Protocolo optimizado para generar células pancreáticas funcionales secretoras de insulina a partir de células madre pluripotentes humanas

Resumen

Este artículo presenta un protocolo para la diferenciación dirigida y el análisis funcional de células similares a β células. Describimos las condiciones óptimas de cultivo y los pasajes para las células madre pluripotentes humanas antes de generar células pancreáticas productoras de insulina. La diferenciación de seis etapas progresa desde la formación definitiva del endodermo hasta las células funcionales similares a las células β que secretan insulina en respuesta a la glucosa.

Resumen

Las células madre pluripotentes humanas (hPSC, por sus siglas en inglés) pueden diferenciarse en cualquier tipo de célula, lo que las convierte en una excelente fuente alternativa de células β pancreáticas humanas. Las hPSC pueden ser células madre embrionarias (hESC) derivadas del blastocisto o células pluripotentes inducidas (hiPSC) generadas directamente a partir de células somáticas mediante un proceso de reprogramación. Aquí se presenta un protocolo basado en video para describir las condiciones óptimas de cultivo y paso para las hPSC, antes de su diferenciación y posterior generación de células pancreáticas productoras de insulina. Esta metodología sigue el proceso de seis etapas para la diferenciación dirigida a las células β, en el que las hPSC se diferencian en endodermo definitivo (DE), tubo intestinal primitivo, destino del intestino anterior posterior, progenitores pancreáticos, progenitores endocrinos pancreáticos y, en última instancia, células β pancreáticas. Cabe destacar que esta metodología de diferenciación tarda un periodo de 27 días en generar células β pancreáticas humanas. El potencial de la secreción de insulina se evaluó a través de dos experimentos, que incluyeron inmunotinción y secreción de insulina estimulada por glucosa.

Introducción

Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) tienen la capacidad única de diferenciarse en varios tipos de células, lo que las convierte en una alternativa viable^{a las células} β pancreáticas humanas. Estas hPSCs se clasifican en dos tipos: células madre embrionarias (hESCs), derivadas del blastocisto², y células pluripotentes inducidas (hiPSCs), generadas por la reprogramación directa de células somáticas³. El desarrollo de técnicas para diferenciar las hPSCs en células β tiene importantes implicaciones tanto para la investigación fundamental como para la práctica clínica ^1,4. La diabetes mellitus es una enfermedad crónica que afecta a >400 millones de personas en todo el mundo y es el resultado de la incapacidad del organismo para regular la glucemia debido a un mal funcionamiento o pérdida de las células β pancreáticas⁵. La limitada disponibilidad de células de los islotes pancreáticos para trasplante ha dificultado el desarrollo de terapias de reemplazo celular para la diabetes 2,4,6,7. La capacidad de generar células secretoras de insulina sensibles a la glucosa utilizando hPSC sirve como un modelo celular útil para estudiar el desarrollo y la función de los islotes humanos. También se puede utilizar para probar posibles candidatos terapéuticos para el tratamiento de la diabetes en un entorno controlado. Además, las hPSC tienen el potencial de producir células de los islotes pancreáticos que son genéticamente idénticas al paciente, lo que reduce el riesgo de rechazo inmunológico después del trasplante ^2,4,7.

En los últimos años, se han producido avances significativos en el perfeccionamiento de los protocolos de cultivo y diferenciación de hPSC, lo que ha dado lugar a un aumento de la eficiencia y la reproducibilidad del proceso de diferenciación hacia la generación de células β pancreáticas ^8,9.

El siguiente protocolo describe las etapas esenciales de la diferenciación dirigida de las células β pancreáticas. Implica la regulación de vías de señalización celular específicas en distintos puntos de tiempo. Se basa en el protocolo desarrollado por Sui L. et ^al.10 (2018) para la generación de hPSCs en células β pancreáticas. El protocolo se ajustó a las recientes actualizaciones de Sui L. et ^al.11 (2021), ya que las últimas investigaciones enfatizan la importancia del uso del tratamiento con afidiolina (APH) para mejorar la diferenciación de las células β. El protocolo actual incluye la adición de APH al medio durante las últimas etapas del proceso. Además, se han realizado modificaciones en la composición del medio durante las primeras etapas de diferenciación en comparación con el protocolo inicial. Un cambio notable es la adición del factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) en el día 6 y continúa hasta el día 8. El factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) se introduce desde el día 6 hasta el día 8, lo que difiere ligeramente del protocolo inicial¹⁰, donde el KGF no se incluyó en el medio de la etapa 4.

