Una técnica de visualización en 3D para la remodelación ósea en un modelo de ratón de expansión de sutura

Resumen

Este protocolo presenta un modelo de ratón estandarizado de expansión de sutura y un método de visualización 3D para estudiar los cambios mecanobiológicos de la sutura y la remodelación ósea bajo carga de fuerza de tracción.

Resumen

Las suturas craneofaciales juegan un papel crucial más allá de ser articulaciones fibrosas que conectan los huesos craneofaciales; También sirven como nicho principal para el crecimiento de los huesos del calvario y la cara, albergando células madre mesenquimales y osteoprogenitores. Como la mayoría de los huesos craneofaciales se desarrollan a través de la osificación intramembranosa, las regiones marginales de las suturas actúan como puntos de iniciación. Debido a esta importancia, estas suturas se han convertido en objetivos intrigantes en terapias ortopédicas como la expansión de la bóveda craneal asistida por resorte, la expansión maxilar rápida y la protracción maxilar. Bajo la fuerza de trazado ortopédico, las células madre de sutura se activan rápidamente, convirtiéndose en una fuente dinámica para la remodelación ósea durante la expansión. A pesar de su importancia, los cambios fisiológicos durante los períodos de remodelación ósea siguen siendo poco conocidos. Los métodos tradicionales de corte, principalmente en la dirección sagital, no capturan los cambios integrales que ocurren a lo largo de toda la sutura. Este estudio estableció un modelo estándar de ratón para la expansión de la sutura sagital. Para visualizar completamente los cambios de remodelación ósea después de la expansión de la sutura, el método de limpieza de tejido PEGASOS se combinó con tinción de EdU de montaje completo y doble marcaje quelante de calcio. Esto permitió la visualización de células altamente proliferantes y la formación de hueso nuevo en todos los huesos del calvario después de la expansión. Este protocolo ofrece un modelo de ratón de expansión de sutura estandarizado y un método de visualización en 3D, que arroja luz sobre los cambios mecanobiológicos en las suturas y la remodelación ósea bajo carga de fuerza de tracción.

Introducción

Las suturas craneofaciales son tejidos fibrosos que conectan los huesos craneofaciales y desempeñan un papel esencial en el crecimiento y la remodelación de los huesos craneofaciales. La estructura de la sutura se asemeja a un río, proporcionando un flujo de recursos celulares para nutrir y construir la "orilla del río", conocidos como frentes osteogénicos, que contribuyen a la formación de huesos craneofaciales a través de la osteogénesis intramembranosa¹.

El interés en las suturas craneofaciales ha sido impulsado por las necesidades clínicas de comprender el cierre prematuro de las suturas craneales y la disfunción de la sutura facial, que puede conducir a deformidades craneofaciales e incluso afecciones potencialmente mortales en los niños. La suturectomía abierta se utiliza de forma rutinaria en el tratamiento clínico, pero el seguimiento a largo plazo ha demostrado una recurrencia incompleta de la reosificación en algunos pacientes². La craneotomía mínimamente invasiva asistida por resortes de expansión o la craniectomía endoscópica con rayas puede proporcionar un enfoque más seguro para preservar la sutura potencial en lugar de descartar los tejidos³. Del mismo modo, las terapias ortopédicas, como las mascarillas y los aparatos de expansión, han sido ampliamente utilizadas para tratar la hipoplasia maxilar sagital u horizontal, y algunos estudios han ampliado la limitación de edad para tratar a pacientes adultos mediante expansores palatinos asistidos por minitornillos ^4,5,6. Además, la regeneración de la sutura craneal con células madre mesenquimales (MSC) combinadas con materiales biodegradables es una terapia potencial en el futuro, que ofrece una dirección novedosa para el tratamiento de enfermedades relacionadas⁷. Sin embargo, la función, el proceso o mecanismo regulador de las suturas sigue siendo difícil de alcanzar.

El remodelado óseo consiste principalmente en un equilibrio entre la formación ósea realizada por los osteoblastos y la resorción ósea realizada por los osteoclastos, donde la diferenciación osteogénica de las células madre estimuladas por señales mecánicas juega un papel importante. Después de décadas de investigación, se ha encontrado que las suturas craneofaciales son nichos de células madre mesenquimales altamente plásticas⁸. Las células madre de sutura (SuSC) son un grupo heterogéneo de células madre, pertenecientes a las células madre mesenquimales (MSC) o a las células madre óseas (SSC). Las SuSC se marcan in vivo mediante cuatro marcadores, que incluyen Gli1, Axin2, Prrx1 y Ctsk. Las SuSC Gli1⁺ , en particular, han verificado estrictamente las características biológicas de las células madre, no solo exhibiendo una alta expresión de marcadores típicos de MSC, sino que también demostrando un excelente potencial osteogénico y condrogénico⁹. Investigaciones anteriores han demostrado que los SuSC Gli1⁺ contribuyen activamente a la formación de hueso nuevo bajo la fuerza de tracción, identificándolos como la fuente de células madre de sutura que apoyan la osteogénesis por distracción¹⁰.

