Manipulación de la ingesta rítmica de alimentos en ratones utilizando un sistema de alimentación hecho a medida

Resumen

Restringir el momento de la ingesta de alimentos se ha convertido en una intervención prometedora para atenuar las enfermedades metabólicas inducidas por la dieta. Este manuscrito detalla la construcción y el uso de un sistema eficiente construido internamente para medir y manipular la ingesta rítmica de alimentos en ratones.

Resumen

La expresión génica rítmica es un sello distintivo del ritmo circadiano y es esencial para impulsar la ritmicidad de las funciones biológicas en el momento apropiado del día. Los estudios realizados en las últimas décadas han demostrado que la ingesta rítmica de alimentos (es decir, el momento en que los organismos comen alimentos durante las 24 horas del día), contribuye significativamente a la regulación rítmica de la expresión génica en varios órganos y tejidos de todo el cuerpo. Los efectos de la ingesta rítmica de alimentos en la salud y la fisiología han sido ampliamente estudiados desde entonces y han revelado que restringir la ingesta de alimentos durante 8 h durante la fase activa atenúa las enfermedades metabólicas derivadas de una variedad de dietas obesogénicas. Estos estudios a menudo requieren el uso de métodos controlados para cronometrar la entrega de alimentos a los animales. Este manuscrito describe el diseño y uso de un sistema eficiente y de bajo costo, construido internamente para medir el consumo diario de alimentos, así como para manipular la ingesta rítmica de alimentos en ratones. Este sistema implica el uso de materias primas asequibles para construir jaulas adecuadas para la entrega de alimentos, siguiendo un procedimiento de manipulación fácil de usar. Este sistema se puede utilizar de manera eficiente para alimentar a los ratones en diferentes regímenes de alimentación, como ad libitum, tiempo restringido o horarios arrítmicos, y puede incorporar una dieta alta en grasas para estudiar su efecto sobre el comportamiento, la fisiología y la obesidad. Se proporciona una descripción de cómo los ratones de tipo salvaje (WT) se adaptan a los diferentes regímenes de alimentación.

Introducción

El reloj circadiano se encuentra ubicuamente en todas las especies y proporciona un mecanismo de cronometraje que ayuda a los organismos a adaptarse a su entorno rítmicamente cambiante. El marcapasos circadiano maestro se encuentra en el núcleo supraquiasmático (NSQ) del hipotálamo. El SCN es arrastrado principalmente por el ciclo ambiental de luz-oscuridad, y sincroniza los relojes periféricos presentes en casi todas las células del cuerpo a través de múltiples señales, incluidas las señales neuronales y hormonales, la alimentación y la temperatura corporal 1,2,3,4,5,6,7,8 . En los mamíferos, el reloj circadiano molecular se basa en el factor de transcripción heterodimérico CLOCK: BMAL1 9,10, que controla la expresión de los genes del reloj central denominados Period (Per1, Per2 y Per3) y Cryptochrome (Cry1 y Cry2) para iniciar un bucle de retroalimentación transcripcional que es crítico para la generación de ritmos circadianos 9,11,12 . El reloj molecular también regula la transcripción rítmica de miles de genes que controlan la ritmicidad de prácticamente todas las funciones biológicas^13,14,15. Más del 50% del genoma en mamíferos se expresa rítmicamente en al menos un tejido tipo 16,17,18, y tejidos como el hígado en ratones tienen alrededor del 25%-30% de su transcriptoma expresado rítmicamente^18,19. La expresión génica rítmica es crucial para activar procesos biológicos importantes como el control del ciclo celular²⁰, la homeostasis de la glucosa 21 y el metabolismo de los aminoácidos²² en el momento adecuado del día para aumentar la aptitud del organismo.