El primer y esencial paso en la generación de células similares a las células β es la diferenciación dirigida de las hPSC en endodermo definitivo (DE), una capa germinal primitiva que da lugar al revestimiento epitelial de varios órganos, incluido el páncreas. Después de la formación de DE, las células experimentan una diferenciación en el tubo intestinal primitivo, que es seguida por la especificación del destino del intestino anterior posterior. Luego, el intestino anterior posterior se convierte en células progenitoras pancreáticas, que tienen el potencial de diferenciarse en todos los tipos de células del páncreas, incluidas las células endocrinas y exocrinas. La etapa posterior del proceso involucra a los progenitores endocrinos pancreáticos que dan lugar a las células secretoras de hormonas que se encuentran en los islotes de Langerhans. Al final, el proceso de diferenciación llega a su etapa final al producir células pancreáticas de tipo β completamente funcionales ^9,10. Es importante destacar que este proceso es complejo y muchas veces requiere la optimización de las condiciones de cultivo, como factores de crecimiento específicos y componentes de la matriz extracelular, para mejorar la eficiencia y especificidad de la diferenciación ^9,10. Además, la generación de células funcionales similares a las células β a partir de hPSC in vitro sigue siendo un reto importante. La investigación en curso se centra en mejorar los protocolos de diferenciación y mejorar la maduración y función de las β-células resultantes⁹.

En este protocolo, el uso de la disociación celular suave durante el cultivo y el paso de hPSCs es esencial para mantener la viabilidad y pluripotencia celular, mejorando significativamente la eficiencia de la diferenciación en células β pancreáticas. Además, cada medio específico de la etapa se ha optimizado meticulosamente siguiendo el protocolo desarrollado por Sui L. et ^al.10 para promover un alto rendimiento de células secretoras de insulina en grupos que se asemejan mucho al islote humano.

Protocolo

Antes de iniciar la diferenciación, se recomienda determinar el número requerido de organoides similares a islotes con fines experimentales. En una placa de 6 pocillos, un solo pocillo con más del 80% de confluencia suele constar de 2-2,3 millones de hPSC. Si bien una predicción precisa es un desafío debido a las variaciones en las líneas de hPSC y la eficiencia de diferenciación, una estimación aproximada es 1,5 veces el número de pozos iniciales. Una diferenciación dirigida de manera efectiva generalmente produce de 1,6 a 2 millones de células por pocillo en placas de seis pocillos, que abarcan todas las células dentro de los grupos en lugar de exclusivamente células productoras de insulina. Para un grupo de 50 μm, se puede estimar que contiene alrededor de 10.000 células. La Tabla 1 proporciona un resumen de la composición del medio utilizado para cada día/etapa de diferenciación dirigida sobre la matriz de células madre y el medio, junto con el tampón de secreción de insulina estimulado por glucosa.

1. Paso de células madre pluripotentes humanas previa diferenciación en placas de 6 pocillos

NOTA: El paso apropiado de las células madre humanas antes de diferenciarlas en células similares a las células β es un paso crucial en el establecimiento del proceso experimental. La dilución de paso incorrecto o el número de celdas de unión pueden comprometer la eficiencia y la fidelidad de la diferenciación.