En el pasado, se estudiaron in vitro extensas características mecánicas de las células madre a través de Flexcell, flexión de cuatro puntos, sistema de carga de microimanes y otros. Aunque se han identificado in vitro células mesenquimales derivadas de suturas craneales ^{de ratón 11}, y recientemente también se han aislado células madre mesenquimales de sutura humana¹², la respuesta biomecánica de las células de sutura sigue sin estar clara en el sistema in vitro. Para profundizar en el proceso de remodelación ósea, se ha establecido un modelo de expansión de sutura basado en el cultivo aislado de órganos de la calvaria, allanando el camino para establecer un modelo de expansión de sutura útil in vivo ^1,13. Los conejos¹⁴ y las ratas¹⁵ han sido los animales más utilizados en la investigación básica para la expansión de las suturas. Sin embargo, los ratones son los modelos animales preferidos para explorar enfermedades humanas debido a su genoma altamente homólogo con los humanos, numerosas líneas de modificación genética y una fuerte capacidad de hibridación reproductiva. Los modelos de ratón existentes de expansión de la sutura craneal suelen basarse en alambres de resorte de ortodoncia de acero inoxidable para aplicar fuerza de tracción a la sutura sagital^16,17. En estos modelos, se hacen dos orificios a cada lado de los huesos parietales para fijar el dispositivo de expansión, y los cables se incrustan debajo de la piel, lo que puede afectar el modo de activación celular.

En cuanto al método de visualización, la observación bidimensional de cortes en la dirección sagital se ha adoptado generalmente durante décadas. Sin embargo, teniendo en cuenta que el remodelado óseo es un proceso dinámico tridimensional complejo, la obtención de información tridimensional completa se ha convertido en una necesidad urgente. La técnica de transparencia tisular PEGASOS surgió para cumplir con este requerimiento^18,19. Ofrece ventajas únicas para la transparencia de los tejidos duros y blandos, lo que permite reproducir el proceso completo de remodelación ósea en un espacio tridimensional.

Para obtener una comprensión más profunda y completa de los cambios fisiológicos en los períodos de remodelación ósea, se estableció un modelo estándar de ratón de expansión de sutura sagital con un ajuste de resorte entre los soportes hechos a mano¹⁰. Con un procedimiento estandarizado de grabado y unión con ácido, el dispositivo de expansión podría adherirse firmemente al hueso craneal, generando una fuerza de tracción perpendicular a la sutura sagital. Además, se aplicó el método de limpieza de tejido PEGASOS después del doble marcaje del hueso mineralizado después de la expansión para visualizar completamente los cambios en el modelado óseo después de la expansión de la sutura.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales descritos aquí fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales del Noveno Hospital Popular de Shanghái, Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái (SH9H-2023-A616-SB). En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6 de 4 semanas de edad. Todos los instrumentos utilizados fueron esterilizados antes del procedimiento.

1. Elaboración del modelo de expansión de sutura

1. Preparación de dos soportes de retención.
   1. Use alambre australiano de 0.014 '' o alambre de acero inoxidable (consulte la tabla de materiales) para hacer un bucle helicoidal con alicates de alambre ligero. El diámetro del bucle es de 2 mm, y la cola de 1 mm está reservada en dos lados (Figura 1A).
   2. Esterilice los alambres y los soportes para la cirugía en un autoclave, esterilizador de plasma o esterilizante frío adecuado (por ejemplo, glutaraldehído).
2. Preparación de los muelles.
   1. Prepare resortes de acero inoxidable personalizados.
      NOTA: En este estudio se utiliza el resorte de presión con un diámetro de alambre de 0,2 mm, un diámetro externo de 1,5 mm, un espacio de intervalo de 1 mm y una longitud de 7 mm (Figura 1B). Cada muelle de compresión de 1 mm obtuvo un empuje de unos 30 g.
   2. Corte el resorte en una longitud disponible antes de fraguar. Confirme la fuerza del resorte especializado antes del experimento.
      NOTA: Los tamaños de los resortes varían siempre que la magnitud de la fuerza sea la misma en experimentos paralelos. La fuerza se mide mediante un instrumento de prueba uniaxial de mesa o un pequeño dinamómetro electrónico (ver Tabla de Materiales) si la condición es limitada. El cambio de longitud se evalúa según la magnitud de la fuerza (Figura 1C-E). En particular, es necesario cambiar el valor de carga de la fuerza del resorte en función de la edad, la condición ósea del ratón y los objetos de investigación.
   3. Prepare un alambre australiano recto o un alambre recto de acero de 7 mm de longitud y haga dos hojas de papel con diámetros de 2 mm para usar como barreras (Figura 1F).

