Aislamiento de gotitas lipídicas de plastoglobulo del tejido foliar de plantas y cianobacterias

Resumen

Se presenta un protocolo rápido y eficaz para el aislamiento de gotitas lipídicas de plastoglobullos asociadas a diversos organismos fotosintéticos. La preparación exitosa de plastoglóbulos aislados es un primer paso crucial que precede a las investigaciones moleculares detalladas, como los análisis proteómicos y lipidómicos.

Resumen

Las gotitas lipídicas de plastoglobulo son un subcompartimento dinámico de cloroplastos vegetales y cianobacterias. Se encuentran ubicuamente entre las especies fotosintéticas, se cree que desempeñan un papel central en la adaptación y remodelación de la membrana tilacoide en condiciones ambientales que cambian rápidamente. La capacidad de aislar plastoglóbulos de alta pureza ha facilitado enormemente su estudio a través de metodologías proteómicas, lipidómicas y otras. Con plastoglóbulos de alta pureza y rendimiento, es posible investigar su composición lipídica y proteica, actividad enzimática y topología proteica, entre otras posibles características moleculares. Este artículo presenta un protocolo rápido y eficaz para el aislamiento de plastoglóbulos de cloroplastos de tejido foliar vegetal y presenta variaciones metodológicas para el aislamiento de plastoglóbulos y estructuras de gotitas lipídicas relacionadas de hojas de maíz, el tejido foliar desecado de la planta de resurrección, Eragrostis nindensis, y la cianobacteria, Synechocystis PCC 6803. El aislamiento se basa en la baja densidad de estas partículas ricas en lípidos, lo que facilita su purificación por flotación por densidad de sacarosa. Esta metodología resultará valiosa en el estudio de plastoglóbulos de diversas especies.

Introducción

La comprensión actual de la composición y función de los plastoglobullos ha surgido a través de estudios proteómicos y lipidómicos detallados 1,2,3,4,5. Tales estudios han sido ayudados en gran medida por un método rápido y efectivo de aislamiento que se basa en su muy baja densidad para una separación eficiente utilizando gradientes de sacarosa. Los métodos iniciales de aislamiento de plastoglobullos se lograron a partir de especies como el haya (Fagus sylvatica), la escoba (Sarothamnus scoparius), la cebolla (Allium cepa), la espinaca (Spinacia oleracea), el pensamiento (Viola tricolor), la pimienta (Capsicum annuum) y el guisante (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,^12,13. Un método actualizado para aislar plastoglóbulos de cloroplastos de una manera más eficiente y de mejor rendimiento fue presentado posteriormente por Ytterberg et ^al.3,14. Aunque inicialmente se empleó para el estudio de los plastoglóbulos de los cloroplastos de hojas de Arabidopsis thaliana, hemos empleado con éxito este método actualizado para el tejido foliar sano de otras especies de plantas, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, incluyendo maíz (Zea mays), tomate (Solanum lycopersicum), hierba del amor (Eragrostis nindensis), bromo falso púrpura (Brachypodium distachyon) y tabaco silvestre (Nicotiana benthamiana) ; resultados no publicados). Además, el método de aislamiento se ha adaptado con éxito a los plastoglóbulos de cianobacterias, incluyendo Synechocystis sp. PCC 6803 y Anabaena sp. PCC 7120¹⁵, y el tejido foliar desecado de la planta de resurrección, E. nindensis.