1. Prepare el medio de cultivo de células madre, el recubrimiento y las soluciones de disociación (como se especifica en la Tabla 1).
2. 1-2 h antes del pase, recubra una placa de seis pocillos con solución de recubrimiento en frío (1 ml por pocillo) e incube a 37 °C, 5% de CO₂.
3. Calentar una alícuota de medio de cultivo de células madre a temperatura ambiente (15 -25 °C) durante 20 min.
4. Aspire el medio de células madre y agregue 1 ml de D-PBS libre de calcio/magnesio.
5. Repita el paso 1.4. dos veces.
   NOTA: Se agrega D-PBS para lavar las células y eliminar el medio y los compuestos anteriores. Es importante tener en cuenta que no se requiere un marco de tiempo específico para los pasos de lavado, ya que la exposición a D-PBS no daña las hPSC, evitando la ruptura o contracción celular causada por ósmosis.
6. Aspirar D-PBS, añadir 500 μL de solución de disociación para cada pocillo y dejar reposar durante 2-5 min a temperatura ambiente (15 - 25 °C).
7. Mientras las células se disocian, aspire la solución de recubrimiento de la nueva placa de 6 pocillos y agregue 1-2 ml de D-PBS libre de calcio/magnesio a cada pocillo.
8. Compruebe regularmente el proceso de disociación bajo el microscopio invertido.
9. Aspire la solución de disociación cuando el 80 - 90% de las células se hayan redondeado pero aún estén adheridas.
10. Agregue 1 mL del medio de células madre que contenga 10 μM de inhibidor de ROCK.
11. Recoja las células disociadas en un tubo cónico de 15 ml utilizando puntas de pipeta filtradas estériles de 1.000 μl y una pipeta P1000.
12. Triture lentamente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo en la pipeta con una punta filtrada de pipeta estéril de 1.000 μL para romper las colonias, pero no exceda de 10 veces.
13. Añadir 1 mL del medio de células madre que contiene el inhibidor de ROCK para ayudar a separar las hPSC restantes y transferir la suspensión celular al mismo tubo cónico de 15 mL (1.10).
14. Aspire el D-PBS de la placa recién recubierta e inmediatamente agregue la suspensión celular del tubo cónico de 15 mL. Para asegurar un crecimiento celular óptimo, siembre un rango de 2 x 10⁵- 1 x 10⁶ celdas viables por pocillo cuando use una placa de 6 pocillos (1 en 10 a 1 en 50 divisiones).
    NOTA: Para el cálculo del volumen, cada pocillo de una placa de 6 pocillos debe contener 2 ml de medio de células madre con inhibidor de ROCK.
15. Mueva el plato rápidamente hacia adelante y hacia atrás, y de lado a lado de 5 a 10 veces.
16. Colocar la placa a 37 °C, 5% CO₂ incubadora durante 24 h.
17. Reemplace con medio de células madre frescas sin inhibidor de ROCK al día siguiente, y luego cada 2 días hasta que la confluencia de hPSC haya alcanzado el 80 - 95%.

2. Diferenciación dirigida de células β derivadas de células madre humanas

NOTA: Las hPSC se pueden utilizar para el proceso de diferenciación directa en células β pancreáticas cuando se alcanza una confluencia del 80-95%.

