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Resumen

Aquí, se presenta un protocolo para realizar y analizar la unión, movilidad y ensamblaje de moléculas individuales en membranas lipídicas artificiales apiñadas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total de molécula única (smTIRF).

Resumen

Las membranas celulares son ambientes muy concurridos para las reacciones biomoleculares y la señalización. Sin embargo, la mayoría de los experimentos in vitro que investigan la interacción de proteínas con lípidos emplean membranas bicapa desnudas. Tales sistemas carecen de las complejidades del hacinamiento por proteínas y glicanos incrustados en la membrana y excluyen los efectos de volumen asociados encontrados en las superficies de la membrana celular. Además, la superficie de vidrio cargada negativamente sobre la que se forman las bicapas lipídicas impide la libre difusión de las biomoléculas transmembrana. Aquí, presentamos una membrana polimérico-lípida bien caracterizada como un imitador de membranas lipídicas abarrotadas. Este protocolo utiliza lípidos conjugados con polietilenglicol (PEG) como un enfoque generalizado para incorporar crowders en la bicapa lipídica soportada (SLB). En primer lugar, se presenta un procedimiento de limpieza de los portaobjetos microscópicos y cubreobjetos para realizar experimentos de una sola molécula. A continuación, se discuten los métodos para caracterizar los PEG-SLB y realizar experimentos de una sola molécula de unión, difusión y ensamblaje de biomoléculas utilizando el seguimiento de una sola molécula y el fotoblanqueo. Finalmente, este protocolo demuestra cómo monitorear el ensamblaje de nanoporos de la toxina formadora de poros bacteriana citolisina A (ClyA) en membranas lipídicas abarrotadas con análisis de fotoblanqueo de una sola molécula. También se incluyen códigos de MATLAB con datasets de ejemplo para realizar algunos de los análisis comunes, como el seguimiento de partículas, la extracción de comportamiento difusivo y el recuento de subunidades.

Introducción

Las membranas celulares son sistemas muy concurridos y complejos1. El hacinamiento molecular puede tener un impacto considerable en la difusión de entidades unidas a la membrana como proteínas y lípidos 2,3,4. Del mismo modo, las reacciones bimoleculares en las membranas lipídicas como la dimerización del receptor o la oligomerización de los complejos de membrana están influenciadas por el hacinamiento 5,6,7. La naturaleza, configuración y concentración de los crowders pueden gobernar la unión a la membrana, la difusividad y la interacción proteína-proteína de varias maneras 8,9. Dado que controlar el apiñamiento de la membrana en las membranas celulares e interpretar su influencia en las biomoléculas incrustadas es un desafío, los investigadores han tratado de establecer sistemas alternativos in vitro 10.

Un enfoque popular para las membranas artificiales apiñadas es dopar las membranas bicapa con lípidos injertados de polímero (como polietilenglicol, PEG)11,12. Durante la visualización de la dinámica de proteínas y lípidos en bicapas lipídicas soportadas (SLB), estos polímeros también protegen los componentes incrustados en la membrana del sustrato subyacente cargado negativamente (como el vidrio) al levantar efectivamente la bicapa lejos del soporte subyacente. Al variar el tamaño y la concentración del polímero, se puede controlar el grado de apiñamiento molecular, así como su separación del soporte sólido subyacente13,14. Esto es claramente una ventaja sobre las bicapas lipídicas soportadas sobre sustratos sólidos sin amortiguadores poliméricos15,16, donde las biomoléculas transmembrana pueden perder su actividad17,18,19. Más importante aún, nos permite recapitular el ambiente abarrotado de la membrana celular in vitro, que es crítico para muchos procesos de membrana.

Los polímeros injertados superficialmente en membranas también sufren cambios en su configuración dependiendo de su densidad de injerto12. A bajas concentraciones, permanecen en una configuración entrópicomente enrollada, conocida como hongo, por encima de la superficie de la membrana. Con el aumento de la concentración, comienzan a interactuar y tienden a desenrollarse y extenderse, produciendo finalmente una densa formación en forma de cepillo en la membrana21. Dado que la transición del régimen de hongo al régimen de cepillo es altamente heterogénea y se manifiesta en condiciones poco caracterizadas del polímero, es importante utilizar condiciones bien caracterizadas para el apiñamiento en membranas injertadas de polímero. En comparación con un estudio reciente20, identificamos e informamos composiciones de membrana abarrotadas que mantienen el transporte difusivo y la actividad de las biomoléculas transmembrana.

