Mapeo cerebral con una matriz de electrodos de grafeno

Resumen

Presentamos un procedimiento de mapeo cerebral basado en matrices de grafeno para reducir la invasividad y mejorar la resolución espacio-temporal. Los electrodos de superficie basados en matrices de grafeno exhiben biocompatibilidad a largo plazo, flexibilidad mecánica e idoneidad para el mapeo cerebral en un cerebro enrevesado. Este protocolo permite construir múltiples formas de mapas sensoriales de forma simultánea y secuencial.

Resumen

Los mapas corticales representan la organización espacial de las respuestas neuronales dependientes de la ubicación a los estímulos sensoriomotores en la corteza cerebral, lo que permite la predicción de comportamientos fisiológicamente relevantes. Para obtener mapas corticales se han utilizado diversos métodos, como electrodos penetrantes, electroencefalografía, tomografía por emisión de positrones, magnetoencefalografía y resonancia magnética funcional. Sin embargo, estos métodos están limitados por una resolución espacio-temporal deficiente, una baja relación señal-ruido (SNR), altos costos y falta de biocompatibilidad o daño físico al cerebro. Este estudio propone un método de mapeo somatosensorial basado en matrices de grafeno como una característica de la electrocorticografía que ofrece una biocompatibilidad superior, alta resolución espacio-temporal, SNR deseable y daño tisular minimizado, superando los inconvenientes de los métodos anteriores. Este estudio demostró la viabilidad de una guía de electrodos de grafeno para el mapeo somatosensorial en ratas. El protocolo presentado se puede aplicar no solo a la corteza somatosensorial sino también a otras cortezas como la corteza auditiva, visual y motora, proporcionando tecnología avanzada para la implementación clínica.

Introducción

Un mapa cortical es un conjunto de parches locales que representan las propiedades de respuesta a los estímulos sensoriomotores en la corteza cerebral. Son una formación espacial de las redes neuronales y permiten la predicción de la percepción y la cognición. Por lo tanto, los mapas corticales son útiles para evaluar las respuestas neuronales a estímulos externos y procesar la información sensoriomotora 1,2,3,4. Existen métodos invasivos y no invasivos para el mapeo cortical. Uno de los métodos invasivos más comunes consiste en el uso de electrodos intracorticales (o penetrantes) para el mapeo^de 5,6,7,8.

La evaluación de los mapas corticales de alta resolución bajo demanda utilizando electrodos penetrantes se ha enfrentado a varios obstáculos. El método es demasiado laborioso para obtener un mapa decente y demasiado invasivo para implementarlo para uso clínico, lo que impide un mayor desarrollo. Las tecnologías más recientes, como la electroencefalografía (EEG), la tomografía por emisión de positrones (PET), la magnetoencefalografía (MEG) y la resonancia magnética funcional (fMRI) han ganado popularidad porque son menos invasivas y reproducibles. Sin embargo, dados sus costos prohibitivos y su escasa resolución, se utilizan en un número limitado de casos 9,10,11. Recientemente, los electrodos de superficie flexible con una fiabilidad de señal superior han atraído una atención considerable. Los electrodos de superficie basados en grafeno demuestran biocompatibilidad a largo plazo y flexibilidad mecánica, proporcionando registros estables en un cerebro enrevesado 12,13,14,15,16. Nuestro grupo ha desarrollado recientemente una matriz multicanal basada en grafeno para el registro de alta resolución y la neuroestimulación específica del sitio en la superficie cortical. Esta tecnología nos permite realizar un seguimiento de las representaciones corticales de la información sensorial durante un período prolongado.

Este artículo describe los pasos involucrados en la adquisición de un mapa cerebral de la corteza somatosensorial utilizando una matriz de grafeno multielectrodo de 30 canales. Para medir la actividad cerebral, se coloca una matriz de electrodos de grafeno en el área subdural de la corteza, mientras que la pata delantera, la extremidad anterior, la pata trasera, la extremidad posterior, el tronco y los bigotes se estimulan con un palo de madera. Los potenciales evocados somatosensoriales (SEP) se registran para las áreas somatosensoriales. Este protocolo también se puede aplicar a otras áreas del cerebro, como la corteza auditiva, visual y motora.

Protocolo

Todos los procedimientos de manejo de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Nacional de Incheon (INU-ANIM-2017-08).