1. Día -1: Pasaje de las células Día -1 de diferenciación:
   1. 1-2 h antes del paso, cubra una placa de 6 pocillos con una solución de recubrimiento frío en una incubadora de_CO2 al 5% a 37 °C durante 1 h.
   2. Siga los pasos 1.1 a 1.10 y proceda a contar las celdas.
   3. Cargue 10 μL de la mezcla de celdas, agregue un volumen igual de azul de tripano y mezcle suavemente.
   4. Calcula la concentración celular. Utilice 0,8 × 10⁶ células/ml - 1,0 x 10⁶ células/ml de medio de células madre que contenga 10 μM de inhibidor de ROCK para colocar la placa de 6 pocillos recubierta con 2 ml de medio por pocillo.
   5. Mueva el plato rápidamente hacia adelante y hacia atrás, de lado a lado tres veces.
   6. Coloque la placa en una incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ . Mueva rápidamente el plato hacia adelante y hacia atrás, y de lado a lado nuevamente 10 veces. A continuación, incubar la placa durante 4 h.
      NOTA: Asegúrese de que la fijación máxima y la distribución uniforme de las células no perturben las células moviendo la placa una vez colocada en la incubadora. Abra y cierre la incubadora con mucho cuidado.
   7. Coloque el frasco de medio basal durante los días 0 a 4 a 4 °C para descongelarlo durante la noche.
2. Día 0
   NOTA: Las hPSCs deben ser 80 - 95% confluentes, no iniciar el proceso de diferenciación al endodermo definitivo bajo esa confluencia.
   1. Con hielo, descongele tanto el medio basal para los días 0 a 4 como los suplementos (ver Tabla de Materiales).
   2. Prepare en dos tubos cónicos solo el volumen necesario para ser utilizado el día 1 (2 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos), y en un tubo separado, duplique el volumen del día 2,5 a 4 (2 x 2 ml por pocillo de un plato de 6 pocillos). Conservar del día 2,5 al día 4 a 4 °C.
   3. Calentar una alícuota del volumen necesario del medio del día 1 y del medio de lavado 1 en un baño de agua a 37 °C durante 5 min.
   4. Aspire el medio de células madre y agregue 2 ml de medio de lavado 1.
      NOTA: El medio de lavado utilizado en el protocolo consiste en el medio basal específico para cada día/etapa, suplementado con antibióticos al 1%. Las etapas de lavado del protocolo de diferenciación directa solo implican la adición del medio de lavado designado (denominado "medio de lavado 1 o 2", Tabla de materiales) y la aspiración posterior, siguiendo el procedimiento descrito 2.2.4. Es importante mencionar que no hay un marco de tiempo específico indicado para estos pasos de lavado.
   5. Aspire el medio de lavado 1 e inmediatamente agregue 2 ml del medio del Día 1 al costado del pozo.
   6. Incubar las células a 37 °C y 5% de CO₂ durante 24 h.
3. Día 1
   1. Precalentar una alícuota del volumen necesario de los días 2,5 a 4 medios en un baño de agua a 37 °C durante 5 min.
   2. Aspire el medio del Día 1 e inmediatamente agregue 2 mL del medio del Día 2.5 a 4 al costado del pozo. No lave las células.
   3. Vuelva a colocar la placa a 37 °C y 5% de CO₂ durante 36 h.
4. Días 2.5 a 4
   1. Precalentar una alícuota del volumen restante del medio de 2,5 a 4 días en baño maría a 37 °C durante 5 min.
   2. Aspire el medio e inmediatamente agregue 2 mL de medio recién preparado de los días 2.5 a 4 al costado del pocillo.
   3. Vuelva a colocar la placa a 37 °C y 5% de CO₂ durante 36 h.
5. Día 4
   NOTA: En esta etapa, la expresión de los marcadores definitivos del endodermo está en su máximo y las células pueden iniciar la diferenciación primitiva del tubo intestinal.
   1. Preparar una alícuota del volumen necesario del medio de la etapa intestinal primitiva del día 4 (2 ml por pocillo de una placa de seis pocillos) y calentarlo a temperatura ambiente (15 °C -25 °C) durante 20 min.
   2. Aspirar los días 2.5 a 4 medio y agregar 2 mL de medio de lavado 1.
   3. Aspire el medio de lavado 1 e inmediatamente agregue 2 ml de la etapa intestinal primitiva del día 4 al costado del pozo.
   4. Vuelva a colocar la placa a 37 °C y 5% de CO₂ durante 48 h.
6. Días 6 a 8
   NOTA: En esta etapa, las células inician una mayor diferenciación hacia el destino posterior del intestino anterior.
   1. Preparar el volumen necesario de medio del intestino anterior posterior de los días 6 a 8 (2 mL por pocillo de una placa de 6 pocillos) y calentar el medio a temperatura ambiente (15 °C -25 °C) durante 20 min.
   2. Aspire el medio del día 4 e inmediatamente agregue 2 ml del medio del intestino anterior posterior de los días 6 a 8 al costado del pozo.
   3. Colocar la placa a 37 °C incubadora conteniendo 5% de CO₂ durante 48 h.
7. Días 8 a 12
   NOTA: Las células están listas para someterse a la diferenciación de los progenitores pancreáticos.
   1. Preparar el volumen necesario de los días 8 a 12 del medio de la etapa de progenitores pancreáticos (2 mL por pocillo de una placa de 6 pocillos) y calentar el medio a temperatura ambiente (15 °C -25 °C) durante 20 min.
   2. Aspire los días 6 a 8 medio e inmediatamente agregue 2 mL del medio del intestino anterior posterior de los días 6 a 8 al costado del pozo.
   3. Colocar la placa en una incubadora a 37 °C que contenga un 5% de CO₂ durante 48 h.