En las últimas décadas, ha habido una creciente evidencia que sugiere que la ingesta de alimentos puede actuar como una potente señal de sincronización para los ritmos de arrastre en la expresión génica en múltiples tejidos, incluido el hígado^23,24. Es importante destacar que se ha demostrado que la alimentación arrastra ritmos en el hígado independientemente del NSQ o del ciclo luz-oscuridad²⁵, y la alimentación rítmica puede impulsar la expresión génica rítmica sin involucrar el reloj molecular 26,27,28,29,30,31. La alimentación restringida al período inactivo de ratones (diurna) invierte la fase de expresión de los genes del reloj central y de muchos genes rítmicos³¹. La alimentación restringida en el tiempo (TRF), que es una intervención nutricional donde la ingesta calórica diaria está restringida a un período de 8-10 h, ha demostrado proteger contra la obesidad, la hiperinsulinemia, la esteatosis hepática y el síndrome metabólico^32,33. Todos los experimentos anteriores que implican la manipulación de la ingesta de alimentos requieren que el experimentador haga uso de métodos efectivos para entregar alimentos en el momento adecuado del día.

Se han desarrollado diferentes métodos de entrega de alimentos, con varias ventajas y desventajas 29,34,35,36,37,38,39 (Tabla 1). Algunos alimentadores automatizados han sido diseñados para operar en base a un software que controla la cantidad, duración y tiempo de la disponibilidad de alimentos mientras registra la alimentación y la actividad voluntaria de rodaje en ratones³⁴. Algunos otros métodos implican que los ratones se coloquen en diferentes jaulas para diferentes condiciones de alimentación, con el experimentador agregando manualmente pellets de alimentos en el momento previo^38,39. Otro sistema utiliza un sistema alimentador automatizado controlado por una computadora donde un escudo neumático impide el acceso a los alimentos y que puede ser controlado por intervalos de tiempo o masa de alimentos³⁵. Todos estos métodos requieren la utilización y configuración de un software computarizado que puede ser costoso y requieren cierta capacitación para el funcionamiento adecuado del instrumento o requieren mucha mano de obra porque el experimentador necesita estar presente en momentos específicos para cambiar manualmente las condiciones de alimentación. Los sistemas computarizados también vienen con su parte de problemas, incluido el mal funcionamiento de las palancas o puertas que dejan salir la comida, los gránulos de comida que se atascan en los puntos de venta y la falla del software. Además, el sonido que se puede producir durante la apertura de puertas o palancas presenta el riesgo de condicionar a los ratones para asociarlos con la entrega de alimentos, comprometiendo así la interpretación de los efectos de la manipulación de alimentos como estrictamente debidos al acceso a los alimentos o debido a los efectos sobre otros ritmos de comportamiento como el ciclo de sueño / vigilia. El objetivo general de este estudio fue desarrollar un sistema asequible y eficiente para manipular la ingesta rítmica de alimentos a largo plazo que ayudaría a aliviar muchos de estos problemas antes mencionados. En primer lugar, el aparato de alimentación que se desarrolló y se describe a continuación se puede construir a un costo muy mínimo en comparación con las máquinas automatizadas (Tabla 2) y no requiere capacitación sofisticada para el manejo, operación y mantenimiento. En segundo lugar, el sistema de alimentación solo produce un ruido blanco de fondo y no hay sonidos fuertes durante la entrega de alimentos, lo que evita el condicionamiento pavloviano. En conjunto, este sistema de alimentación es económico, más accesible y confiable para los investigadores, sin dejar de ser eficiente en la manipulación de la ingesta rítmica de alimentos.

Protocolo

Todos los sujetos animales se utilizan de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Texas A&M (AUP # 2022-0050). Aquí se utilizan ratones machos y hembras C57BL / 6 entre 2-4 meses de edad. El procedimiento para construir el sistema de alimentación se describe a continuación, y las materias primas necesarias para construir el aparato se mencionan en la Tabla de materiales.