En este protocolo, discutimos cómo generar membranas lipídicas pegiladas y proporcionamos recomendaciones para densidades de PEG que imitan el hacinamiento en dos regímenes diferentes de configuración de polímeros (a saber, hongo y cepillo). El protocolo también describe la unión de moléculas individuales, el seguimiento de partículas y la adquisición y análisis de datos de fotoblanqueo para moléculas incrustadas en estas membranas abarrotadas. Primero, describimos los pasos de limpieza a fondo, el ensamblaje de la cámara de imágenes y la generación de PEG-SLB. En segundo lugar, proporcionamos detalles para los experimentos de unión de moléculas individuales, seguimiento de partículas y fotoblanqueo. En tercer lugar, discutimos i) extraer las afinidades de unión relativas, ii) caracterizar la difusión molecular, y iii) contar subunidades en un ensamblaje de proteínas a partir de películas de moléculas individuales en la membrana.

Si bien caracterizamos este sistema con imágenes de una sola molécula, el protocolo es útil para todos los biofísicos de membrana interesados en comprender el efecto del hacinamiento en las reacciones biomoleculares en las membranas lipídicas. En general, presentamos una sólida cartera para hacer bicapas lipídicas abarrotadas y soportadas, junto con varios ensayos de moléculas individuales realizados en ellas y las rutinas de análisis correspondientes.

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Protocolo

1. Limpieza del portaobjetos y del cubreobjetos para experimentos de una sola molécula

  1. Antes del montaje de la cámara de imágenes, limpie y prepare tanto los cubreobjetos como los portaobjetos. Perfore varios pares de agujeros en las guías de vidrio utilizando una máquina perforadora con brocas recubiertas de diamante (0.5-1 mm de diámetro). Si se utilizan láminas de acrílico, utilice un cortador láser para hacer agujeros precisos (0,5 mm), como se muestra en la Figura 1.
    NOTA: Cada par de orificios actuará como una entrada y salida para el intercambio de flujo para una cámara microfluídica individual. Un archivo CAD representativo para agujeros en una diapositiva de acrílico está disponible en Archivo de codificación suplementario 1. Los agujeros perforados en portaobjetos de vidrio generalmente terminan siendo 1.5x-2x más grandes que el tamaño de la broca.
  2. Limpie los portaobjetos y cubreobjetos con detergente. Enjuáguelos bien con agua desionizada. Coloque los portaobjetos y cubreobjetos en un frasco separado para la tinción de diapositivas (Coplin) con agua y sonicate en un sonicador de baño durante 30 minutos. Para todos los pasos de sonicación, utilice un ajuste de potencia de 70 W.
  3. Retire el agua y llene el frasco Coplin que contiene los portaobjetos de vidrio y los cubreobjetos con acetona hasta el borde (50-100 ml dependiendo del volumen del frasco). En el caso de láminas de acrílico, use el mismo volumen de solución de acetona premezclada al 50% (v / v) o de lo contrario los portaobjetos se congelarán. Agite el frasco de Coplin para asegurarse de que todos los portaobjetos y cubreobjetos estén completamente sumergidos en la solución y sonicar en un sonicador de baño durante 30 minutos.
  4. Retire la acetona y deséchela en un recipiente de desechos, vierta metanol en los frascos de Coplin (50%, v / v para portaobjetos de acrílico) y sonicar durante 30 minutos. Tanto la acetona como el metanol se utilizan para eliminar las partículas orgánicas en los portaobjetos.
  5. Enjuague los portaobjetos y cubreobjetos con grandes cantidades de agua tipo 1 y colóquelos en un frasco de vidrio Coplin. Vierta 1 M de solución de KOH en el frasco y sanice durante 1 h. Para las diapositivas de acrílico, utilice 0,5 M de KOH.
  6. Deseche el KOH en un contenedor de residuos inorgánicos. Enjuague el frasco con abundante agua y coloque los frascos de Coplin en una campana extractora para el tratamiento de pirañas. No realice tratamiento con piraña para portaobjetos de acrílico; Continúe directamente con el paso 1.9.
    PRECAUCIÓN: El tratamiento con piraña debe realizarse en una campana extractora con guantes adecuados, gafas de seguridad y un delantal para manipular ácidos. La solución de piraña es un agente oxidante fuerte y elimina cualquier partícula orgánica sobrante de los portaobjetos y cubreobjetos.
  7. Para preparar la solución de piraña, vierta suavemente un volumen de 2/3 de ácido sulfúrico (98%, v / v) en un vaso de precipitados de vidrio y llene el resto con peróxido de hidrógeno (30%, v / v). Mezcle la solución cuidadosamente con una varilla de vidrio, viértala en el frasco de Coplin y deje el frasco de Coplin en la campana extractora durante al menos 1 h.
  8. Decantar la solución de piraña del frasco de Coplin en un recipiente de desecho para residuos ácidos guardados dentro de la campana extractora. Enjuague el frasco de Coplin con una gran cantidad de agua tipo 1.
  9. Seque los portaobjetos y cubreobjetos en una corriente suave de gas nitrógeno y colóquelos en un frasco de Coplin limpio. Los portaobjetos secos y los cubreobjetos ya están listos para el tratamiento con plasma. Tome un par de portaobjetos y cubreobjetos y colóquelos en la máquina de plasma.
  10. Crear un vacío en la cámara. Gire la perilla a la frecuencia de radio de 8-12 MHz para generar plasma en la cámara. Un resplandor púrpura dentro de la cámara indicará la formación de un plasma en la cámara.
  11. Realizar el tratamiento con plasma durante 8-10 min. Suelte suavemente el vacío después de apagar el plasma y continúe con el paso 2 para ensamblar la cámara de imágenes microfluídicas.