8. Día 12: Realización del paso de agrupación en clústeres
   NOTA: En esta etapa, las células forman una monocapa densa y se pasarán al cultivo celular 3D para formar grupos. Este paso es crucial para la diferenciación con el fin de mejorar la semejanza estructural de las células similares a β con los islotes humanos nativos, pero también mejora su semejanza funcional tanto a nivel celular como de racimo¹¹ (Figura 1).
   1. Trate una placa de 6 pocillos que contenga micropocillos de 400 μm (como se especifica en la Tabla de materiales: Diferenciación dirigida de células β derivadas de células madre humanas, día 12) con 2 ml de solución de enjuague antiadherente a temperatura ambiente (15 °C - 25 °C).
      NOTA: El micropocillo evita que las células se adhieran al fondo del pocillo y facilita la formación mecánica de grupos 3D.
   2. Plato centrífugo a 1.300 x g durante 5 min.
   3. Compruebe la presencia de burbujas bajo un microscopio invertido. Si no se observan burbujas, aspirar la solución de enjuague antiadherente y añadir inmediatamente 2 mL de medio de lavado 2 (Tabla de materiales).
   4. Repita el paso 1.8.3. dos veces.
   5. Preparar el volumen necesario del medio del racimo y calentarlo a temperatura ambiente (15 -25 °C) durante 20 min. Asegúrese de que dos pocillos de una placa de 6 pocillos entren en un pocillo de la placa de 6 pocillos de micropocillos de 400 μm con 4 ml del medio del racimo.
   6. Aspirar el medio progenitor pancreático y añadir tampón de disociación (0,5 ml por pocillo).
   7. Incubar a temperatura ambiente (15 °C - 25 °C) durante 2-5 min. Compruebe regularmente el proceso de disociación bajo un microscopio invertido y aspire el tampón de disociación cuando la mayoría de las células se hayan redondeado pero aún estén adheridas.
   8. Aspire el tampón de disociación e inmediatamente agregue 1 ml de medio de racimo a cada pocillo.
   9. Disocie las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo seis veces con una pipeta P1000 y puntas de filtro de 1.000 μL.
   10. Transfiera las células y la mezcla de medio del racimo a un tubo cónico de 50 ml.
   11. Agregue 1 ml del medio del racimo para recolectar todas las células restantes.
   12. Agregue el medio del racimo al volumen total necesario para que cada pocillo de la placa de micropocillos tenga 4 ml de medio de mezcla/celdas.
   13. Aspire el medio de lavado 2 de la placa de 6 pocillos de micropocillos y transfiera la suspensión celular. Incubar la placa a 37 °C durante 24 h.
9. Día 13: Manejo de las células después de la agrupación y cambio de sus medios a partir del día 13.
   NOTA: Los clústeres son muy sensibles y requieren un manejo cuidadoso para garantizar su integridad y viabilidad en los días siguientes. Por lo tanto, es crucial monitorear de cerca los conglomerados durante el período posterior a la agrupación después del día 12. La evaluación y los ajustes regulares son esenciales para promover resultados exitosos en el proceso experimental.
   1. Prepare el volumen necesario de medio para el día 13 (2 ml por pocillo de una placa de 6 pocillos), y en un tubo cónico separado de 50 ml para el medio progenitor endocrino pancreático del día 15 al 20.
   2. Recoja lentamente los racimos de la placa de 6 pocillos de los micropocillos en un tubo cónico de 50 ml utilizando una pipeta p1000 y puntas filtradas de 1.000 μl.
   3. Agregue 1 ml de medio del día 13 para recolectar los racimos restantes y transfiera los racimos al tubo.
   4. Deje que las células se asienten naturalmente bajo gravedad en el fondo del tubo cónico durante 5 minutos.
   5. Aspire la mayor cantidad posible de sobrenadante del tubo sin alterar los grupos celulares. Las puntas de pipeta no deben tocar ni aspirar los grupos, sino solo el sobrenadante.
   6. Agregue el volumen necesario del medio del día 13 de acuerdo con lo siguiente: 1 pocillo de la placa de 6 pocillos de micropocillos va a tres pocillos de una placa de 6 pocillos de baja adherencia (2 ml de medio por pocillo).
   7. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo, evitando los racimos de aspiración.
   8. Transfiera la suspensión a una placa de 6 pocillos de muy baja adherencia.
   9. Mueva el plato rápidamente hacia adelante y hacia atrás, de lado a lado seis veces.
   10. Incubar la placa a 37 °C durante 48 h.
   11. Realice los cambios de medio en todos los pasos siguientes hasta el final de la diferenciación como se describe en esta sección 2.9.
10. Días 15 a 20
    1. Cambie al medio de la etapa progenitora endocrina pancreática cada 48 h hasta el día 21 de diferenciación recogiendo la suspensión celular en un tubo cónico de 50 ml y siguiendo los pasos 2.9.4 a 2.9.10 para el día 13.
11. Días 21 al 27
    NOTA: En esta etapa, los grupos se diferencian en células β pancreáticas.
    1. Prepare el medio pancreático en etapa de β células.
    2. Cambie el medio cada dos días como se describe durante los días 15 a 21.
       NOTA: Después del día 25, los organoides en forma de islotes pueden someterse a análisis para confirmar que son completamente funcionales.