1. Construcción del sistema de alimentación

1. Construcción de una base de policloruro de vinilo (PVC)
   1. Adquiera cuatro piezas de láminas de PVC de 0.25 pulgadas cortadas según las siguientes dimensiones: 4.875 pulgadas x 4.5 pulgadas; 4.875 pulgadas x 2.125 pulgadas; 9.5 pulgadas x 2.125 pulgadas (dos piezas). Perfore cuatro agujeros en la base de 4.875 pulgadas x 4.5 pulgadas para conectar un temporizador de 24 horas utilizando las mediciones proporcionadas en la Figura 1A. Pegue las cuatro piezas de PVC para obtener la base como en la Figura 1A.
2. Asegurar el temporizador en la base de PVC
   1. Abra el temporizador para quitar el enchufe. Haga una conexión usando una extensión estándar/cable eléctrico (Figura 1B).
   2. Coloque el temporizador en la base de PVC para alinearlo con los orificios perforados en la base en el paso 1.1.1. Use tornillos de 1.5 pulgadas para fijar el temporizador en la base de PVC. Asegúrese de que el temporizador esté plano y estable en la base de PVC.
   3. Perfore cuatro agujeros en la parte superior del temporizador y fije tornillos de 0.75 pulgadas para sostener el recipiente de alimentos de ocho compartimentos (Figura 1B). La base para el sistema está completa y se parece a la Figura 1C.
      PRECAUCIÓN: No perfore los orificios durante todo el temporizador.
3. Configuración de la jaula
   1. Corte un tubo de PVC de 4 pulgadas (diámetro externo de 4.5 pulgadas) a una altura de 3.125 pulgadas. Perfore un orificio de aproximadamente 0.5 pulgadas en la parte inferior de la tubería para dejar pasar el cable eléctrico.
   2. Lije la parte superior de la tubería (por ejemplo, con un enrutador o una herramienta giratoria) para permitir que la tapa se retire fácilmente al cambiar el recipiente de alimentos.
   3. Use una jaula para mouse que tenga un ancho superior a 4.5 pulgadas y corte un orificio de 4.5 pulgadas en la parte inferior de la jaula con una sierra de agujero.
      NOTA: La ubicación del orificio depende de la configuración de la jaula (por ejemplo, la ubicación de la parte superior de la jaula y la botella de agua, la adición de una rueda de rodadura, etc.).
4. Configuración del contenedor de alimentación
   1. Haga un dispensador de alimentos con un organizador de joyas de 4 pulgadas y ocho compartimentos como se muestra en la Figura 1D. Corte el borde del recipiente de tal manera que encaje bien en la tubería.
   2. Use una tapa de tubería de PVC de 4 pulgadas y corte un orificio correspondiente al tamaño de un solo compartimiento dispensador (por ejemplo, con una herramienta giratoria) para crear una abertura que exponga solo uno de los ocho compartimentos a la vez. A medida que el temporizador se mueve, la abertura expone un nuevo compartimento cada 3 h. Los componentes del sistema de alimentación ya están listos para ser utilizados. Una vez que todas las jaulas están configuradas, la configuración final se asemeja a la que se muestra en la Figura 1E.
   3. El transporte de muchos contenedores de alimentos a la vez puede ser engorroso. Para facilitar el transporte, tome tres piezas de tubería de PVC de 0.25 pulgadas. Perfore un agujero de 0.625 pulgadas en el centro de dos piezas y péguelas juntas. Luego, use un tubo estrecho de PVC de 0.625 pulgadas que encaje en el orificio y a través del centro de las tazas de comida para apilar tazas de comida para facilitar su transporte, como se muestra en la Figura 1F.
   4. Pruebe los temporizadores antes de introducir los ratones conectando la configuración a las tomas de corriente, colocando un pedazo de nestlet en un compartimento a una hora registrada y monitoreando la posición del nestlet 12 h más tarde para asegurarse de que el temporizador gire rápidamente.

