Investigación de los efectos paliantes de la administración de Bacillus cereus en la colitis a través de la modulación de la microbiota intestinal

Resumen

En este artículo, presentamos un protocolo para establecer el modelo de ratón de colitis inducida por sodio, pseudo-germen, sulfato de dextrano libre de antibióticos, para investigar el papel de la microbiota intestinal en la regulación de los efectos positivos del Bacillus cereus sobre la colitis.

Resumen

Se cree que la disbiosis de la microbiota intestinal desempeña un papel en la progresión de la colitis. Sin embargo, los estándares precisos para la administración de probióticos en el alivio de la colitis siguen sin definirse. La mayoría de los métodos de análisis se basan en una diversidad y abundancia limitadas de microorganismos intestinales. Por lo tanto, los estudios observacionales no pueden establecer la causalidad. En este estudio, aplicamos ratones pseudolibres de gérmenes inducidos por antibióticos para investigar el papel de la microbiota intestinal en la regulación de los efectos probióticos de Bacillus cereus (B. cereus) en la colitis inducida por sulfato de dextrano sódico (DSS) en ratones. Este proceso permite evaluar el efecto regulador bidireccional de la suplementación con B. cereus sobre la salud y proporciona resultados estables y reproducibles. Aquí, se proporcionan los protocolos detallados para el cultivo de B. cereus , la operación por sonda nasogástrica, la recolección de heces y el tratamiento de eliminación de antibióticos en ratones con colitis. Los métodos de optimización también son aplicables para otros trastornos crónicos asociados a la inflamación. Los resultados mostraron que la administración de B. cereus disminuyó la pérdida de peso corporal, el acortamiento de la longitud del colon, el índice de actividad de la enfermedad y las puntuaciones histopatológicas. Sin embargo, el tratamiento con antibióticos suprimió el efecto positivo de B. cereus sobre la colitis. Estos resultados indican que la microbiota intestinal es necesaria para aliviar los efectos de B . cereus sobre la colitis. Por lo tanto, explorar los efectos beneficiosos de los probióticos en esta investigación es un enfoque prometedor para desarrollar nuevas estrategias de tratamiento para aliviar los síntomas de los trastornos crónicos asociados a la inflamación.

Introducción

Las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) son trastornos inflamatorios gastrointestinales crónicos comunes, como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa (CU)¹. Las vías terapéuticas actuales para la colitis inflamatoria son los 5-aminosalicilatos, los corticosteroides, la azatioprina y los antibióticos². Además, estos medicamentos tienen efectos secundarios considerables³. Por lo tanto, deberíamos prestar más atención al efecto de los probióticos en el tratamiento de la colitis.

Los enfoques terapéuticos alternativos incluyen la administración de probióticos, que se ha utilizado en modelos animales y ensayos clínicos. Estudios previos han indicado que la administración de diferentes probióticos, como Bacillus cereus o Bifidobacterium infantis, podrían aliviar la colitis ^4,5. En los estudios preclínicos, la eficacia y la seguridad de los probióticos deben investigarse en modelos animales.

Los modelos de colitis en ratones con sulfato de dextrano sódico (DSS) pueden ayudar a explorar los mecanismos de la colitis y evaluar los efectos positivos de los probióticos. La inducción del DSS provoca erosiones de la mucosa intestinal, disfunción de la barrera intestinal y aumento de la permeabilidad epitelial intestinal⁶. La mayoría de los modelos de ratones con probióticos han destacado principalmente los efectos biológicos. Sin embargo, el mecanismo detrás de la administración de este probiótico es difícil de explorar, dada la limitación para verificar aún más la relación causal entre los probióticos y el alivio de la colitis. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar un método estandarizado para investigar el mecanismo de los probióticos.

Tradicionalmente, estos estudios requieren la inoculación de ciertos probióticos en ratones libres de gérmenes⁷. Sin embargo, existen algunas limitaciones de laboratorio en el uso de ratones libres de gérmenes como receptores de probióticos, como la baja capacidad inmunitaria y las costosas instalaciones libres de gérmenes⁸. Con el fin de evitar estas limitaciones, se estableció un modelo alternativo de colitis inducida por DSS utilizando ratones pseudo-libres de gérmenes. El modelo de ratón pseudo-libre de gérmenes se estableció mediante la aplicación de antibióticos como se describió anteriormente ^9,10.