3. Tinción de grupos de células β pancreáticas

NOTA: Realice este paso para estudiar la evaluación funcional de los conglomerados después de la diferenciación

1. Recoja de cinco a diez grupos en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml al final de la diferenciación.
2. Fije los grupos celulares con 200 μL de PFA al 4% durante 15 min a temperatura ambiente.
3. Añada 1 ml de PBS a los clústeres y retire el PBS con una punta de pipeta de 1.000 μl sin alterar los clústeres.
4. Añadir 200 μL de sacarosa al 30% a los racimos e incubar durante la noche a 4 °C.
5. Transfiera los racimos a un molde criogénico, retire la sacarosa adicional, agregue una gota de medio O.C.T. y mezcle los racimos con medio O.C.T.
6. Congele el criomold en hielo seco y guárdelo a -80 °C.
7. Corte secciones de 5 μm del bloque congelado en portaobjetos de microscopio utilizando un micrótomo o criostato.
8. Guarde los portaobjetos a -80 °C en el congelador hasta que se manchen.
9. El día de la tinción, saque los portaobjetos del congelador a -80 °C.
10. Retire con cuidado el hielo alrededor de las secciones del criomolde.
11. Encierre en un círculo los grupos de células en portaobjetos con un bolígrafo hidrofóbico.
12. Rehidrate los portaobjetos en un frasco de tinción de portaobjetos que contenga PBS durante 15 min.
13. Agregue metanol frío al frasco de tinción de portaobjetos y coloque el frasco con portaobjetos a -20 °C durante 10 min.
14. Sumerge las diapositivas en un frasco de PBS.
15. Repita el paso 3.14 tres veces.
    NOTA: Utilice este método para todos los siguientes pasos de lavado.
16. Retire el PBS de los portaobjetos y cúbralo inmediatamente con 100 μL de solución de bloqueo con 2-5% de BSA en PBS-T.
17. Agregue la solución de bloqueo a cada portaobjetos y cúbralo con una película de parafina.
18. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente (15 -25 °C).
19. Diluir los anticuerpos primarios en la solución bloqueante utilizando las proporciones proporcionadas en la sección Reactivos y soluciones.
20. Retire la solución de bloqueo de los portaobjetos.
21. Agregue inmediatamente anticuerpos diluidos y cubra los portaobjetos con parafilm para evitar que el portaobjetos se seque.
22. Incubar durante la noche a 4 °C.
23. Al día siguiente, lave los portaobjetos de 3 a 5 veces con PBS-T.
24. Preparar anticuerpos secundarios diluidos y tinción de ADN.
25. Retire el exceso de PBS-T de los portaobjetos.
26. Agregue anticuerpos secundarios diluidos y tinción de ADN. Incubar durante 45 min a temperatura ambiente (15 -25 °C).
27. Lave los portaobjetos de 3 a 5 veces con PBS-T.
28. Retire cualquier líquido de los portaobjetos.
29. Agregue una gota de medio de montaje histológico a cada sección.
30. Cubra el portaobjetos con una cubierta de vidrio.
31. Tome fotografías de los portaobjetos teñidos con un microscopio fluorescente.