2. Aplicación del sistema de alimentación

1. Medición continua de la ingesta de alimentos en ratones
   1. Transfiera ratones a la sala experimental y aclimatarlos al ciclo de luz-oscuridad (LD) establecido en la habitación durante al menos 1 semana, y durante 2 semanas si el ciclo de luz-oscuridad se desplaza más de 3 h. Para este experimento, se recopilan datos de ratones machos y hembras C57BL / 6 entre 2-4 meses de edad expuestos a LD 12:12 (n = 7 machos y 4 hembras).
   2. Registre el peso de los ratones antes de alojarlos individualmente en las jaulas de alimentación (los pesos se registraron a las 3:00 pm, es decir, en el momento en que se llevaron a cabo los cambios de alimentos). Asegúrese de que los ratones tengan acceso ad libitum al agua y suficiente ropa de cama y polluelos.
   3. Agregue 1,5 g de alimento (de uso rutinario 45 mg de gránulos de precisión sin polvo) a los ocho compartimentos de la taza de alimentación. Coloque la taza del alimentador en el temporizador. Luego, coloque la tapa en la taza de alimentación de modo que solo quede expuesto un compartimento y anote el tiempo de presentación de los alimentos. Cuatro compartimentos representan puntos nocturnos y los otros cuatro representan puntos diurnos.
      NOTA: Debido al comportamiento de acaparamiento observado en la presentación excesiva de alimentos, se optimizaron 1,5 g como peso inicial de los alimentos. Los ratones tienden a acumular pellets en la parte superior de las tapas de los vasos de comida o en la ropa de cama dentro de la jaula. Esto sesga los datos que conducen a su mala interpretación. Los ratones machos no acumulan pellets cuando se alimentan con 1,5 g o menos por compartimento. Las hembras tienden a acumular alimentos más que los machos, pero esto es específico del ratón y puede atenuarse si se proporciona 1 g de pellet por compartimento.
   4. Cambie los alimentos todos los días a la misma hora y cuente el número de pellets que quedan en cada compartimento para calcular la cantidad de alimentos consumidos. Monitoree el perfil de alimentación durante una semana para obtener un perfil de alimentación de referencia de ratones alimentados ad libitum.
   5. Basándose en los alimentos consumidos en cada compartimento, calcule el consumo diario promedio de alimentos para cada ratón (Figura 2).
2. Tratamiento de dieta alta en grasas (HFD)
   NOTA: Este sistema de alimentación también se puede utilizar para estudiar el efecto de la HFD en las enfermedades metabólicas y, finalmente, se puede utilizar para horarios de alimentación con restricciones de tiempo. HFD no está disponible comercialmente como pellets de tamaño y peso precisos, y los pellets para la alimentación generalmente se adquieren como pellets de 0.5 pulgadas.
   1. Coloque los gránulos HFD sobre una superficie limpia o película transparente y córtelos en 6-7 trozos más pequeños de tamaño uniforme con una cuchilla de afeitar. Cortar los pellets lo suficientemente pequeños como para que se parezcan a los pellets de chow normales utilizados en la sección 2.1 anterior.
      NOTA: Los ratones tienden a acumular pellets más grandes en sus jaulas, lo que lleva a un error de cálculo de los alimentos consumidos.
   2. Pesar 1,5 g de trozos de HFD cortados y colocarlos en cada uno de los 8 compartimentos de alimentos. Para el cambio de alimentos cada dos días, 1,5 g de HFD por compartimento es suficiente.
   3. Cambie la comida todos los días o cada dos días según las necesidades experimentales y registre el peso de la comida que queda.
   4. Calcule la cantidad de alimentos consumidos restando el peso restante de los alimentos de la cantidad inicial de alimentos administrados. Repita este proceso durante un período de 1 semana para obtener una línea de base de la ingesta de alimentos HFD (Figura 2).
3. Aclimatar a los ratones machos a una dieta restringida por la noche (NR)
   1. Siga los pasos 2.1.1-2.1.4 para obtener una línea de base de alimentación ad libitum . Para este experimento, se recopilan datos de ratones machos C57BL / 6 entre 2-4 meses de edad expuestos a LD 12:12 (n = 18 machos).