1. Preparación de los animales para la cirugía

NOTA: Use Sprague Dawley Rat (8-10 semanas de edad) sin el sesgo sexual para este experimento.

1. Anestesiar a la rata con 90 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de cóctel de xilacina por vía intraperitoneal. Para mantener la profundidad deseada de anestesia durante toda la cirugía, proporcione un cóctel suplementario de 45 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg de xilacina cuando la rata muestre signos de despertarse.
2. Confirme que la rata está bajo anestesia profunda y revise regularmente los reflejos corporales, como el pellizco de los dedos de los pies, el pellizco de la cola y el reflejo corneal.
3. Afeita el pelo entre los ojos y la parte posterior de las orejas con una recortadora.
4. Aplique un ungüento oftálmico en los ojos para evitar que se sequen.

2. Cirugía para la exposición de la superficie cortical

1. Fije la cabeza de rata en el aparato estereotáxico con un adaptador estereotáxico. Para mantener la temperatura corporal de 37 °C durante la cirugía, coloque a la rata sobre una almohadilla térmica con temperatura controlada.
2. Esterilice el área afeitada alternando tres veces el alcohol y la povidona yodada.
3. Use fórceps para agarrar el cuero cabelludo con firmeza e inyecte 0.1 ml de lidocaína (2%) con una jeringa directamente en el cuero cabelludo para inducir anestesia local en el área de la cirugía.
4. Haga una incisión de 2-3 cm de largo en la línea media con un bisturí y separe el cuero cabelludo para exponer el cráneo.
5. Pinza el cuero cabelludo con pinzas antimosquitos para exponer el cráneo.
6. Rascar la superficie del cráneo con fórceps para extraer el periostio.
7. Diseccionar los músculos sobre el cráneo occipital para exponer la cisterna magna por encima del eje en la parte superior de la médula espinal.
8. Incidir la cisterna magna con la cuchilla para drenar el líquido cefalorraquídeo y colocar una gasa estéril dentro de la incisión de la cisterna magna para absorber el líquido cefalorraquídeo constantemente para prevenir el edema cerebral y minimizar la inflamación.
9. Con un lápiz, marque en el cráneo una ventana rectangular de 3 mm en el eje anteroposterior y 6 mm en la dirección lateral derecha desde el bregma del hemisferio derecho.
   NOTA: El marcado debe asegurar una distancia de 1 mm de la línea media para evitar la ruptura del seno sagital superior.
10. Taladre el área marcada de acuerdo con la coordenada estereotáxica y retire el cráneo con un rongeur óseo.
11. Para retirar la duramadre, dobla la punta de la aguja de 26 G a 90°, crea un agujero en la duramadre, levanta la duramadre, inserta unas pinzas en ese agujero y lánzate con unas pinzas.
12. Coloque una gasa humedecida con solución salina en la corteza somatosensorial para evitar que se seque.

3. Preparación de la guía de electrodos de grafeno conectada al sistema de registro

1. Prepare una guía de electrodos de grafeno con un conector de omnética.
   1. Separe la matriz de multielectrodos de grafeno sin causar daños aplicando la solución salina.
   2. Retire la cubierta exterior de los cables de referencia y de tierra del conector.
2. Conecte la platina del cabezal con la guía de electrodos de grafeno al conector.
3. Conecte el cable de interfaz conectado a la platina principal en el sistema de grabación.
4. Fije el complejo de la guía de electrodos de grafeno en el brazo estereotáxico.
5. Para capturar las señales neuronales de todos los canales, coloque la matriz en la corteza somatosensorial sin ninguna flexión, siguiendo las coordenadas estereotáxicas predeterminadas.
6. Coloque un cable de referencia debajo del tejido detrás del hueso occipital y conecte el cable de tierra a la mesa óptica conectada a tierra.

4. Estimulación física y registro de SEP para mapeo

1. Abra el software de grabación de señales neuronales.
2. Configure el entorno del software de grabación: (1) configure la frecuencia de muestreo para los SEP y el filtro de muesca (60 o 50 Hz, una frecuencia de la energía eléctrica doméstica) para eliminar el ruido de la línea eléctrica.
3. Para mapear bigotes, dóblelos con un palo fino.
4. Pinche constantemente la pata delantera, la extremidad delantera, la pata trasera, la extremidad posterior y el tronco con un palo de madera para mapear el cuerpo.
5. Registre las señales neuronales en el sistema de adquisición de datos durante el tiempo indicado.