2. Montaje de la cámara microfluídica

NOTA: La cámara de imágenes se crea intercalando cinta adhesiva de doble cara entre un cubreobjetos previamente limpiado y una diapositiva del paso anterior como se describe a continuación.

  1. Ensamble los portaobjetos y el cubreobjetos después del tratamiento con plasma, como se muestra en la Figura 1. Coloque el portaobjetos de vidrio sobre un pañuelo de papel limpio. Corte la cinta de doble cara en tiras de ~ 2-3 mm de ancho y colóquelas a cada lado de un par de agujeros en el portaobjetos de vidrio. Use una punta de pipeta para aplanar la cinta o causará fugas de un canal a otro.
    NOTA: Alternativamente, corte la cinta para toda la diapositiva utilizando un cortador láser o trazador automático (Figura 1).
  2. Coloque el cubreobjetos tratado con plasma en el portaobjetos con cinta adhesiva para cerrar la cámara. Use una punta de pipeta para presionar suavemente el cubreobjetos sobre las regiones pegadas con cinta adhesiva para que el canal sea hermético.
  3. Si usa portaobjetos de vidrio, selle los bordes con resina epoxi. Finalmente, cada cámara de imágenes hecha de un portaobjetos y un cubreobjetos tiene una dimensión de 10 mm x 2 mm x 0,1 mm (longitud x anchura x profundidad). Conservar las cámaras de imágenes microfluídicas preparadas durante 1-2 semanas en condiciones de desecación (preferiblemente entre 10-25 °C).
    NOTA: Para las cintas cortadas con láser utilizadas con portaobjetos acrílicos, no es necesario usar epoxi ya que los bordes de la cinta forman un sello hermético a prueba de fugas.

3. Fabricación de bicapas soportadas sobre sustrato de vidrio mediante fusión de vesículas

NOTA: Las bicapas lipídicas soportadas apiñadas se generan en las paredes de la cámara de imagen mediante la fusión de vesículas lipídicas preparadas con lípidos PEG dopados.

  1. Tome un vial de vidrio limpio, preferiblemente prelimpiado con solución de pirana. Añadir solución de cloroformo de 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) y 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] (DOPE-PEG2000) a la fracción molar deseada de lípidos PEG2000 de tal manera que la concentración final después de añadir tampón sea de 3 mM de lípidos en el paso 3.4. Prepare otras composiciones de membrana de lípidos de manera similar.
  2. Seque el cloroformo del vial con una corriente suave de nitrógeno con un pequeño remolino para que los lípidos secos se cubran uniformemente en la superficie del vial. Coloque el vial en un desecador al vacío durante 1 h. Esto eliminará cualquier cloroformo residual en el vial de vidrio. Añadir 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) e incubar durante la noche a 37 °C.
  3. Prepare pequeñas vesículas unilamelares (SUV) como se describe a continuación.
    1. Realice un vórtice suave durante 1-2 minutos después de la incubación nocturna hasta que la solución se vuelva turbia y lechosa.
    2. Tome 100 μL de esta solución en un pequeño tubo centrífugo de 500 μL y sonicar durante aproximadamente 1 h en un sonicador de baño (ajustado a un ajuste de potencia de 70 W). La solución será clara; Si no, entonces Sonicate por 30 minutos adicionales. Este paso generará SUVs de 50-100 nm de diámetro.
      NOTA: Si se prepara por primera vez, caracterice los SUV utilizando la dispersión dinámica de luz22,23 (DLS) o un método equivalente.
  4. Añadir cloruro de calcio (CaCl2, 3 M stock) a las vesículas sonicadas de tal manera que su concentración final sea de 30 mM en la solución lipídica.
  5. Corte una punta de micropipeta para inyectar la solución de muestra de manera que encaje firmemente en el orificio. Mezcle la solución lipídica e inyecte a través de uno de los orificios de la cámara de imágenes realizada en el paso 2. Limpie el exceso de solución que sale de la cámara desde la salida con un pañuelo limpio para evitar la contaminación de los canales adyacentes.
  6. Deje este conjunto en una cámara humidificada durante 90 min. Prepare una cámara de humidificación colocando un pañuelo húmedo en el extremo de un tubo de centrífuga de 50 ml. Coloque el portaobjetos hacia los lados dentro del tubo con las tapas del tubo cerradas. Las vesículas se fusionarán y generarán una bicapa uniforme en la superficie del vidrio.
  7. Lave bien la cámara con una cantidad copiosa de tampón PBS (aproximadamente 5 veces el volumen de la cámara de imágenes). Evite la entrada de burbujas de aire en la cámara durante el lavado ya que esto puede generar defectos en la membrana.