   2. Después de 3-7 días de dieta ad libitum , ponga a los ratones en una dieta de transición reduciendo gradualmente el número de pellets en los compartimentos del día. Para hacer esto, tenga cinco pellets por compartimento el día 1 de transición (0.225 g por compartimento), 3 pellets el día 2 (0.135 g por compartimento), 1 pellet el día 3 (0.045 g por compartimento) y ninguno a partir de entonces para hacer la transición completa de los ratones con una dieta restringida nocturna.
      NOTA: Asegúrese de que los ratones no tengan restricciones calóricas. Promedie el consumo diario de alimentos de ratones por compartimento basado en la línea de base ad libitum y déles la misma cantidad de alimentos, distribuyéndola solo a través de los compartimentos de cuatro noches.
   3. Siga monitoreando la ingesta de alimentos durante 2 semanas después de que los ratones se hayan adaptado al régimen restringido nocturno. Durante este período, ajuste la cantidad de alimento dado a cada ratón para adaptarse mejor a su consumo total de alimentos (Figura 3A). Por lo general, agregue pellets de comida (1 pellet para cada uno de los cuatro compartimentos nocturnos) cuando los ratones comen toda su comida durante dos noches consecutivas.
   4. Pese los ratones al final del período de 2 semanas para controlar cualquier cambio de peso debido al régimen de alimentación. Al final de este período, anestesiar a los ratones con isoflurano y sacrificarlos por decapitación. Recolectar tejidos y analizarlos para detectar cambios diarios debido al paradigma de alimentación.
4. Aclimatar ratones machos a una dieta arrítmica (AR)
   1. Siga los pasos 2.1.1-2.1.4 para obtener una línea de base de alimentación ad libitum . Para este experimento, se recopilan datos de ratones machos C57BL / 6 entre 2-4 meses de edad expuestos a LD 12:12 (n = 18 machos).
   2. Después de una semana de dieta ad libitum , calcule el consumo promedio de alimentos por día y divida ese número por 8 para obtener la cantidad de alimentos que se proporcionarán en cada compartimento. Logre la alimentación AR asegurándose de que los ratones obtengan la misma cantidad de alimentos en los ocho compartimentos durante todo el día.
   3. Luego, ponga a los ratones en una dieta de transición reduciendo gradualmente, durante 3-5 días, la cantidad de alimento administrado por compartimento para finalmente abolir cualquier ritmo de ingesta de alimentos (como se muestra en la Figura 3B). Cuando esté en una dieta AR, asegúrese de que los ratones tengan acceso a 1/8 de su ingesta diaria de alimentos en cada uno de los ocho compartimentos y, por lo tanto, acceso a los alimentos cada 3 h. Asegúrese de que los ratones no tengan restricciones calóricas.
   4. Mantenga a los ratones en dieta AR durante 2 semanas o más (Figura 3B).
   5. Durante la dieta AR, ajuste la comida todos los días para asegurarse de que los ratones dejen solo unos pocos gránulos (generalmente menos de 5). Esto asegura que los ratones estén recibiendo la cantidad justa de comida y no estén restringidos en calorías. Haga ajustes reduciendo o agregando pellets en los ocho compartimentos o reduciendo o agregando pellets en dos compartimentos opuestos, para no inducir ningún ritmo de ingesta de alimentos.
      NOTA: Los ratones alimentados bajo una dieta AR dejan los alimentos casi exclusivamente entre ZT3 y ZT9 (entre 3 h y 9 h después de encenderse) pero tienen hambre por la noche y muerden el dispensador de alimentos para acceder al siguiente compartimento. Sin embargo, los ratones alimentados con AR no tienen restricciones calóricas y, de hecho, ganan más peso que los ratones alimentados con NR con el tiempo.
   6. Pese los ratones al final del período de 2 semanas para controlar cualquier cambio de peso debido al régimen de alimentación. Al final de este período, anestesiar a los ratones con isoflurano y sacrificarlos por decapitación. Recolectar tejidos y analizarlos para detectar cambios diarios debido al paradigma de alimentación.

