extracción y separación 25,26,27,28,29, incluso en secciones de tejido para aplicaciones de MS Imaging ³⁰. Dada esta ventaja, se desarrolló un método simple y rápido para diagnosticar BTHS mediante el perfil de CL mitocondrial en leucocitos intactos con MALDI-TOF/MS²⁸. El aislamiento leucocitario de solo 1 ml de sangre total por sedimentación y lisis de eritrocitos es sencillo y no requiere equipos o reactivos especiales. Además, se describió un protocolo rápido de "miniextracción" de lípidos aplicable a cantidades diminutas de leucocitos para garantizar la adquisición exitosa de espectros que tienen señales MS más limpias con una relación señal-ruido (S / N) más alta que en las obtenidas de leucocitos intactos²⁸. Este paso adicional lleva poco tiempo y permite que los análisis sean reproducibles incluso cuando se llevan a cabo en instrumentos de EM con poca sensibilidad. En resumen, el método analítico descrito aquí requiere una preparación mínima de la muestra porque se puede omitir la separación cromatográfica de lípidos que consume mucho tiempo y mano de obra, lo que acelera la prueba.

Protocolo

Las muestras de sangre de donantes sanos y pacientes con insuficiencia cardíaca se recogieron en el Hospital Policlínico de Bari (Italia), mientras que las muestras de pacientes con BTHS fueron obtenidas por la clínica BTHS del Servicio Nacional de Salud del Reino Unido en el Hospital Real para Niños de Bristol (Reino Unido). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de donantes, pacientes y padres sanos (cuando corresponda) y las aprobaciones de los respectivos comités de ética.

NOTA: Si no se usa inmediatamente, la sangre (en tubo de gel K-EDTA) se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de 24-48 h.

1. Aislamiento de leucocitos por sedimentación de dextrano de glóbulos rojos (glóbulos rojos)

1. Coloque muestras de sangre (en K-EDTA) en un agitador orbital durante 10 minutos para mezclar sangre.
2. A 0,9 ml de sangre total en un tubo de 1,5 ml, agregue 0,1 ml de solución de dextrano al 20% (masa molecular > 100 kDa, en NaCl al 0,9%). Pipete y disperse la suspensión suavemente 20 veces mientras evita las burbujas de aire que de otro modo retendrían los glóbulos rojos en la parte superior del tubo. Deje sedimentar los glóbulos rojos durante aproximadamente 1 h a temperatura ambiente.
3. Con una jeringa, recoja y transfiera el sobrenadante amarillo a un tubo de 15 ml, y luego centrífique a 400 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente (sin freno, rotor de cuchara oscilante).
4. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet que contiene principalmente leucocitos y glóbulos rojos residuales en 0,6 ml de agua bidestilocida helada (ddH₂O).
5. Después de ~15 s, agregue 0.2 mL de 0.6 M KCl a la suspensión celular para restaurar la osmolaridad correcta. El choque osmótico corto lisará los glóbulos rojos y dejará intactos los leucocitos. Ajuste el volumen final a 2,5 ml con 1x PBS.
6. Centrifugar la suspensión a 400 x g durante 15 min a temperatura ambiente (sin freno, rotor de cucharón oscilante). Deseche el sobrenadante y lave el pellet de leucocitos nuevamente con 2.5 mL de 1x PBS.
7. Centrifugar como en el paso 1.6 y desechar el sobrenadante. Resuspendir el pellet que contiene leucocitos en 200 μL de ddH₂O esterilizado.
   NOTA: En la experiencia de los autores, esto corresponde a un contenido de proteína que oscila entre 200 μg y 400 μg.
8. Congele la suspensión a -80 °C o realice directamente la extracción de lípidos de la siguiente manera.

2. "Miniextracción" de lípidos de leucocitos aislados

1. Transfiera 20 μL de suspensión de leucocitos (aproximadamente 20-40 μg de proteínas) a un tubo de 1,5 ml y gire a 16.000 x g durante 30 s.
2. Deseche el sobrenadante, agregue 10 μL de CHCl₃ al pellet restante y pipetee repetidamente para promover la extracción de lípidos.
3. Finalmente, agregue 10 μL de solución de matriz de 9-aminoacridina (9-AA) (10 mg/ml 9-AA en 2-propanol/acetonitrilo, 60:40 v/v) al pellet en CHCl₃. Pipetear y dispersar repetidamente para mezclar.
4. Girar la solución que contiene lípidos en CHCl₃ y 9-AA a 16.000 x g durante 30 s, y luego depositar el sobrenadante como gotas de 0,35 μL (tres réplicas para cada muestra) en el objetivo MALDI (placa de muestra) a analizar (método de deposición de gotas secas").
5. Deje que las gotas se sequen al aire al menos durante 10-15 min.