4. GSIS (ensayo de secreción de insulina estimulada por glucosa)

1. Prepare tres soluciones diferentes: solución KREBS baja en glucosa, solución KREBS alta en glucosa y solución KREBS baja en glucosa con KCl.
2. Calentar todas las soluciones a 37 °C baño de agua.
3. Seleccione cuidadosamente entre 10 y 15 grupos de tamaño similar con una punta de pipeta de 1000 μL y transfiérelos a un tubo de 1,5 ml junto con una pequeña cantidad de medio diferenciado para evitar que se sequen los grupos.
   NOTA: Los grupos deben ser visibles a simple vista, pero si no es así, coloque la placa que contiene los grupos diferenciados bajo un microscopio invertido para seleccionar los grupos y transferirlos a un tubo de 1,5 ml.
4. Coloque el tubo con los racimos y el medio en una rejilla para tubos y espere a que los racimos se hundan hasta el fondo del tubo.
5. Aspirar lentamente el sobrenadante con una pipeta de 200 μL y añadir 200 μL de solución KREBS baja en glucosa.
6. Incubar los islotes en la solución baja en glucosa durante 1 h a 37 °C.
   NOTA: Para garantizar la evaluación precisa del número de racimos y la consistencia en los experimentos, se recomienda verificar la presencia de todos los conglomerados en la solución durante la transferencia, ya que tienden a adherirse al tubo.
7. Retire el tubo de la incubadora y aspire lentamente 200 μL de solución KREBS sin aspirar ningún racimo.
8. Añadir 200 μL de solución KREBS baja en glucosa e incubar durante 30 min a 37 °C.
9. Aspire el volumen de 200 μL de solución KREBS baja en glucosa en un tubo de 500 μL y guárdelo inmediatamente a -80 °C para mediciones de insulina. Repita para tratamientos separados.
10. Para lavar los racimos, añadir 200 μL de solución KREBS sin glucosa al tubo que contiene los racimos. Deje que los racimos se asienten en el fondo del tubo y retire con cuidado el sobrenadante sin perturbar los racimos.
11. Añadir 200 μL de solución KREBS con alto contenido de glucosa e incubar durante 30 min a 37 °C.
12. Aspire 200 μL de KREBS de glucosa alta en un tubo de 500 μL y guárdelo inmediatamente a -80 °C para la medición de insulina. Repita para tratamientos separados.
13. Para lavar los racimos, añadir 200 μL de solución KREBS sin glucosa al tubo que contiene los racimos. Deje que los racimos se asienten en el fondo del tubo y retire con cuidado el sobrenadante sin perturbar los racimos.
14. Agregue 200 μL de solución de KCl KREBS y repita para tratamientos separados.
15. Incubar durante 30 min a 37 °C.
16. Aspirar 200 μL de solución KREBS de KCl en un tubo de 500 μL y almacenarlo inmediatamente a -80 °C para mediciones de insulina. Repita el procedimiento para otros tratamientos.
17. Añadir 50 μL de agua ultrapura y proceder a medir el contenido total de insulina.
18. Añadir 150 μL de solución ácida de etanol al tubo con islotes y agua ultrapura.
19. Almacenar las muestras a 4 °C durante la noche (12 - 15 h).
20. Al día siguiente, vórtice cada muestra.
21. Realice la sonicación con un sonicador eléctrico ajustado al 20% de potencia durante 1 s para garantizar una lisis completa del tejido de los islotes.
    NOTA: Repita el paso 4.21 hasta que no queden clústeres visibles.
22. Centrifugar todas las muestras a 10.000 × g durante 10 min y mantener el sobrenadante.
23. Mida la concentración de ADN con un espectrofotómetro de nanogotas, que luego se puede usar para normalizar las mediciones de insulina.

