Análisis de la autofagia inducida por inanición en el cuerpo graso larvario de Drosophila melanogaster

Resumen

El presente protocolo describe la inducción de autofagia en el cuerpo graso larvario de Drosophila melanogaster a través del agotamiento de nutrientes y analiza los cambios en la autofagia utilizando cepas de moscas transgénicas.

Resumen

La autofagia es un proceso de autodigestión celular. Entrega carga a los lisosomas para su degradación en respuesta a diversas tensiones, incluida la inanición. El mal funcionamiento de la autofagia se asocia con el envejecimiento y múltiples enfermedades humanas. La maquinaria de autofagia está altamente conservada, desde la levadura hasta los humanos. El cuerpo graso larval de Drosophila melanogaster, un análogo para el hígado de vertebrados y el tejido adiposo, proporciona un modelo único para monitorear la autofagia in vivo. La autofagia puede ser fácilmente inducida por la falta de nutrientes en el cuerpo de grasa larval. La mayoría de los genes relacionados con la autofagia se conservan en Drosophila. Se han desarrollado muchas cepas de moscas transgénicas que expresan marcadores de autofagia marcados, lo que facilita el monitoreo de diferentes pasos en el proceso de autofagia. El análisis clonal permite una comparación cercana de los marcadores de autofagia en células con diferentes genotipos en la misma pieza de tejido. El protocolo actual detalla los procedimientos para (1) generar clones somáticos en el cuerpo graso de la larva, (2) inducir la autofagia a través de la inanición de aminoácidos y (3) diseccionar el cuerpo graso de la larva, con el objetivo de crear un modelo para analizar las diferencias en la autofagia utilizando un marcador autofagosómico (GFP-Atg8a) y análisis clonal.

Introducción

La autofagia es un proceso de "autoalimentación" inducido por diversas tensiones, incluida la inanición de aminoácidos¹. La macroautofagia (en adelante autofagia) es el tipo de autofagia mejor estudiado y desempeña un papel insustituible en el mantenimiento de la homeostasis celular². El mal funcionamiento de la autofagia está asociado con varias enfermedades humanas³. Además, algunos genes relacionados con la autofagia son dianas potenciales para el tratamiento de diversas enfermedades⁴.

La autofagia está regulada de una manera altamente sofisticada⁵. Tras la inanición, las membranas de aislamiento secuestran materiales citoplasmáticos para formar autofagosomas de doble membrana⁶. Los autofagosomas luego se fusionan con endosomas y lisosomas para formar anfisomas y autolisosomas. Con la ayuda de enzimas hidrolíticas lisosomales, los contenidos citoplasmáticos engullidos se degradan y los nutrientes se reciclan⁷.

La autofagia es un proceso evolutivamente conservado⁸. Drosophila melanogaster es un gran modelo para estudiar el proceso de autofagia in vivo. La inanición de aminoácidos induce fácilmente la autofagia en el tejido corporal graso de la mosca, un análogo del hígado humano y el tejido adiposo⁹. Los defectos en la autofagia interrumpen los distintos patrones de puncta de varias proteínas relacionadas con la autofagia, como Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 y p62, entre otras¹⁰. Por lo tanto, el análisis de los patrones de estos marcadores de autofagia ayudará a discernir la aparición de defectos de autofagia y el paso de autofagia defectuosa. Por ejemplo, la proteína similar a la ubiquitina Atg8 es el marcador de autofagia más utilizado¹¹. En Drosophila melanogaster, se han desarrollado con éxito cepas transgénicas con una proteína verde fluorescente (GFP) Atg8a¹². GFP-Atg8a se difunde en el citosol y los núcleos de las células alimentadas. Tras la inanición, GFP-Atg8a es procesada y modificada por fosfatidiletanolamina (PE) y forma puncta, que marca las membranas de aislamiento y los autofagosomas completamente desarrollados^13,14. A través de la microscopía de fluorescencia directa, la inducción de autofagia puede ser fácilmente observada como un aumento en la formación de GFP-Atg8 puncta¹⁵. Atg8a punto no se formaría en respuesta a la inanición en presencia de un defecto de iniciación de la autofagia. Como GFP-Atg8a puede ser enfriado y digerido por el bajo pH en los autolisosomas, GFP-Atg8a puncta puede aumentar en número si la autofagia se bloquea en las últimas etapas¹⁶.

Como la autofagia es altamente sensible a la disponibilidad nutricional¹⁷, ligeras diferencias en las condiciones de cultivo a menudo conducen a variaciones en los fenotipos. Por lo tanto, el análisis clonal, un método que analiza células mutantes versus células de control de tipo salvaje en el mismo tejido, tiene una gran ventaja en la disección de defectos de autofagia¹⁸. Aprovechando la recombinación específica del sitio mediada por el objetivo de reconocimiento flippasa / flippase (FLP / FRT) entre cromosomas homólogos, las moscas que transportan tejidos en mosaico se hacen fácilmente^19,20. Las células de tipo salvaje que rodean a las células mutantes forman un control interno perfecto para evitar diferencias individuales²¹.