Los plastoglóbulos de cloroplasto del tejido foliar sano están conectados físicamente a las membranas tilacoides¹⁶. A pesar de esta continuidad física, los dos subcompartimentos del cloroplasto mantienen distintas composiciones de lípidos y proteínas, aunque se ha propuesto el intercambio regulado de lípidos y proteínas entre los dos compartimentos 2,4,17,18,19. De hecho, recientemente se ha propuesto un interesante modelo de hemifusión para el tráfico de lípidos neutros entre cloroplastos y citosol¹⁹. Debido a la continuidad física de plastoglóbulos y tilacoides, el método de aislamiento con tejido foliar sano comienza con la recolección de una preparación de tilacoide crudo granulado, que posteriormente se sonica, para separar los plastoglóbulos de los tilacoides, lo que contrasta con los métodos utilizados para aislar gotas lipídicas citosólicas²⁰ . La ultracentrifugación en un cojín de sacarosa hace flotar los plastoglóbulos de baja densidad a través de la sacarosa, separándolos efectivamente de los tilacoides, núcleos y otros materiales de alta densidad. En contraste, los plastoglóbulos en cianobacterias, así como los de tejido foliar desecado, evidentemente existen in vivo en forma flotante. Por lo tanto, su aislamiento implica flotar directamente en un gradiente de sacarosa. Este artículo demuestra el método de aislamiento del tejido foliar sano y además demuestra dos variaciones que se pueden utilizar para aislar plastoglóbulos de tejido foliar desecado o cultivos de cianobacterias, ampliando en gran medida la amplitud fisiológica y el contexto evolutivo en el que se pueden estudiar los plastoglobulos.

Los plastoglóbulos aislados se pueden utilizar posteriormente para cualquier número de análisis posteriores para investigar las características moleculares. Se han utilizado los plastoglobullos aislados del tejido foliar de A. thaliana para un extenso análisis proteómico y lipidómico bajo diferentes condiciones ambientales o genotipos, demostrando la modificación selectiva de la composición proteica y lipídica en adaptación al estrés 2,4,21,22. Además, se han realizado ensayos de quinasa in vitro que demuestran actividad transfosforilación asociada a plastoglóbulos aislados 22, se han investigado los estados oligoméricos de los componentes proteicos mediante electroforesis en gel nativo ²¹ y se han realizado ensayos de afeitado de proteasa²³.

El principal beneficio de este método es la velocidad relativa del procedimiento. En nuestra experiencia, los protocolos descritos a continuación se pueden completar completamente en aproximadamente 4 horas. Se ha descrito un método alternativo para aislar plastoglóbulos del tejido foliar, que permite el aislamiento simultáneo de otros subcompartimentos de cloroplastos²⁴. Este método alternativo ofrece algunas ventajas claras cuando es necesaria o deseada una comparación cuantitativa con los otros subcompartimentos del cloroplasto. Sin embargo, este método alternativo también es más tedioso y proporcionará un rendimiento significativamente menor de plastoglóbulos aislados a partir de cantidades comparables de tejido foliar. Cuando el objetivo es un estudio centrado en los plastoglóbulos, la metodología descrita aquí es la opción óptima. No obstante, se pueden recolectar alícuotas totales de hoja y tilacoide crudo durante la preparación de la muestra, y se recomienda encarecidamente hacerlo, para tener muestras de referencia para su posterior comparación.