4. Configuración del microscopio y mediciones de imágenes de partículas individuales

NOTA: Los experimentos de una sola molécula se llevan a cabo en una configuración de microscopio de fluorescencia de reflexión interna total24,25,26 (TIRF) basada en objetivos (Figura 2). Las imágenes TIRF proporcionan una mejor relación señal-ruido para imágenes de una sola molécula, aunque los microscopios de epifluorescencia también se pueden usar bajo ciertas condiciones (especialmente cuando las biomoléculas fluorescentes se pueden eliminar de la solución a granel mediante lavado). Se puede utilizar el TIRF de tipo prisma, pero el tipo objetivo es preferible por la facilidad de configuración de la microfluídica27. Para TIRF de tipo objetivo, se recomienda un objetivo de apertura numérica alta (aumento de 100x, generalmente disponible comercialmente como objetivo TIRF).

  1. Antes de realizar cualquier experimento sobre movilidad y montaje, alinee el microscopio TIRF para garantizar una relación señal-ruido óptima debido a la iluminación del campo evanescente. Durante la alineación, mantenga la potencia del láser baja, entre 100 μW y 1 mW.
    PRECAUCIÓN: Se deben usar gafas de seguridad láser durante la alineación del rayo láser.
    1. Para alinear el microscopio, prepare una muestra de perlas fluorescentes agregándolas al canal microfluídico a bajas concentraciones (a ~100 pM) de modo que las manchas fluorescentes de cuentas individuales no se superpongan en las imágenes.
    2. Primero, visualice las cuentas en modo de epifluorescencia. Mientras la iluminación está en modo de epifluorescencia, mueva la etapa de traslación del espejo M5 (el espejo que refleja el láser al dicroico) de tal manera que el haz que sale del objetivo se doble hasta que finalmente esté en una configuración de reflexión interna total.
    3. Verifique si se ha logrado la iluminación TIR. Cuando el campo evanescente TIR esté iluminando la muestra de cuentas, compruebe que solo las cuentas de la superficie son visibles y que no se observan cuentas flotantes lejos de la superficie.
  2. Al comienzo del experimento, ajuste la potencia del láser en el plano focal posterior del objetivo a 5-10 mW para evitar la fotodestrucción (fotoblanqueo) de los fluoróforos.
  3. Mantenga el portaobjetos en la etapa del microscopio y concéntrese primero en la membrana desnuda (sin fluoróforos). Por lo general, pequeños rastros de impurezas en las membranas lipídicas son suficientes para hacer esto. Opcional: Incorpore un pequeño número de perlas fluorescentes o puntos cuánticos (rango subpicomolar) durante el paso 3.1, de modo que solo estén presentes de dos a cinco partículas fluorescentes en el campo de visión para facilitar la identificación del enfoque correcto.
  4. Inyectar la muestra (proteínas de membrana, etc.) con una micropipeta en la cámara de imagen recubierta de PEG-SLB realizada en el paso 3.7.
  5. Para medir la cinética de unión de una sola molécula, use una bomba de jeringa para hacer fluir las biomoléculas marcadas a través de los orificios de entrada hacia la cámara microfluídica (Figura 3). Utilice un caudal de 50-500 μL/min.
    1. Inicie la adquisición de películas antes de agregar la solución a la cámara de imágenes. Adquiera >5.000 fotogramas a una velocidad de fotogramas de 25-50 fotogramas/s bajo flujo continuo hasta que no haya un aumento adicional en la aparición de nuevas manchas en la superficie de la membrana (Video 1). Para el análisis de la cinética de unión, siga los pasos de 6.1.
  6. Para el seguimiento de una sola partícula, agregue las biomoléculas marcadas a bajas concentraciones (en comparación con la constante de unión) al canal utilizando una micropipeta. Optimice la concentración a una densidad de <0.1 partículas/μm 2 para que las partículas individuales rara vez se crucen (Video 2). Esto garantiza la alta fidelidad de las pistas recuperadas de los conjuntos de datos. Incubar si es necesario (en caso de mala unión a la membrana por biomoléculas, ~ 10 min) en un ambiente humidificador y lavar la cámara con el tampón.
    NOTA: El lavado es necesario en caso de que la unión sea deficiente en la membrana y la mayoría de las moléculas fluorescentes permanezcan en la solución. De lo contrario, esto puede interferir con las imágenes y dar lugar a una mala relación señal-ruido.
  7. Para el análisis de trayectoria de una sola partícula, adquiera 200-500 fotogramas a 10-100 fotogramas/s. Mantenga la lente del objetivo enfocada en el plano bicapa con una deriva mínima de la etapa durante el intervalo de adquisición.