El presente estudio describe cómo inducir la autofagia por inanición de aminoácidos y generar tejidos corporales de grasa en mosaico que expresan GFP-Atg8a. Estos protocolos se pueden utilizar para analizar las diferencias en la autofagia entre clones mutantes.

Protocolo

1. Cruce de Drosophila y puesta de huevos

1. Introducir 3 moscas adultas macho (genotipo hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) y 15 hembras (genotipo y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP ) (ver Tabla de materiales) en un vial de cultivo (con harina de maíz/melaza/agar Drosophila media estándar a 25 °C) para su apareamiento.
   NOTA: Se deben configurar múltiples viales de cultivo de la misma cruz para asegurar suficientes larvas para experimentos adicionales. La cepa de mosca macho con genotipo hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a lleva un sitio FRT en el cromosoma X cerca del centrómero (FRT19A). También expresa FLP en caso de choque térmico a 37 °C. Un transgén con expresión ubicua de RFP se inserta en el cromosoma X. GFP-Atg8a se expresa bajo el control de cgGal4 en el cuerpo graso larvario²². La cepa de mosca hembra con genotipo y ' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP porta una mutación letal (Mu) y FRT19A en el cromosoma X. El esquema de cruce detallado se muestra en la Figura 1.
2. Para la puesta de huevos, transfiera las moscas a un nuevo vial de cultivo. A las 48 h después de la introducción, toque el vial de "apareamiento" hasta que las moscas estén aturdidas y deslícese sobre el medio en la base del vial.
   1. Desenchufe el vial de "apareamiento" y cúbrale la boca con un vial invertido desenchufado con medios frescos (vial de cultivo fresco). Luego, transfiera las moscas al vial de cultivo fresco volteando y golpeando los viales.
   2. Tapar el vial de cultivo fresco (con las moscas transferidas) y desechar el vial de cultivo viejo. Coloque este vial de cultivo fresco en una incubadora a 25 °C para la puesta de huevos en el medio fresco.
      NOTA: Precalentar los viales de cultivo fresco a 25 °C durante 15 minutos antes del proceso de transferencia de moscas ayudará a las moscas a adaptarse rápidamente al nuevo entorno y acelerará la puesta de huevos.
3. Retire las moscas después de 6 h de puesta de huevos. Si es necesario repetir los experimentos, transfiera estas moscas a otro vial de cultivo (como se describe en el paso 1.2). De lo contrario, deseche las moscas vertiéndolas en un matraz que contenga 75% de etanol).
   1. Incubar el vial con embriones en un baño maría a 37 °C durante 1 h para inducir la expresión de FLP. Posteriormente, colóquelos en una incubadora a 25 °C y permita que los embriones continúen desarrollándose.
      NOTA: La formación exitosa de clones mutantes se puede confirmar posteriormente a través de imágenes. La ausencia de señales RFP marca los clones mutantes.

2. La inanición de aminoácidos induce autofagia

1. Usando una espátula de laboratorio, saque los medios que contienen las larvas en desarrollo en una placa de Petri 75 h después de la puesta de huevos. Agregue 3 ml de 1x PBS al plato y separe suavemente los medios de cultivo y las larvas con pinzas largas. Seleccione de 10 a 15 larvas tempranas del tercer estadio.
   NOTA: Las larvas tempranas del tercer estadio deben elegirse cuidadosamente. La etapa de desarrollo de las larvas es crítica para el éxito de este protocolo. Debido a la duración restringida de la puesta de huevos, se espera que la mayoría de las larvas en el vial de cultivo estén en la etapa temprana del tercer estadio a las 75 h de incubación. Sin embargo, diferentes recetas de medios de cultivo pueden conducir a variaciones en el momento del desarrollo de las larvas. Los criterios para distinguir las larvas tempranas del tercer estadio son la longitud del cuerpo, la presencia de espiráculos anteriores y posteriores, así como los ganchos mandibulares del aparato bucal²³.
2. Llene los pocillos de una placa puntual de depresión de vidrio de 9 pocillos (consulte la Tabla de materiales) con 1x PBS. Coloque las larvas separadas del tercer estadio en los pozos usando pinzas largas y lave bien las larvas para eliminar todos los residuos de medios.
3. Tome 5 ml de solución de sacarosa al 20% (en 1x PBS) en un vial vacío y coloque las larvas limpias del tercer estadio en esta solución usando fórceps largos. Incubar este vial en una incubadora a 25 °C durante 6 h antes de cosecharlos para la disección.
   NOTA: La solución de sacarosa al 20% (en 1x PBS) sirve como medio de inanición deficiente en aminoácidos.