Resultados

El sistema de alimentación descrito anteriormente se puede utilizar para la manipulación a largo plazo de la ingesta rítmica de alimentos en ratones. Este sistema esencialmente expone un nuevo compartimento de alimentos al ratón cada 3 horas, lo que permite al investigador manipular específicamente los alimentos en cada compartimento. Una aplicación fue analizar el perfil de la ingesta de alimentos durante el período de 24 h. Los datos indican que los ratones WT alimentados con comida ad libitum normal comen alrededor del 75% de su comida durante la noche (Figura 2A). Además, la mayoría de los alimentos consumidos durante el día se producen dentro de las 3 horas antes de apagarse.

Los ratones alimentados con HFD ad libitum comieron más alimentos en los primeros 2 días de exposición, probablemente debido a la novedad de HFD (Figura 2A). Después de 2 días, la ingesta de HFD se mantuvo rítmica, pero con una amplitud disminuida en comparación con cuando se alimentó con chow ad libitum normal. Mientras que tanto los ratones WT machos como las hembras fueron alimentados con HFD, se encontró que los ratones hembra acumulaban una gran cantidad de comida en la tapa del aparato de alimentación y en la jaula, mientras que los machos no mostraron ningún acaparamiento notable. Como se mencionó anteriormente, el acaparamiento de alimentos puede resultar en un cálculo incorrecto del consumo de alimentos y llevar a una mala interpretación de los datos. Además, los ratones hembra mordieron los bordes de plástico de los vasos de comida con mayor frecuencia, especialmente en los compartimentos nocturnos. Los ratones machos mostraron un aumento de peso significativo después de 1 semana de comida ad libitum normal y después de 1 semana de HFD (Figura 2E). Se observó una tendencia similar con ratones hembra, pero no alcanzó valores p significativos, probablemente en parte debido al menor número de hembras utilizadas en comparación con los machos.

Los ratones que hicieron la transición a una dieta NR comen sus calorías totales diarias solo por la noche, sin una disminución significativa en la ingesta de calorías durante las primeras 3-5 semanas (Figura 3A). Una exposición más prolongada al programa de NR disminuye la ingesta diaria promedio de calorías en un 10% -15% en comparación con los ratones alimentados ad libitum, como se describe en otra parte³⁴. Los ratones que hicieron la transición a una dieta AR consumieron sus calorías totales diarias en cantidades iguales a lo largo del día, lo que llevó a una amortiguación dramática del ritmo diario de ingesta de alimentos (Figura 3B). En cuanto al programa de alimentación NR, el promedio diario de ingesta de calorías no se ve afectado por el programa de alimentación AR durante las primeras 3-5 semanas de exposición, pero disminuye con una exposición más prolongada. Los ratones mostraron aumento de peso después de los programas NR (Figura 3C) y AR (Figura 3C).