Protocolo

1. Aislamiento de plastoglóbulos crudos

1. Extracción cruda de plastoglóbulo del tejido foliar de maíz no estresado
   1. Adquiera seis plántulas de maíz sanas de aproximadamente 3 semanas de edad y casi en la etapa de crecimiento V5, con un peso aproximado de 120 g.
   2. Recorte todas las hojas en la base del tallo, sumérjalas rápidamente en un baño de hielo y transpógrelas a la cámara frigorífica.
   3. Trabajando bajo una lámpara de seguridad verde, retire las hojas de maíz del baño de hielo y córtelas en trozos más pequeños (alrededor de 5 cm x 5 cm) con tijeras.
   4. Moler suavemente pero a fondo la mitad del tejido de la hoja recortada en una licuadora comercial en 350 ml de tampón de molienda (Tabla 1). Arranque-detenga la licuadora 5x-6x para asegurarse de que todas las hojas estén cortadas. No use más alto que el nivel 7 en la licuadora.
   5. Filtre el homogeneizado a través de una capa de tela de nylon de 25 μm en un embudo grande en cuatro botellas de centrífuga de 250 ml. A continuación, repita el paso 1.1.4 con la segunda mitad del tejido foliar recortado.
   6. Dividir uniformemente el filtrado entre las cuatro botellas y centrifugar durante 6 min a 1.840 x g a 4 °C. Retirar una alícuota del filtrado foliar y reservarla antes de la centrifugación para almacenarla como muestra representativa de la hoja total.
   7. Vierta el sobrenadante resultante y resuspenda suavemente el pellet en 12 ml de medio R 0.2 que contenga 0.2 M de sacarosa (Tabla 1) girando y resuspendiendo con movimientos suaves del cepillo. Después de resuspender cada pellet, lleve la suspensión a la siguiente botella y repita la resuspensión. Agrupe las suspensiones en una botella.
   8. Distribuir la suspensión agrupada entre seis tubos de ultracentrífuga de 3 mL, alcanzando un volumen máximo de 2,5 mL en cada tubo.
   9. Sonicar cada tubo 4x, durante 10 s cada vez, utilizando un sonicador de punta a una amplitud del 100%. Tenga cuidado de mantener la bocina del sonicador sumergida y lejos de la superficie del líquido para evitar la espuma.
   10. Mueva lentamente la bocina del sonicador hacia arriba y hacia abajo dentro de la suspensión durante cada ronda. Alterne entre los cuatro tubos, devolviendo cada tubo a un cubo de hielo después de cada sonicación para permitir que la muestra se enfríe.
   11. Centrifugar la suspensión tilacoide cruda sonicada a 150.000 x g durante 30 min a 4 °C. Recolecte la almohadilla flotante resultante de plastoglóbulos crudos de la superficie del cojín de sacarosa (fácilmente visto como una almohadilla amarilla y aceitosa) usando una jeringa y una aguja de 22 G rozando la superficie del cojín con la abertura de la aguja, recuperando aproximadamente 500 μL de cada tubo. Depositar en un tubo de 2.0 mL.
   12. Recolectar alícuotas del tilacoide crudo antes y después de la sonicación y liberación de plastoglobulos. Continúe con el paso 2.1. Alternativamente, almacenar los plastoglóbulos crudos a -80 °C y purificar en un momento posterior.
2. Extracción cruda de plastoglóbulo del tejido foliar desecado de E. nindensis
   1. Adquiera una maceta (compuesta por tres plantas individuales por maceta) de E. nindensis completamente desecada, de 8-9 semanas de edad (casi 40 g de tejido).
   2. Recorte todo el tejido de la hoja de la base de la planta, justo por encima del suelo, con tijeras e inmediatamente sumerja el tejido en un baño de hielo. Transporte el pañuelo a la cámara frigorífica.
   3. Trabajando bajo una lámpara de seguridad verde, corte la E. Nindensis hojas en trozos más pequeños (alrededor de 5 cm x 5 cm) usando tijeras.
   4. Moler suavemente pero bien las hojas con 100 ml de tampón de molienda (Tabla 1) en una licuadora comercial. Comience a detener la licuadora varias veces para asegurarse de que se corten todas las hojas. No use más alto que el nivel 7 en la licuadora.