5. Adquisición de imágenes para contar subunidades en un ensamblaje de proteínas

NOTA: La adquisición de imágenes para estimar la estequiometría requiere el blanqueo continuo de los fluoróforos y la detección del número de pasos hasta que no haya más fluoróforos que emitan fluorescencia.

  1. Para medir subunidades, agregue la concentración relevante de biomoléculas marcadas (ejemplo: ver resultados; ClyA se añadió a una concentración de 25 nM) a la cámara de imágenes microfluídicas e incubar (lavar si es necesario). Incubar el portaobjetos en una cámara de humidificación a la temperatura deseada durante el tiempo requerido (ejemplo: 37 °C y 60 min para el montaje de ClyA).
  2. Realice la adquisición de imágenes para fotoblanqueo de una sola molécula como se describe a continuación.
    1. Lave la cámara de imágenes con un tampón antes de obtener imágenes (si es necesario). Coloque el portaobjetos en el microscopio y ajuste el enfoque para visualizar las moléculas etiquetadas.
    2. Ajuste la potencia del láser a un nivel en el que el blanqueamiento del fluoróforo se produzca gradualmente (~ 1-5 min). Idealmente, para cada biomolécula ensamblada, mantenga la tasa de paso de fotoblanqueo >10-20 fotogramas de imagen separados. Adquirir las imágenes hasta que todas las moléculas estén completamente fotoblanqueadas (Video 3).
      NOTA: Para determinar la duración total de la trayectoria de fotoblanqueo requerida, trace la intensidad promedio de los puntos individuales con el número de fotogramas de imagen y determine la constante de tiempo ajustando una función de decaimiento exponencial. La duración total de la adquisición se puede establecer en 5-10 veces la constante de tiempo.
  3. Realice una medición de ensamblaje dependiente del tiempo iniciando la adquisición de películas tan pronto como la muestra se introduzca en la cámara y adquiriendo nuevas películas de fotoblanqueo a intervalos de tiempo fijos después de la unión a la membrana de diferentes segmentos del PEG-SLB.

