Protocolo optimizado para generar células pancreáticas funcionales secretoras de insulina a partir de células madre pluripotentes humanas

Resumen

Este artículo presenta un protocolo para la diferenciación dirigida y el análisis funcional de células similares a β células. Describimos las condiciones óptimas de cultivo y los pasajes para las células madre pluripotentes humanas antes de generar células pancreáticas productoras de insulina. La diferenciación de seis etapas progresa desde la formación definitiva del endodermo hasta las células funcionales similares a las células β que secretan insulina en respuesta a la glucosa.

Resumen

Las células madre pluripotentes humanas (hPSC, por sus siglas en inglés) pueden diferenciarse en cualquier tipo de célula, lo que las convierte en una excelente fuente alternativa de células β pancreáticas humanas. Las hPSC pueden ser células madre embrionarias (hESC) derivadas del blastocisto o células pluripotentes inducidas (hiPSC) generadas directamente a partir de células somáticas mediante un proceso de reprogramación. Aquí se presenta un protocolo basado en video para describir las condiciones óptimas de cultivo y paso para las hPSC, antes de su diferenciación y posterior generación de células pancreáticas productoras de insulina. Esta metodología sigue el proceso de seis etapas para la diferenciación dirigida a las células β, en el que las hPSC se diferencian en endodermo definitivo (DE), tubo intestinal primitivo, destino del intestino anterior posterior, progenitores pancreáticos, progenitores endocrinos pancreáticos y, en última instancia, células β pancreáticas. Cabe destacar que esta metodología de diferenciación tarda un periodo de 27 días en generar células β pancreáticas humanas. El potencial de la secreción de insulina se evaluó a través de dos experimentos, que incluyeron inmunotinción y secreción de insulina estimulada por glucosa.

Introducción

Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) tienen la capacidad única de diferenciarse en varios tipos de células, lo que las convierte en una alternativa viable^{a las células} β pancreáticas humanas. Estas hPSCs se clasifican en dos tipos: células madre embrionarias (hESCs), derivadas del blastocisto², y células pluripotentes inducidas (hiPSCs), generadas por la reprogramación directa de células somáticas³. El desarrollo de técnicas para diferenciar las hPSCs en células β tiene importantes implicaciones tanto para la investigación fundamental como para la práctica clínica....

Protocolo

Antes de iniciar la diferenciación, se recomienda determinar el número requerido de organoides similares a islotes con fines experimentales. En una placa de 6 pocillos, un solo pocillo con más del 80% de confluencia suele constar de 2-2,3 millones de hPSC. Si bien una predicción precisa es un desafío debido a las variaciones en las líneas de hPSC y la eficiencia de diferenciación, una estimación aproximada es 1,5 veces el número de pozos iniciales. Una diferenciación dirigida de manera efectiva generalmente produce de 1,6 a 2 millones de células por pocillo en placas de seis pocillos, que abarcan todas las células dentro de los grupos en lugar de exclusivamente célula....

Discusión

El éxito de la diferenciación de las hPSC en células β pancreáticas depende de la optimización de todos los aspectos del cultivo rutinario y del paso de las hPSC seleccionadas. Esto incluye asegurarse de que la línea celular tenga un cariotipo normal, sea negativa para la infección por micoplasma y esté libre de genomas de plásmidos o vectores virales. Además, cuando se utilizan hiPSC, es importante evitar el uso de los primeros pasajes que aún están en proceso de reprogramación, para experimentos piloto. E.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube	Starlabs	S1615-5500
6-well Cell culture plate	ThermoFisher Scientific	165218
AggreWell 400 6-well plate	STEMCELL Technologies	34425
Anti-Glucagon	Sigma-aldrich	G2654-100UL
Anti-Insulin	Dako	A0564
Anti-NKX6.1	Novus Biologicals	NBP1-49672SS
Anti-PDX1	Abcam	ab84987
Aphidicolin	Sigma-Aldrich	A4487
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid free	Sigma-Aldrich	A3803-100G
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Calcium/Magnesium free D-PBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
Cyclopamine-KAAD	Calbiochem	239804
D-(+)-Glucose,BioXtra	Sigma-Aldrich	G7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrous	Sigma-Aldrich	94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10566016	For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS.
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Thermo Fisher Scientific	10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides	Thermo Fisher Scientific	10149870
Ethanol	VWR	20821.33
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XX	Thermo Fisher Scientific	J64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647	Abcam	ab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Thermo Fisher Scientific	A-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11011
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H3375-500G
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	H1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0094
Hydrogen chloride	Sigma-Aldrich	295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Agar Scientific	AGG4582
LDN193189	Sigma-Aldrich	SML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272-500G
OCT Compound 118 mL	Agar Scientific	AGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents	Thermo Fisher Scientific	7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS)	Thermo Fisher Scientific,	15070-063
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Recombinant Human EGF Protein	R&D Systems	236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mm	VWR	631-0137
RepSox (Hydrochloride)	STEMCELL Technologies	72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	61870036	For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014-500G
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	7558-80-7
STEMdiff Endoderm	STEMCELL Technologies	5110
StemFlex Medium	Thermo Fisher Scientific	A3349401	Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Retinoic Acid	Reprocell	04-0021
Thyroid Tormone 3 (T3)	Sigma-Aldrich	T6397
Trypan Blue Solution, 0.4%	ThermoFisher Scientific	15250061
TrypL Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher Scientific	12604013
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture	Thermo Fisher Scientific	38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	72302
Zinc Sulfate	Sigma-Aldrich	Z4750