Figura 1: Diseño y construcción del sistema de aparatos de alimentación. (A) Las dimensiones de la base de PVC para el sistema de alimentación y la descripción de dónde se deben hacer agujeros para fijar el temporizador. (B) Un temporizador de 24 horas antes y después de reutilizar el alambre y taladrar con tornillos para la colocación de la taza de comida. (C) La base gris ensamblada y el temporizador junto con un tubo de PVC de 4 pulgadas. (D) La taza de comida de ocho compartimentos después de recortar los bordes exteriores. (E) La configuración final de las jaulas con la taza de comida cubierta con una tapa de 4 pulgadas de tal manera que solo se pueda acceder a un compartimento a la vez. (F) El transporte de múltiples tazas de comida durante un experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Perfiles de alimentación bajo diferentes regímenes dietéticos . (A) El perfil de alimentación de ratones WT machos alimentados ad libitum con comida normal (NC) durante 7 días y dieta alta en grasas (HFD) durante 7 días adicionales. Las líneas de colores representan perfiles individuales del ratón (n = 7) y la línea negra indica el promedio ± SEM de siete ratones. (B) La dieta alta en grasas antes y después del corte. (C) El promedio diario de ingesta de alimentos cada 3 h ± SEM (n = 7). El promedio se calculó en los últimos 5 días del programa de alimentación NC o HFD. (D) El promedio (izquierda) y el porcentaje (derecha) de ingesta de alimentos durante el día y la noche para ratones alimentados con NC o HFD. Los valores representan el promedio de siete ratones ± SEM y se calcularon utilizando los datos de ingesta de alimentos durante los últimos 5 días de los programas de alimentación NC o HFD. * p < 0,05 entre los dos grupos (prueba t pareada). (E) El peso corporal promedio de los ratones utilizados en el experimento después de 1 semana de NC y 1 semana de HFD. Los datos para hombres (izquierda) y mujeres (derecha) se muestran con * p < 0,05 entre los dos grupos (prueba t pareada). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Manipulación del ritmo diario de ingesta de alimentos. (A) El perfil de alimentación de ratones WT machos alimentados con comida ad libitum normal durante 2 días, pasó a un régimen de alimentación con restricción nocturna (NR) durante 3 días y se mantuvo bajo alimentación NR durante 8 noches. Las líneas de color representan perfiles individuales de ratón (n = 18) y la línea negra indica el promedio ± SEM de 18 ratones. El asterisco gris indica un mal funcionamiento del temporizador para ese mouse en ese único día en que el temporizador dejó de girar. (B) Perfil de alimentación de ratones WT machos alimentados con comida ad libitum normal durante 2 días, transición a un régimen de alimentación arrítmica (AR) durante 1 día y mantenida bajo alimentación AR durante 8 noches. Las líneas de color representan perfiles individuales del ratón (n = 18) y la línea negra indica el promedio ± SEM de los 18 ratones. (C) El peso corporal promedio de los ratones utilizados en el experimento después de 2 semanas de exposición a las dietas NR y AR. Los datos se muestran con * p < 0,05 entre los dos grupos (prueba t pareada). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Ventajas y desventajas de los sistemas de alimentación existentes. Una tabla que destaca los diferentes sistemas de alimentación utilizados para la manipulación de la ingesta de alimentos, con una breve descripción de los pros y los contras de cada sistema. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Costo de los materiales necesarios para construir el sistema de alimentación. Una tabla que enumera el costo de los artículos necesarios para la construcción del sistema de alimentación descrito en este documento junto con una estimación del costo de construcción por jaula. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discusión

En las últimas décadas se han llevado a cabo extensas investigaciones sobre la manipulación de los ritmos de alimentación y su efecto sobre la fisiología. La construcción y utilización del sistema de alimentación descrito aquí se puede utilizar como un método eficiente para manipular la ingesta de alimentos. El protocolo utiliza un temporizador común de 24 horas y una taza de comida diseñada como un organizador de ocho compartimentos como componentes clave del sistema. Las jaulas se pueden construir con facilidad utilizando solo unas pocas herramientas de fácil acceso, y el manejo del sistema es fácil de usar. Algunos de los aspectos clave del protocolo para adaptar el sistema para manipular la ingesta rítmica de alimentos incluyen el cambio diario de las tazas de comida desde que el temporizador gira a lo largo de un período de 24 horas, el conteo manual o pesaje de los alimentos restantes y el ajuste diario del número de pellets para la alimentación AR. Por lo general, las virutas de plástico se ven cuando los ratones tienen hambre y no reciben alimentos adecuados. Este problema se puede solucionar agregando algunos gránulos de alimentos más que cumplan con el régimen de alimentación hasta que no se vean virutas de plástico. En el caso de la alimentación AR, donde es necesario ajustar los alimentos diarios, se debe tener cuidado de no inducir el ritmo de ingesta de alimentos (Figura 3B). Por lo tanto, es preferible agregar o restar pellets en compartimentos opuestos para mantener a los ratones alimentados arrítmicamente.