6. Análisis de imágenes y datos

  1. Realice el enlace y el seguimiento de una sola partícula como se describe a continuación.
    1. Extraiga trayectorias de partículas individuales de las películas adquiridas anteriormente, como se muestra en la Figura 4. Para detectar partículas individuales y rastrearlas, utilice el paquete de MATLAB, u-track28, o el Trackmate29, un complemento en ImageJ, que también proporciona un robusto algoritmo de seguimiento de partículas individuales. Siga los pasos para configurar el análisis u-track como se muestra en el archivo complementario 1.
      NOTA: Los parámetros críticos para el seguimiento de una sola partícula son la desviación estándar del tamaño de partícula (en píxeles) y la longitud de cierre de la brecha. Utilice 1 y 0, respectivamente, para estos parámetros como los criterios más estrictos para el seguimiento.
    2. Para calcular las constantes de velocidad de enlace, primero estime el número de partículas que se unen a la superficie de la membrana a lo largo del tiempo. Utilice el archivo MATLAB binding_SPT (Supplementary Coding File 2) con la carpeta de salida u-track para identificar y trazar el número de partículas que aparecen en la membrana obtenida del paso 6.1. Ajuste la cinética observada a los modelos cinéticos apropiados (ejemplo: ajuste exponencial único para determinar la constante de tiempo, cuya inversa puede asignarse a la constante de velocidad aparente)30 para extraer las constantes de velocidad (ver resultados, Figura 5).
    3. El desplazamiento cuadrático medio (MSD) de las partículas difusoras (como el trazador de ADN en PEG-SLB, Figura 6) indica la naturaleza de la difusión. Utilice el paquete MATLAB MSD_ISD (Supplementary Coding File 2) con la carpeta de salida u-track para obtener la gráfica MSD en función del tiempo de retraso (Figura 6B).
    4. Para identificar especies difusoras heterogéneas, calcule las distribuciones de desplazamiento cuadrático instantáneo (ISD) como se muestra en la Figura 6C. ISD2, definido como (X t+τ - X t)2 + (Yt+τ− Yt)2, donde se prefiere el tiempo de retraso, τ = 2, ya que reduce el ruido. Filtra trayectorias cortas con menos de tres fotogramas para reducir el ruido.
    5. Utilice ISD_analyzer (Supplementary Coding File 2) en MATLAB con la salida u-track para trazar los ISD de las partículas rastreadas (Figura 6C).
  2. Realice un análisis de fotoblanqueo de una sola molécula como se describe a continuación.
    1. Para estimar la estequiometría de los complejos de membrana, realice un análisis de fotoblanqueo sobre las intensidades dependientes del tiempo de los complejos fluorescentes (Video 3). Para ello, aplique un algoritmo de corrección de deriva (drift_correct_images, Supplementary Coding File 2) basado en la autocorrelación de fotogramas de película para extraer la deriva de traslación. Esto supone que las estructuras ensambladas son en gran medida inmóviles durante la adquisición de imágenes. Ejecute el paquete de MATLAB Extract_traces_1C (Supplementary Coding File 2) para detectar trazas de tiempo de intensidad de partículas de las películas.
    2. Utilice el código de MATLAB Stepcount_immobile (Supplementary Coding File 2) para realizar la detección de pasos para los seguimientos de tiempo de intensidad. En caso de que las partículas no estén inmóviles, use el paquete u-track para extraer la ubicación de las partículas en movimiento. Este conjunto de coordenadas xy se puede asignar a las películas en bruto para extraer los valores de intensidad de la partícula en movimiento a medida que se difunde lateralmente en la membrana. Utilice el paquete MATLAB utrack_Int (Supplementary Coding File 2) con la salida del análisis u-track para esta opción.
    3. Realizar una corrección para el etiquetado incompleto de las biomoléculas con etiquetas fluoróforas para estimar la estequiometría correcta del complejo proteico. Determine la eficiencia del etiquetado con un espectrofotómetro UV-VIS midiendo la absorción de colorante y proteína para estimar la concentración. Calcule la eficiencia del etiquetado como la relación molar entre el tinte y la proteína.
      NOTA: Algunos colorantes también absorben en longitudes de onda cercanas a 280 nm y, por lo tanto, esta contribución de absorción por el tinte debe tenerse en cuenta durante el cálculo de la concentración.
    4. Realice una corrección binomial para tener en cuenta la eficiencia de etiquetado incompleta del fluoróforo de la siguiente manera utilizando el código de MATLAB Step_correction (Supplementary Coding File 2) con los datos obtenidos del recuento de pasos en el paso 6.2.2. Por ejemplo, para una toxina formadora de poros como la citolisina A, que forma una estructura dodecamérica en forma de anillo, aplique una corrección binomial utilizando la siguiente fórmula:
      nkfigure-protocol-21709
      donde figure-protocol-21807 = eficiencia de etiquetado, n = número de pasos de fotoblanqueo y s = recuentos reales. Utilice la rutina de MATLAB Stepcount_immobile para recuperar las especies oligoméricas corregidas. Convertir la frecuencia de oligómeros (si) en fracciones de masa (Figura 7C; Archivo de codificación complementario 2).
      NOTA: Un conjunto de archivos analizados de seguimiento se incluyen en el archivo de codificación suplementario 3. Los códigos de MATLAB en Supplementary Coding File 2 se pueden ejecutar con estos conjuntos de datos.

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Resultados

Monitorización de la unión de la proteína ClyA en membranas PEGiladas
Después del paso 4.5, la cinética de unión se estima trazando el número de partículas que se unen a la superficie de la membrana a lo largo del tiempo (Video 1). A medida que la proteína ClyA se une a una membrana con 5 lípidos mol% PEG2000, la densidad de partículas aumenta y alcanza la saturación (Figura 5). Un ajuste de decaimiento exponencial a las partículas unidas (c?...