5. Eutanasia animal

1. Después de todos los procedimientos de grabación, sacrifique a las ratas con anestesia con isoflurano al >5% y realice una disección cervical.

6. Medición de SEP para mapeo cortical

1. Abra MATLAB con el nombre en clave read_Intan_RHS2000_file.m para el análisis de señales.
   NOTA: read_Intan_RHS2000_file.m se puede descargar desde "https://intantech.com/downloads.html?tabSelect=Software".
2. Haga clic en el botón Ejecutar , seleccione el archivo de grabación con la extensión de nombre de archivo ".rhs" y espere a que el archivo se procese y lea.
3. Introduzca el comando "plot (t, amplifier_data("channel number",:))" para crear un gráfico lineal 2D de los datos de grabación, encontrar los SEP y calcular la amplitud de los SEP en todos los canales.
   NOTA: Ingrese el número de canal en "número de canal". Por ejemplo, "plot(t, amplifier_data(1,:))" crea el gráfico de líneas 2D del canal 1. Además, cuando el experimentador calcule la amplitud de la respuesta, elija la respuesta grabada de cada canal.
4. Obtenga datos coloreando la cuadrícula con un tono diferente según la amplitud de los SEP.
   NOTA: El comando "imagesc" de MATLAB ayuda a obtener un mapa topográfico más rápidamente.

Resultados

Este protocolo describe cómo se monta una matriz multicanal de grafeno en la superficie del cerebro. El mapa somatosensorial se construyó adquiriendo respuestas neuronales a estímulos físicos y calculando la amplitud de la respuesta. La figura 1 muestra el esquema de este experimento.

La Figura 2A presenta las características estructurales de una guía de electrodos de grafeno. Hay orificios pasantes del sustrato entre los electr...

Discusión

El protocolo presentado proporciona un proceso en profundidad, paso a paso, que explica cómo acceder y mapear las respuestas somatosensoriales de las ratas utilizando una matriz de electrodos de grafeno. Los datos adquiridos por el protocolo son SEP que proporcionan información somatosensorial que está vinculada sinápticamente a cada parte del cuerpo.

Deben tenerse en cuenta varios aspectos de este protocolo. Al extraer líquido cefalorraquídeo para prevenir el edema cerebral y mitigar la...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1mL syringe	KOREAVACCINE CORPORATION		injecting the drug for anesthesia
3mL syringe	KOREAVACCINE CORPORATION		injecting the drug for anesthesia
Bone rongeur	Fine Science Tools	16220-14	remove the skull
connector	Gbrain		Connect graphene electrode to headstage
drill	FALCON tool		grind the skull
drill bits	Osstem implant		grind the skull
Graefe iris forceps slightly curved serrated	vubu	vudu-02-73010	remove the tissue from the skull or hold wiper
graphene multielectrode array	Gbrain		records signals from neuron
isoflurane	Hana Pharm Corporation		sacrifce the subject
ketamine	yuhan corporation		used for anesthesia
lidocaine(2%)	Daihan pharmaceutical		local anesthetic
Matlab R2021b	Mathworks		Data analysis Software
mosquito hemostats	Fine Science Tools	91309-12	fasten the scalp
ointment	Alcon		prevent eye from drying out
povidone	Green Pharmaceutical corporation		disinfect the incision area
RHS 32ch Stim/Record headstage	intan technologies	M4032	connect connector to interface cable and contain intan RHS stim/amplifier chip
RHS 6-ft (1.8m) Stim SPI interface cable	intan technologies	M3206	connect graphene electrode to headstage
RHS Stim/Recording controller software	intan technologies		Data Acquisition Software
RHS stimulation/ Recording controller	intan technologies	M4200
saline	JW Pharmaceutical
scalpel	Hammacher	HSB 805-03
stereotaxic instrument	stoelting		fasten the subject
sterile Hypodermic Needle	KOREAVACCINE CORPORATION		remove the dura mater
Steven Iris Tissue Forceps	KASCO	50-2026	remove the dura mater
surgical blade no.11	FEATHER		inscise the scalp
surgical sicssors	Fine Science Tools	14090-09	inscise the scalp and remove the dura mater
wooden stick			whisker stimulation
xylazine	Bayer Korea		used for anesthesia