3. Análisis de lípidos por MALDI-TOF/MS

1. Adquirir espectros de masas de muestras por triplicado en un espectrómetro de masas MALDI-TOF.
2. Después de la calibración con estándares de lípidos (ver Tabla de Materiales), establezca los análisis en el modo de iones negativos y optimice el rango de detección m/z de 200 Th a 2.000 Th para el análisis de moléculas pequeñas.
3. Mantenga la fluencia del láser un 5% por encima del umbral (de CL y MLCL) para tener un S / N (al menos 2).
4. Adquirir espectros en modo reflector mediante extracción pulsada retardada. Para cada espectro de masas, un promedio de 2.000 disparos láser individuales (suma de 4 x 500). Aplique supresión de matriz cerrada a 400 Th para evitar la saturación del detector.

4. Cómo calcular la relación (MLCL + CLi)/CLm

1. Ejecute el software del instrumento MALDI-TOF/MS (consulte la Tabla de materiales) para analizar los espectros adquiridos.
2. Con el comando Abrir , abra el cuadro de diálogo Spectrum Browser que permite seleccionar y cargar el espectro de interés.
3. En la barra de menús, haga clic en los iconos Suavizar espectro de masa y Restar línea base de espectro de masa.
4. Haga clic en Archivo > Exportar > espectro de masas y elija el formato ASCII para exportar el espectro como una tabla de dos columnas con pares de puntos de datos: m / z (x) e intensidad (y). Copie y pegue las coordenadas en un programa de hoja de cálculo (*.xls).
5. Repita los pasos 4.2 a 4.4 para las triplicaciones de cada muestra analizada, pegando las coordenadas en el mismo archivo de programa de hoja de cálculo como se muestra en la Figura 1 (Paso 1).
6. Siguiendo los rangos x mostrados en la Figura 1 (Paso 2) para cada especie listada, calcule la suma de los valores y₁, y₂ e y₃ (triplicados) mediante la función SUMA para obtener el área pico (Figura 1; Paso 3).
7. Realizar el promedio de los valores de área triplicada por función PROMEDIO (Figura 1; Paso 3).
8. Coloque los valores de área promedio para cada especie en la columna como se muestra en la Figura 1 (Paso 2).
9. Para considerar solo el primer isotopólogo de la especie CLm 72:7 como en²⁸, calcule la corrección isotópica para la superposición entre el isotopólogo M + 2 del CLm 72: 8 y el pico monoisotópico de CLm 72: 7 como se muestra en la Figura 1 (Paso 4).
10. Finalmente, calcule la relación (MLCL + CLi)/CLm como se muestra en la Figura 1 (Paso 5).

Resultados

En este estudio, se ha descrito un método simple y rápido para aislar leucocitos de 1 ml de sangre total y obtener huellas dactilares de CL por MALDI-TOF/MS (ver Figura 2). La Figura 3 muestra la comparación de las huellas dactilares representativas de CL de leucocitos, obtenidas de sujetos de control y niños jóvenes con BTHS, en el rango de masa CL y MLCL (m / z). La Tabla 1 enumera las especies de CL y MLCL detectadas en estos es...

Discusión

El síndrome de Barth es un error innato del metabolismo y una afección que cambia la vida y que es probable que no se diagnostique^{lo suficiente 2,6. Como se mencionó anteriormente, un factor que contribuye puede ser la falta de una prueba de diagnóstico directa. Aquí, se describió un método simple y rápido para medir la relación MLCL/CL por MALDI-TOF/MS en leucocitos para el cribado de BTHS. Además, los espectrómetros de masas MALDI-TOF están amp...}

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin	Avanti Polar Lipids	750332	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin	Avanti Polar Lipids	710335	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine	Avanti Polar Lipids	878130	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate	Avanti Polar Lipids	830845	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol)	Avanti Polar Lipids	840445	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine	Avanti Polar Lipids	840033	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
2-Propanol, ACS reagent, ≥99.5%	Merck Life Science S.r.l.	190764
9-Aminoacridine hemihydrate, 98%	Acros Organics	134410010
Acetonitrile, ACS reagent, ≥99.5%	Merck Life Science S.r.l.	360457
Chloroform, ACS reagent, ≥99.8%	Merck Life Science S.r.l.	319988
Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000	Merck Life Science S.r.l.	31392
Flex Analysis 3.3	Bruker Daltonics		Software
MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF	Bruker Daltonics
Microsoft Excel	Microsoft Office		Software
OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate	Merck Life Science S.r.l.	6505-OP
Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5%	Merck Life Science S.r.l.	P3911
Sodium chloride, ACS reagent, ≥99.0%	Merck Life Science S.r.l.	S9888