En este artículo, establecemos ratones pseudo-libres de gérmenes con un cóctel de antibióticos. También describimos en detalle la metodología para establecer y evaluar modelos de colitis en ratones e investigamos los efectos de los probióticos en el alivio de los síntomas de la colitis. El protocolo a continuación también proporciona los métodos de administración de probióticos por sonda nasogástrica.

Protocolo

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad de Anhui, China, y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Anhui, China (No. IACUC(AHU)-2020-014).

1. Administración de antibióticos

1. Preparar un cóctel de antibióticos disolviendo ampicilina (1 g/L), sulfato de neomicina (1 g/L), metronidazol (0,5 g/L) y vancomicina (0,5 g/L) en 1 L de agua potable⁵.
2. Después de la disolución completa, almacene las soluciones a 4 °C.
3. Coloque las soluciones de cóctel de antibióticos en una botella de agua. Coloca la botella encima de la jaula del ratón.
   NOTA: Asegúrese de usar botellas marrones o envuelva las botellas con papel de aluminio para proteger las soluciones antibióticas de la luz.
4. Reemplace el cóctel de antibióticos con soluciones frescas 2 veces por semana.
5. Permita que los ratones beban libremente las soluciones de cóctel de antibióticos durante 4 semanas.

2. Preparación de agua potable DSS e inducción de colitis

1. Para hacer una solución de sulfato de dextrano sódico (DSS) al 2,5%, disuelva 2,5 g de DSS en 100 mL de agua destilada¹¹.
2. Reemplace el agua potable con la solución DSS al 2,5% en el grupo de ratones modelo de colitis. Asegúrese de que los ratones del grupo de colitis no tengan acceso a otra agua potable. Mientras tanto, trate a los ratones de control con agua destilada sin DSS.
3. Aloje ratones machos C57BL/6J (peso corporal promedio, 20 g ± 2 g; de 7 semanas de edad) en condiciones libres de patógenos con libre acceso a alimentos y agua estándar.
   NOTA: Aloje un total de cinco ratones por jaula en condiciones libres de patógenos.
4. Diseño experimental
   NOTA: Los experimentos con animales se diseñaron en dos etapas. Se incluyeron cinco ratones para cada grupo.
   1. Primera etapa: Para evaluar el efecto positivo de B. cereus en el alivio de la colitis, se asignó aleatoriamente a los ratones a los tres grupos siguientes: grupo de control (control), modelo de colitis inducida por DSS (DSS), suplementación probiótica con B. cereus para ratones inducidos por DSS (B. cereus).
   2. Segunda etapa: Para explorar el papel de la microbiota intestinal en la regulación de los efectos probióticos de B. cereus en la colitis inducida por DSS, se asignaron aleatoriamente los ratones a los tres grupos siguientes: ABX (control), ABX (DSS) y ABX (B. cereus + DSS).
      1. Tratar a los ratones del grupo ABX (control) con solución salina fisiológica.
      2. Después del tratamiento con soluciones de cóctel de antibióticos durante 4 semanas, deje que los ratones del grupo ABX (DSS) reciban agua que contenga 2,5% de DSS durante 1 semana y solución salina fisiológica normal durante 2 semanas.
      3. Después del tratamiento con soluciones de cóctel de antibióticos y agua DSS, trate diariamente a los ratones del grupo ABX (B. cereus + DSS) con B. cereus (2 x 10⁸ células) en 200 μL de solución salina fisiológica utilizando una cánula intragástrica durante 2 semanas.
5. Después de la administración del cóctel de antibióticos, trate inmediatamente a los ratones machos C57BL/6 con una solución de DSS al 2,5% en agua potable durante 7 días.
6. Registre el peso corporal de los ratones antes de la intervención DSS como peso de referencia.