3. Disección de larvas del tercer estadio y procesamiento de muestras de tejido

1. Afile dos pares de pinzas #5 (ver Tabla de materiales) uniformemente en ambos lados con una piedra de afilar.
2. Agregue 400 μL de 1x PBS en cada pocillo de la placa puntual de depresión de vidrio de 9 pocillos y transfiera las larvas a los pocillos con pinzas largas. Coloque una larva en un pozo con el lado dorsal (el lado con la tráquea) hacia arriba.
   1. Agarre la cutícula de la larva con dos pinzas # 5 en el medio del tronco larval y abra suavemente las cutículas. Los cuerpos grasos expuestos, junto con otros tejidos internos larvales, todavía estarán unidos a la carcasa de la larva. Tire lo suficiente para exponer los órganos internos tanto como sea posible. Repita este paso para todas las larvas.
      NOTA: Cada larva tiene dos grandes pedazos de cuerpo gordo a lo largo del tronco del cuerpo. El tejido corporal graso es una monocapa blanca, opaca y plana que se puede distinguir fácilmente bajo el microscopio de disección²⁴.
3. Transfiera la canal larvaria a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga 500 μL de paraformaldehído (PFA) al 4%. Incubar durante 30 min a 25 °C sin agitar los tubos.
   PRECAUCIÓN: El PFA al 4% es tóxico. Use guantes y máscaras para protegerse.
   NOTA: Se recomienda preparar PFA al 4% en 1x tampón PBS. El polvo de PFA no se disuelve en 1x PBS al instante. Por lo tanto, la mezcla debe incubarse a 65 °C en una incubadora durante la noche o agitarse intermitentemente durante 45 min a 25 °C.
4. Después de 30 minutos de incubación de la canal con PFA al 4%, pipetear la solución de PFA, agregar 500 μL de 1x PBS en el tubo y agitar suavemente el tubo en un rotador plano durante 10 minutos antes de desechar la solución 1x PBS (repetir 3x).
5. Usando fórceps largos, transfiera la canal larval fija y lavada a un pocillo en la placa de 9 depresiones llena de 1x PBS. Usando pinzas # 5, elimine todos los tejidos corporales no grasos.
6. Use pinzas # 5 para montar las piezas del cuerpo gordo en un portaobjetos de microscopio utilizando glicerol al 80% como medio de montaje y coloque un cubreobjetos en la parte superior.
   NOTA: Antes de montar, verifique el pH del glicerol al 80% (usando papeles de pH, pH = 7 es óptimo) para proteger la señal GFP. Los medios de montaje (consulte la Tabla de materiales) con DAPI en glicerol al 80% ayudarán a obtener imágenes de los núcleos de las células corporales grasas. Estos portaobjetos son estables durante 1 semana cuando se almacenan en la oscuridad a 4 °C.

Resultados

En condiciones de alimentación, la proteína similar a la ubiquitina marcada con GFP, GFP-Atg8a, se difunde dentro de las células. Al morir de hambre, forma puntos verdes y etiqueta los autofagosomas. Una vez que los autofagosomas se fusionan con los lisosomas, la GFP se apaga en los autolisosomas ácidos y los puntos verdes desaparecen. Si no se induce la autofagia o se acelera la maduración del autofagosoma, se espera que el número de GFP puncta sea bajo. Sin embargo, si la fusión entre los autofagosomas y los lis...

Discusión

El presente protocolo describe los métodos para (1) generar moscas portadoras de clones mutantes en los cuerpos grasos larvales, (2) inducir la autofagia a través de la inanición de aminoácidos y (3) diseccionar los cuerpos grasos de las larvas. Para generar clones con éxito en los cuerpos grasos larvales, los siguientes pasos críticos deben llevarse a cabo diligentemente. (1) Sincronizar el choque térmico con precisión es crucial porque la recombinación mitótica solo ocurre cuando el tejido está experimentand...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
#5 Forceps	Dumont	RS-5015
9 Dressions Spot plate	PYREX	7220-85
Fluorescence Microscope	Nikon	SMZ1500
Glycerol	Sangon Biotech	A100854-0100
KCl	Sangon Biotech	A610440-0500	Composition of 1x PBS solution
KH2PO4	Sangon Biotech	A600445-0500	Composition of 1x PBS solution
Laboratory spatula	Fisher	14-375-10
Long forceps	R' DEER	RST-14
Microscope cover glass	CITOTEST	80340-1130
Microscope slides	CITOTEST	80302-2104
Na2HPO4	Sangon Biotech	A501727-0500	Composition of 1x PBS solution
NaCl	Sangon Biotech	A610476-0005	Composition of 1x PBS solution
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Petri dish	Corning	430166
Standard cornmeal/molasses/agar fly food			Tong Lab-made
Stereo microscope	Nikon	SMZ745
Sucrose	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	10021418
Vectashield antifade mounting medium with DAPI	Vectorlabratory	H-1200-10	Recommended mounting medium
Fly stocks
y'w* Iso FRT19A			Tong Lab's fly stocks
y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP			Tong Lab's fly stocks
y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP			Tong Lab's fly stocks
hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a			Tong Lab's fly stocks