   5. Filtrar el homogeneizado a través de una capa de tela de nylon de 25 μm en un embudo grande en un matraz cónico de 250 ml. Retirar una alícuota del filtrado foliar y reservarla antes de la centrifugación para almacenarla como muestra representativa de la hoja total.
   6. Añadir la cantidad adecuada de sacarosa para llegar a una concentración final de 0,5 M y distribuir la solución en tubos de centrífuga de 250 ml.
      NOTA: Se utiliza una mayor concentración de sacarosa en comparación con la preparación de Z. mays para asegurar la flotación de las gotas de lípidos citosólicos antes de la posterior sonicación/liberación de los plastoglóbulos unidos al tilacoide.
   7. Centrifugar los tubos a 45.000 x g durante 30 min a 4 °C. Una mezcla de plastoglóbulos y gotitas de lípidos citosólicos se verá fácilmente como una almohadilla amarilla y aceitosa en o cerca de la superficie del cojín de sacarosa (Figura 1B). Recoja el material flotante usando una jeringa con una aguja de 22 G rozando la superficie del cojín con la abertura de la aguja y deposite en un tubo.
   8. Deseche el sobrenadante restante después de recoger la mezcla de plastoglobulo/gota de lípidos que flota libremente.
   9. Para aislar los plastoglóbulos conectados al tilacoide residual, resuspender el pellet en 12 mL de medio R 0.2 girando y resuspendiendo con movimientos suaves del cepillo. Agrupe las suspensiones en una botella. Continúe con el paso 1.1.8.
3. Extracción cruda de plastoglóbulos de cianobacterias
   1. Cultivar un cultivo de 50 mL de Synechocystis sp. PCC 6803 a la fase estacionaria (aproximadamente 7-10 días) y ajustar la densidad celular a un OD₇₅₀ de 2.0 usando un espectrofotómetro. Para condiciones de cultivo, utilizar medios BG-11 y cultivar en una incubadora a una intensidad de luz de fotones de 150 μmol/m 2/s,²% de CO2,₃₂ °C, y con agitación continua a 150 rpm.
   2. Para eliminar los polisacáridos, lavar las células centrifugando el cultivo de 50 ml a 6.000 x g durante 45 min a 4 °C y posteriormente retirar el sobrenadante. Continuar lavando las células dos veces en 50 mL de tampón A (Tabla 1). Extraer una alícuota del homogeneizado celular y reservarla antes de la centrifugación para almacenarla como una muestra celular total representativa.
   3. Resuspenda el pellet lavado en 25 ml de tampón A y rompa las celdas usando una celda de presión francesa a 1,100 psi, repitiendo el proceso 3 veces (poner la muestra en hielo entre cada ciclo para evitar la desnaturalización de proteínas) hasta que el color lisado cambie de verde a rojo-azul-verde bajo luz blanca. Utilice una celda preenfriada y realice este paso en la cámara frigorífica.
   4. Distribuir el homogeneizado resultante entre ocho tubos de ultracentrífuga de 3 ml llenos hasta un máximo de 2,5 ml en cada tubo y luego superponer cuidadosamente con 400 μL de medio R, produciendo un gradiente escalonado.
      NOTA: Consulte Yang, et al. y Kelekar, et al. para descripciones detalladas de la preparación de gradiente de sacarosa^25,26.
   5. Equilibrar cuidadosamente los tubos añadiendo medio adicional R, según sea necesario, y centrifugar durante 30 min a 150.000 x g a 4 °C. El tilacoide y otros orgánulos más pesados (incluyendo cualquier cuerpo de polihidroxialcanoato) se granularán, mientras que los plastoglóbulos se verán fácilmente como una almohadilla amarilla y aceitosa en o cerca de la parte superior del gradiente de sacarosa (Figura 1C).
   6. Recolecte la almohadilla flotante resultante de plastoglóbulos crudos con una jeringa y una aguja 22G y deposite en un tubo de 2 ml. Raspe los plastoglóbulos del lado de la pared del tubo de la ultracentrífuga con la punta de la aguja si es necesario.
   7. Continúe con el paso 2.2. Alternativamente, almacenar plastoglóbulos crudos a -80 °C y purificar más tarde.