Resultados

El protocolo descrito en este artículo ofrece un enfoque altamente eficiente para diferenciar las células similares a β de las hPSC¹⁰. Este proceso utiliza un sistema de cultivo 2D que es fácilmente escalable, lo que permite su uso en diversos entornos experimentales, como el aprendizaje de la diferenciación, proyectos y laboratorios más pequeños, y pruebas piloto para evaluar el potencial de una línea iPSC para la diferenciación.

Es esencial caracterizar las p...

Discusión

El éxito de la diferenciación de las hPSC en células β pancreáticas depende de la optimización de todos los aspectos del cultivo rutinario y del paso de las hPSC seleccionadas. Esto incluye asegurarse de que la línea celular tenga un cariotipo normal, sea negativa para la infección por micoplasma y esté libre de genomas de plásmidos o vectores virales. Además, cuando se utilizan hiPSC, es importante evitar el uso de los primeros pasajes que aún están en proceso de reprogramación, para experimentos piloto. E...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube	Starlabs	S1615-5500
6-well Cell culture plate	ThermoFisher Scientific	165218
AggreWell 400 6-well plate	STEMCELL Technologies	34425
Anti-Glucagon	Sigma-aldrich	G2654-100UL
Anti-Insulin	Dako	A0564
Anti-NKX6.1	Novus Biologicals	NBP1-49672SS
Anti-PDX1	Abcam	ab84987
Aphidicolin	Sigma-Aldrich	A4487
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid free	Sigma-Aldrich	A3803-100G
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Calcium/Magnesium free D-PBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
Cyclopamine-KAAD	Calbiochem	239804
D-(+)-Glucose,BioXtra	Sigma-Aldrich	G7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrous	Sigma-Aldrich	94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10566016	For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS.
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Thermo Fisher Scientific	10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides	Thermo Fisher Scientific	10149870
Ethanol	VWR	20821.33
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XX	Thermo Fisher Scientific	J64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647	Abcam	ab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Thermo Fisher Scientific	A-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11011
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H3375-500G
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	H1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0094
Hydrogen chloride	Sigma-Aldrich	295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Agar Scientific	AGG4582
LDN193189	Sigma-Aldrich	SML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272-500G
OCT Compound 118 mL	Agar Scientific	AGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents	Thermo Fisher Scientific	7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS)	Thermo Fisher Scientific,	15070-063
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Recombinant Human EGF Protein	R&D Systems	236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mm	VWR	631-0137
RepSox (Hydrochloride)	STEMCELL Technologies	72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	61870036	For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014-500G
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	7558-80-7
STEMdiff Endoderm	STEMCELL Technologies	5110
StemFlex Medium	Thermo Fisher Scientific	A3349401	Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Retinoic Acid	Reprocell	04-0021
Thyroid Tormone 3 (T3)	Sigma-Aldrich	T6397
Trypan Blue Solution, 0.4%	ThermoFisher Scientific	15250061
TrypL Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher Scientific	12604013
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture	Thermo Fisher Scientific	38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	72302
Zinc Sulfate	Sigma-Aldrich	Z4750