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Discusión

Aquí, demostramos experimentos de una sola molécula en bicapas lipídicas soportadas (SLB) que manifiestan un ambiente abarrotado para biomoléculas incrustadas en membrana. El ambiente hacinado genera un efecto de volumen excluido, lo que lleva a la mejora de las reacciones biomoleculares 1,2,39,40. Para el sistema PEG-lipídico, donde el polímero ocupa principalmente el volumen fuera de la...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores reconocen al Prof. Benjamin Schuler por compartir el plásmido de expresión de la proteína ClyA. Este trabajo fue apoyado por Human Frontier Science Program (RGP0047-2020).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2.5 ml SyringesHMD HealthcareDispo Van, 2.5 ml TuberculinPlastic syringe
AcetoneFinar Chemicals10020LL025
Acrylic Sheet2 mm thick
Acrylic SheetBigiMall2 mm, Clear
Bath SonicatorBransonCPX-1800
Calcium Chloride
ChloroformSigma528730 HPLC grade
CholesterolAvanti700100
Coplin JarDuran Wheaton KimbleS60168 Slide Jar with Glass Cover
CoverslipsVWR631-157424 mm X 50 mm
Cy3-DNA StrandIDTGCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3)Cytiva Life SciencesPA23001
DiIInvitrogenD3911Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1Sigma AldrichGCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2Sigma AldrichCGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol StrandBiomersToco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000Avanti8801301,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape3MLF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated)0.5 - 1 mm
Drilling MachineDremel220Workstation
EMCCDAndorDU-897U-CS0-#BV
Fluorescence BeadsInvitrogenF10720
Glass SlidesBlue StarMicro Slides, PIC-1
Glass VialsSigma854190
Hydrogen PeroxideLobachemie0018230% Solution, AR Grade
LaboleneThermo-Fischer Scientific Detergent
Laser 532 nmCoherentSapphire
Laser CutterUniversal Laser SystemsILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPEAvanti8101501,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
MethanolFinar Chemicals30932LL025
MicroscopeOlympusIX81
Phosphate Buffer Saline (PBS)1X
Plasma CleanerHarrick Plasma IncPDC-002
POPCAvanti8504571-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe PumpNew Era Pump SystemsNE1010High Pressure Syringe Pump
PTFE CapsSigma27141
PTFE TubingCole-ParmerWW-06417-21Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric AcidSD Fine Chemicals98%, AR Grade
TIRF ObjectiveOlympusUPLAPO100XOHR
Vacuum DesiccatorTarsons
Vortex MixerTarsons