3. Cuantificación de B. cereus

1. Prepare ocho tubos de microcentrífuga de 1,5 mL llenos con 900 μL de solución salina normal estéril.
2. Pipetear 100 μL de crecimiento logarítmico de B. cereus y disolver en 900 μL de solución salina normal estéril.
3. Diluir en serie B . cereus usando tubos.
4. Coloque 40 μL de cada dilución en la placa de agar LB respectiva etiquetada con la proporción de dilución. Repita 3 veces para cada proporción de dilución.
5. Cultive las placas en una incubadora a temperatura constante a 37 °C durante 16 h.
6. Seleccione los platos con ~ 20-70 colonias para contar. Calcular la concentración bacteriana media en función del múltiplo de dilución de las placas seleccionadas.

4. Preparación de B. cereus para sonda nasogástrica

1. Después de la cuantificación de B. cereus, recoja 1 mL de medio de B. cereus que contenga 1 x 10⁹ UFC y centrifugue a 8,000 x g durante 10 min. A continuación, lavar las células bacterianas 2 veces con agua estéril por centrifugación a 8.000 x g durante 10 min y retirar el sobrenadante.
2. Diluir el concentrado de B. cereus con solución salina normal estéril hasta una concentración final de 2 x 10⁸ UFC/200 μL⁴.
3. Pipetear la dilución hacia arriba y hacia abajo repetidamente para adquirir una suspensión dispersa de B. cereus .
4. Llevar a cabo la cuantificación de la concentración de B. cereus mediante la técnica de recuento en placa antes de completar el método de sonda nasogástrica.

5. Aplicación de suplementos de B. cereus por sonda nasogástrica

1. Administrar las intervenciones (2 x 10⁸ probióticos UFC en 200 μL de solución salina normal) en los ratones a través de sonda nasogástrica oral en un tiempo fijo.
2. Para administrar B. cereus, conecte una aguja de sonda nasogástrica (tamaño de la aguja de alimentación: 20 G, 38 mm) a una jeringa de 1 mL. Limpie el exterior de la aguja de sonda nasogástrica con etanol al 70% entre ratones y mantenga la aplicación adecuada de la dosis.
3. Para sujetar a los ratones, levántelos por la cola y agarre firmemente la piel suelta de la espalda con el extremo de la cola fijado entre los dos últimos dedos del manipulador.
4. Mantén los ratones en posición vertical. Luego, inserte la aguja de sonda nasogástrica con cuidado y suavidad a través de la boca hasta el esófago. Si no encuentra resistencia en este paso, empuje suavemente la aguja hacia el estómago.
   NOTA: Confirme la respiración regular y sin obstáculos de los ratones antes de la administración del medicamento.
5. Avance lentamente la aguja y administre la solución de B. cereus . Retire la aguja suavemente después de completar la sonda nasogástrica. Suelta el ratón y devuélvelo a su jaula.

6. Determinación del índice de actividad de la enfermedad

NOTA: El índice de actividad de la enfermedad (DAI) se calculó diariamente mediante la pérdida de peso corporal de los ratones, la sangre oculta en heces y la consistencia de las heces.

1. Mide el peso corporal de los ratones diariamente. Asigne una puntuación de 0 a 4 a cada ratón en función del porcentaje de pérdida de peso corporal (0: 0%, 1: 1%-5%, 2: 6%-10%, 3: 11%-18% y 4: >18%).
2. Recoja muestras frescas de heces de cada ratón. Use un hisopo de algodón para estimular la contracción del ano para promover la defecación. Luego, recoja las muestras de heces inmediatamente después de la defecación en un tubo de centrífuga esterilizado.
3. Determine la sangre oculta fecal mediante el papel de prueba de sangre oculta en heces. Recoja 10 mg de muestra de heces en un aplicador.
4. Coloque la muestra en la tarjeta de prueba y aplique un frotis fino a la tarjeta. Abre la solapa trasera y aplica revelador sobre la mancha.
5. Luego, puntúe la sangre oculta usando un papel de prueba de sangre oculta en heces dentro de los 120 s.
   NOTA: Cualquier rastro de azul en o en el borde de la mancha es positivo para sangre oculta. Las puntuaciones de ocultismo fecal fueron las siguientes: 0: Ninguno, 1: Hemoculto positivo, 2: Leveza, 3: Rastros de sangre en las heces y 4: Sangrado macroscópico.
6. Identifique la consistencia de las heces mediante la detección de la muestra de heces¹¹. Asigne una puntuación de 0 a 4 (0: Normal, 1: Heces blandas, 2: Heces semiformadas, 3: Heces líquidas y 4: Diarrea).