Este sistema se puede mejorar aún más cubriendo las tazas de comida con una capa de epoxi para evitar que los ratones muerdan el plástico y, por lo tanto, ayudar a prolongar la vida útil de las tazas de comida. La superficie del temporizador para la colocación de la taza de comida también se puede modificar para ayudar a que la taza de comida se asiente plana y estable en el temporizador. Esto podría evitar la parada accidental del temporizador causada por un temporizador colocado de manera desigual. Algunos de los componentes de la jaula, como las tazas de comida, también se pueden imprimir en 3D para reducir el costo y hacer a medida al gusto del investigador. Esto puede incluir tazas de comida con más de ocho compartimentos, lo que puede dar una mejor resolución de tiempo que la ventana actual de 3 horas.

Aunque es muy eficiente, este sistema tiene algunas limitaciones, como ser intensivo en mano de obra, ya que el investigador todavía necesita cambiar las tazas de comida cada 24 h y requiere que cuenten / pesen manualmente los alimentos restantes. Además, los temporizadores deben ser monitoreados de vez en cuando para identificar posibles problemas y / o si dejaron de funcionar. Esto se puede lograr mientras se cuentan los gránulos de comida que quedan después de la alimentación (por ejemplo, determinando si algunos ratones comieron alimentos solo en unos pocos compartimentos y dejaron algunos compartimentos intactos). Otra limitación de este sistema es que puede no funcionar tan bien con ratones hembra, ya que los pocos experimentos realizados con hembras mostraron que tienden a acumular alimentos y masticar el plástico más que los ratones machos.

Sin embargo, este sistema de alimentación es muy eficaz en la manipulación de la ingesta de alimentos, es fácil de construir, operar, mantener y es barato en comparación con los costosos comederos automatizados existentes en el mercado. Se puede adaptar y modificar fácilmente para adaptarse a los requisitos del investigador y no necesita ninguna capacitación especial para operar el sistema. Es importante destacar que los temporizadores solo producen una baja cantidad de ruido blanco constante, lo que evita que los ratones asocien cualquier sonido con la disponibilidad de alimentos.

En resumen, este documento describe un sistema de alimentación innovador que se puede utilizar para controlar el consumo diario de alimentos en ratones y se puede adaptar para alimentar a los ratones en diferentes paradigmas, como la alimentación restringida en el tiempo, la alimentación arrítmica y la alimentación con una dieta alta en grasas. Este sistema se suma a la lista de herramientas que se pueden utilizar para abordar cuestiones importantes en el campo de la ingesta rítmica de alimentos y su efecto sobre la fisiología.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
#6 x 0.75 inch Phillips Pan Head Stainless Steel Sheet Metal Screw (50-Pack)	Everbilt	#800172
#8 x 1.5 inch Phillips Pan Head Zinc Plated Sheet Metal Screw (100-Pack)	Everbilt	#801622
0.25 inch gray PVC sheet (24 inch x 48 inch)	USPlastic	#45088
4 inch PVC pipe (10 ft)	Home Depot	#531103
45 mg dustless precision pellets	Bio-Serv	#F0165
6 ft. Extension Cord	HDX	HD#145-017
Food container (eight-compartment jewelry organizer)	JewelrySupply	#PB8301
Indoor Basic Timer	General Electric	#15119
Oatey 4 inch ABS Pipe Test Cap with Knockout	Home Depot	#39103D
Rodent Diet with 45 kcal% fat (with red dye)	Research Diets	#D12451