Referencias

  1. Löwe, M., Kalacheva, M., Boersma, A. J., Kedrov, A. The more the merrier: Effects of macromolecular crowding on the structure and dynamics of biological membranes. The FEBS Journal. 287 (23), 5039-5067 (2020).
  2. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  3. Horton, M. R., Höfling, F., Rädler, J. O., Franosch, T. Development of anomalous diffusion among crowding proteins. Soft Matter. 6 (12), 2648-2656 (2010).
  4. Jeon, J. H., Javanainen, M., Martinez-Seara, H., Metzler, R., Vattulainen, I. Protein crowding in lipid bilayers gives rise to non-Gaussian anomalous lateral diffusion of phospholipids and proteins. Physical Review X. 6 (2), 021006(2016).
  5. Zhang, Y., et al. The influence of molecular reach and diffusivity on the efficacy of membrane-confined reactions. Biophysical Journal. 117 (7), 1189-1201 (2019).
  6. Loverdo, C., Bénichou, O., Moreau, M., Voituriez, R. Enhanced reaction kinetics in biological cells. Nature Physics. 4 (2), 134-137 (2008).
  7. Monine, M. I., Haugh, J. M. Reactions on cell membranes: Comparison of continuum theory and Brownian dynamics simulations. Journal of Chemical Physics. 123 (7), 074908(2005).
  8. Berry, H. Anomalous diffusion due to hindering by mobile obstacles undergoing Brownian motion or Orstein-Ulhenbeck processes. Physical Review E. 89 (2), 22708(2014).
  9. Saxton, M. J. Anomalous diffusion due to obstacles: A Monte Carlo study. Biophysical Journal. 66 (2), 394-401 (1994).
  10. Andersson, J., Fuller, M. A., Wood, K., Holt, S. A., Köper, I. A tethered bilayer lipid membrane that mimics microbial membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (18), 12958-12969 (2018).
  11. Kaufmann, S., Papastavrou, G., Kumar, K., Textor, M., Reimhult, E. A detailed investigation of the formation kinetics and layer structure of poly(ethylene glycol) tether supported lipid bilayers. Soft Matter. 5 (14), 2804-2814 (2009).
  12. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  13. Labouta, H. I., et al. Surface-grafted polyethylene glycol conformation impacts the transport of PEG-functionalized liposomes through a tumour extracellular matrix model. RSC Advances. 8 (14), 7697-7708 (2018).
  14. Lee, H., Larson, R. G. Adsorption of plasma proteins onto PEGylated lipid bilayers: The effect of PEG size and grafting density. Biomacromolecules. 17 (5), 1757-1765 (2016).
  15. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  16. Andersson, J., et al. Solid-supported lipid bilayers - A versatile tool for the structural and functional characterization of membrane proteins. Methods. 180, 56-68 (2020).
  17. Duncan, A. L., et al. Protein crowding and lipid complexity influence the nanoscale dynamic organization of ion channels in cell membranes. Scientific Reports. 7 (1), 1-15 (2017).
  18. Garenne, D., Libchaber, A., Noireaux, V. Membrane molecular crowding enhances MreB polymerization to shape synthetic cells from spheres to rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 1902-1909 (2020).
  19. Pollock, N. L., Lee, S. C., Patel, J. H., Gulamhussein, A. A., Rothnie, A. J. Structure and function of membrane proteins encapsulated in a polymer-bound lipid bilayer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (4), 809-817 (2018).
  20. Coker, H. L. E., et al. Controlling anomalous diffusion in lipid membranes. Biophysical Journal. 116 (6), 1085-1094 (2019).
  21. Rex, S., Zuckermann, M. J., Lafleur, M., Silvius, J. R. Experimental and Monte Carlo simulation studies of the thermodynamics of polyethyleneglycol chains grafted to lipid bilayers. Biophysical Journal. 75 (6), 2900-2914 (1998).
  22. Hallett, F. R., Watton, J., Krygsman, P. Vesicle sizing number distributions by dynamic light scattering. Biophysical Journal. 59 (2), 357-362 (1991).
  23. Jin, A. J., Huster, D., Gawrisch, K., Nossal, R. Light scattering characterization of extruded lipid vesicles. European Biophysics Journal. 28 (3), 187-199 (1999).
  24. Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
  25. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. 50 (1), 1-13 (2009).
  26. Fiolka, R., Belyaev, Y., Ewers, H., Stemmer, A. Even illumination in total internal reflection fluorescence microscopy using laser light. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 45-50 (2008).
  27. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  28. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  29. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  30. Jarmoskaite, I., Alsadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, 57264(2020).
  31. Sathyanarayana, P., et al. Cholesterol promotes Cytolysin A activity by stabilizing the intermediates during pore formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7323-7330 (2018).
  32. Mueller, M., Grauschopf, U., Maier, T., Glockshuber, R., Ban, N. The structure of a cytolytic alpha-helical toxin pore reveals its assembly mechanism. Nature. 459 (7247), 726-730 (2009).
  33. Hubicka, K., Janczura, J. Time-dependent classification of protein diffusion types: A statistical detection of mean-squared-displacement exponent transitions. Physical Review E. 101 (2), 1-13 (2020).
  34. Kepten, E., Weron, A., Sikora, G., Burnecki, K., Garini, Y. Guidelines for the fitting of anomalous diffusion mean square displacement graphs from single particle tracking experiments. PLoS ONE. 10 (2), 0117722(2015).
  35. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  36. McGuire, H., Aurousseau, M. R. P., Bowie, D., Blunck, R. Automating single subunit counting of membrane proteins in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35912-35921 (2012).
  37. Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. The Journal of General Physiology. 141 (6), 737-746 (2013).
  38. Zhang, H., Guo, P. Single molecule photobleaching (SMPB) technology for counting of RNA, DNA, protein and other molecules in nanoparticles and biological complexes by TIRF instrumentation. Methods. 67 (2), 169-176 (2014).
  39. Phillip, Y., Schreiber, G. Formation of protein complexes in crowded environments-From in vitro to in vivo. FEBS Letters. 587 (8), 1046-1052 (2013).
  40. Mittal, S., Chowhan, R. K., Singh, L. R. Macromolecular crowding: Macromolecules friend or foe. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1850 (9), 1822-1831 (2015).
  41. Mashaghi, S., van Oijen, A. M. A versatile approach to the generation of fluid supported lipid bilayers and its applications. Biotechnology and Bioengineering. 111 (10), 2076-2081 (2014).
  42. Wong, W. C., et al. Characterization of single-protein dynamics in polymer-cushioned lipid bilayers derived from cell plasma membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6492-6504 (2019).
  43. Shashkova, S. S., Leake, M. C. Single-molecule fluorescence microscopy review: Shedding new light on old problems. Bioscience Reports. 37 (4), 20170031(2017).
  44. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047(2012).
  45. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  46. Carter, B. C., Vershinin, M., Gross, S. P. A comparison of step-detection methods: How well can you do. Biophysical Journal. 94 (1), 306-319 (2008).
  47. Otsuka, S., Ellenberg, J. Mechanisms of nuclear pore complex assembly - Two different ways of building one molecular machine. FEBS Letters. 592 (4), 475(2018).
  48. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Pressé, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  49. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Enumerating high numbers of fluorophores from photobleaching experiments: A Bayesian nonparametrics approach. bioRxiv. , (2020).
  50. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Diffraction-limited molecular cluster quantification with Bayesian nonparametrics. Nature Computational Science. 2 (2), 102-111 (2022).
  51. Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).

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