2. Recolección de plastoglóbulos puros

1. Procesamiento de tejidos vegetales
   1. Producir gradientes de sacarosa en tubos de ultracentrífuga de 2,5 ml colocando primero capas con 500 μL de plastoglóbulos crudos del paso 1.1 o del paso 1.2 mezclados con 500 μL de medio R 0,7, para llevar a un volumen total de 1 ml, luego superponer con 400 μL de medio R 0,2, seguido de superposición con 400 μL de medio R.
      NOTA: Consulte Yang et al. y Kelekar et al. para descripciones detalladas de la preparación de gradiente de sacarosa^25,26.
   2. Equilibre cuidadosamente los tubos agregando un exceso de R medio a la capa superior, según sea necesario. A continuación, centrifugar a 150.000 x g durante 1,5 h a 4 °C.
   3. Recolectar la almohadilla flotante resultante de plastoglóbulos puros (Figura 1A) con una jeringa y una aguja 22G y depositarla en un tubo de 2 ml. Raspe los plastoglóbulos de la parte superior de la pared del tubo de centrífuga con la punta de la aguja si es necesario.
   4. Alícuota los plastoglóbulos puros y congelar rápidamente en nitrógeno líquido. Conservar directamente a -80 °C o liofilizar hasta obtener un polvo seco.
2. Procesamiento de cianobacterias
   1. Producir un gradiente de sacarosa en cuatro tubos de ultracentrífuga de 2,5 ml superpuestos primero con 500 μL de plastoglóbulos crudos del paso 1.3 mezclados con 750 μL de medio R 0,7, luego superpuestos con 750 μL de medio R 0,2.
      NOTA: Consulte Yang et al. y Kelekar et al. para descripciones detalladas de la preparación de gradiente de sacarosa^25,26.
   2. Centrifugar el gradiente de sacarosa a 150.000 x g durante 90 min a 4 °C. Recoger los plastoglóbulos puros (Figura 1C) con una jeringa y una aguja de 22 G de la fase superior del gradiente de sacarosa y transferirlos a un tubo de 1,5 ml.
   3. Alícuota los plastoglóbulos puros y congelar rápidamente en nitrógeno líquido. Conservar directamente a -80 °C o liofilizar hasta obtener un polvo seco.

Resultados

Al finalizar el paso 1 del protocolo, uno debería poder ver fácilmente una cantidad considerable de material de plastoglóbulo/gota de lípidos flotando sobre (o cerca) de la capa superior del cojín de sacarosa (Figura 1B-C). Otras fracciones también podrían ser recogidas en esta etapa. Por ejemplo, los tilacoides se granularán y se pueden volver a suspender con el medio R 0,2 para análisis posteriores. Después de la centrifugación posterior, se obt...

Discusión

Para minimizar los cambios fisiológicos/bioquímicos en el material y proteger ciertos pigmentos fotolípidos y termolábiles que son un componente rico en plastoglobulos, es fundamental realizar el aislamiento a 4 °C y protegido de la luz. Como se indicó anteriormente, los pasos iniciales se realizan en la cámara frigorífica bajo una lámpara de seguridad utilizando una bombilla emisora de color verde. Los pasos posteriores realizados en el laboratorio son bajo luces tenues y utilizan hielo o centrifugación refrig...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AEBSF	Milipore Sigma	P7626
Antipain.2HCl	Bachem	H-1765.0050BA
Aprotinin	Milipore Sigma	A6106
Ascorbate	BDH	BDH9242
Bestatin	Sigma Aldrich	B8385
Beta-Glycerophosphate. 2Na5H2O	EMD Millipore	35675
Bovine Serum Albumin	Proliant Biological	68700
Chymostatin	Sigma Aldrich	C7268
Eragrostis nindensis	N/A	N/A
E-64	Milipore Sigma	E3132
French Pressure cell (model FA-079)	SLM/Aminco	N/A
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Leupeptin	Sigma Aldrich	L2884
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M8266
Multitron shaking incubator	Infors HT	N/A
Phospho-ramidon.2 Na	Sigma Aldrich	R7385
Potassium Hydroxide	Fisher Chemicals	M16050
Reduced Cysteine	MP Biochemicals	101444
Sodium Fluoride	Sigma Aldrich	S7920
Sodium Ortho-vanadate	Sigma Aldrich	450243
Sodium Pyrophosphate · 10H2O	Sigma Aldrich	3850
Sorbitol	Sigma Aldrich	S3889
Sucrose	Sigma Aldrich	S9378
Sylvania 15 W fluorescent Gro-Lux tube light bulb, 18"	Walmart	N/A
Synechocystis sp. PCC 6803	N/A	N/A
Optima MAX-TL Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A95761
Waring Blender (1.2 L)	VWR	58977-227	Commercial blender
Zea mays	N/A	N/A