7. Recolección de tejidos

1. Anestesiar a los ratones inyectando hidrato de cloral al 10% (10 mg/kg) al final de la primera y segunda etapa del experimento. Evalúe la profundidad de la anestesia en ratones mediante el reflejo de retirada de pellizco.
2. Luego, sacrificar a los ratones por dislocación cervical.
3. Fije los ratones en decúbito supino en la mesa de operaciones y abra la cavidad peritoneal.
4. Separe todo el colon quirúrgicamente y mida la longitud con una regla.
5. Luego, lave suavemente el colon con una jeringa de 5 ml llena de PBS preenfriado.

8. Evaluación del daño histológico

1. Corta el tejido del colon en pequeños fragmentos, fíjalos en paraformaldehído al 4% e insértalos en parafina con una máquina de inclusión de tejidos.
2. A continuación, corte los tejidos incluidos en parafina con un micrótomo para preparar secciones de tejido colónico de 4 μm de grosor. Desparafinar y deshidratar las secciones del colon. Luego, tiñe las secciones del colon con hematoxilina y eosina (H&E).
   NOTA: Las muestras de colon teñidas son evaluadas por el investigador con un sistema para las siguientes medidas: grado de infiltración de células inflamatorias (Ninguno: 0, Leve: 1, Moderado: 2, Severo: 3), daño mucoso (Ninguno: 0, Capa mucosa: 1, Submucosa: 2, Muscular y serosa: 3), daño de la cripta (Ninguno: 0, 1/3: 1, 2/3: 2, entero: 3, entero + pérdida de epitelio: 4), rango de lesiones (%) (0%: 0, 1%-25%: 1, 26%-50%: 2, 51%-75%: 3, 76%-100%: 4). La puntuación de daño histológico total se calcula para cada puntuación individual de las medidas anteriores⁵.
3. Supongamos que dos experimentadores independientes evalúan (enmascaran) las puntuaciones histológicas de la muestra bajo un microscopio óptico.

Resultados

Suplementación con B. cereus y colitis
El modelo de colitis experimental aguda fue inducido por la intervención del DSS en agua potable. La Figura 1A muestra el protocolo experimental para la administración de B. cereus al modelo de ratón con colitis. La inducción del DSS obviamente disminuyó el peso corporal (Figura 1B) y la longitud del colon. Se investigó el efecto aliviador de

Discusión

Para utilizar probióticos en estudios clínicos, es necesario evaluar la eficacia y seguridad de los probióticos en modelos animales. Los protocolos proporcionados se han optimizado previamente para evaluar la gravedad de la colitis. Los ratones tratados con DSS son un modelo de inflamación intestinal, que imita los rasgos clínicos e histológicos característicos de la colitis ulcerosa¹². Los ratones modelo de colitis aguda se caracterizan por pérdida de pes...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01 M PBS (powder, pH7.2–7.4)	Solarbio	P1010-2L
Absolute ethyl alcohol	Hushi	64-17-5
Acid alcohol fsat differentiation solution	Beyotime	No.C0163S
Agar	Sangon Biotech	9002-18-0
Ampicillin	Solarbio	69-53-4	Store at 2–8 °C
Anaerobic incubator	Long Yue	LA1-3T
Dextran sulfate sodium salt colitis grade	MP Biomedicals	160110
Electrothermal incubator	SANFA	HP-050A
General purpose tissue fixator	biosharp	BL539A
Glycerinum	Hushi	56-81-5
Hematoxylin and eosin staining kit	Beyotime	No.C0105
Kisser's Mounting Medium	Beyotime	No.C0181
Metronidazole	Solarbio	443-48-1	Store at 2–8 °C
Neomyein sulfate	Solarbio	1405-10-3	Store at 2–8 °C
Oscillating incubator	Shanghai Zhichu	ZQLY-180S
Sodium chloride	Sangon Biotech	7647-14-5
Stool occult blood test paper	Baso	BA2020B
Tryptone	OXOID	2285856
Vancomycin	Solarbio	1404-93-9	Store at 2–8 °C
Xylene	Hushi	1330-20-7
Yeast extract	Sangon Biotech	8013-01-2