2. Cirugía de expansión de la sutura sagital

1. Anestesia: Anestesiar a los ratones con tiletamina (25 mg/kg), zolazepam (25 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg). Al mismo tiempo, aplique ungüento oftálmico estéril en los ojos para evitar que se sequen las córneas. Juzgue la profundidad de la anestesia de los ratones a través de un pellizco en el dedo del pie.
   NOTA: Las siguientes características indican que el ratón está anestesiado correctamente: respiración lenta y constante, debilidad de las extremidades, relajación muscular, desaparición del reflejo de acupuntura de la piel y del reflejo de los párpados, así como un reflejo corneal más débil.
2. Eliminación y desinfección del pelo: Retire con cuidado el pelo de la parte superior de la cabeza con crema depilatoria; Evite tocarse los ojos. Poco después, use rondas alternas de yodoforo y alcohol al 75% para desinfectar el sitio quirúrgico. Administrar meloxicam (1 mg/kg) como analgesia a los ratones mediante inyección subcutánea.
3. Fijación de la posición del cuerpo: Coloque el ratón acostado boca abajo y use cintas quirúrgicas para fijar las extremidades en la mesa de operaciones.
4. Colgajo abierto del cuero cabelludo: Utilice unas tijeras quirúrgicas para realizar un colgajo arqueado a lo largo del cuero cabelludo cerca del cuello del ratón, exponiendo completamente la sutura sagital y el cráneo circundante. Después de eso, fije el colgajo del cuero cabelludo con una sutura 6-0 en la mesa de operaciones.
5. Pega los soportes de retención después del grabado ácido.
   1. Secar el cráneo y grabarlo con ácido fosfórico al 37% durante 20 s, y utilizar solución salina normal para limpiar el grabado ácido (Figura 2A). Un residuo calcáreo será evidente después de secar el cráneo con la pera de pipeta de goma.
   2. Cementar los dos soportes (preparados en el paso 1.1) a ambos lados de los huesos parietales a 3 mm de las suturas sagitales con un adhesivo fotopolimerizable (Figura 2B).
6. Restablezca el colgajo del cuero cabelludo.
   1. Vuelva a colocar manualmente el colgajo del cuero cabelludo (Figura 2C). Etiquete la posición de los soportes, corte dos pequeños agujeros en el cuero cabelludo en la posición correspondiente de los soportes de retención bilaterales y luego restablezca el cuero cabelludo con solapa.
   2. Al mismo tiempo, pasa los pequeños bucles a través de los agujeros para exponer la superficie de la piel. Suturar la incisión curva con una sutura 6-0 (Figura 2D). Se permiten de uno a tres días para la recuperación de la piel. Administrar meloxicam (1 mg/kg) a los ratones mediante inyección subcutánea cada 24 h durante 1 a 3 días.
      NOTA: Después de la cirugía, verifique diariamente la actividad del cuero cabelludo del ratón y si los soportes se caen. Existen varios tipos de piel en materia de color y grosor; La piel sana del cuero cabelludo mantendrá el color original y los bordes de la piel se fusionarán gradualmente después de la sutura. Si se encuentra una infección en el cuero cabelludo, o si el dispositivo quirúrgico se ha caído, retire al ratón del estudio y apasifíquelo.
7. Instale el resorte y el cable guía.
   1. Corte el resorte 1 mm más largo que la distancia entre los dos soportes.
   2. Comprima el resorte de presión seleccionado y colóquelo entre las pequeñas bobinas a ambos lados.
   3. Pase el alambre de acero inoxidable a través de las pequeñas bobinas y el resorte, y suelte el resorte para obtener un empuje inicial de aproximadamente 30 g.
   4. Compruebe que el cuero cabelludo debajo del área del resorte del mouse no tenga ninguna compresión.
   5. Después de confirmar que la unión es firme y no está suelta, pegue dos trozos de papel entre el resorte y los soportes con un adhesivo fotopolimerizable para colocar barreras en ambos extremos del resorte (Figura 2E, F).

3. Doble etiquetado de huesos mineralizados

1. Preparación de la solución madre.
   1. Prepare una solución de dilución con agua destilada que contenga 0,9% de NaCl y 2% de NaHCO₃.
   2. Utilice la solución diluyente para preparar 20 mg/ml de complejo de alizarina dihidratado y 10 mg/ml de calceína (consulte la tabla de materiales).
   3. Ajuste el pH a 7,4 con un dispositivo de medición de pH. Enjuague la sonda de pH entre mediciones para garantizar lecturas precisas.
   4. Coloque el tinte en un recipiente estéril y guárdelo en un refrigerador a 4 ° C; Se utiliza papel de aluminio para mantener la luz fuera.
2. Prepare la solución de trabajo. Antes de la inyección, diluir la solución madre a 1 mg/ml para el calcio y 2 mg/ml para el complejo de alizarina dihidratado utilizando una solución de disolución.
3. Inyectar intraperitonealmente 5 mg/kg de verde de calceína y 20 mg/kg de rojo de alizarina en dos puntos de tiempo para etiquetar los huesos mineralizados y analizar los cambios entre dos tiempos. Generalmente, recoja las muestras 12-14 h después de la inyección.
   NOTA: Caliente los tintes antes de la inyección y asegúrese de que el tiempo de inyección no sea inferior a 3 minutos. El intervalo de inyección depende del tiempo de expansión. En este estudio, el rojo de alizarina y el verde de calceína se inyectaron durante la noche (O/N) antes de la expansión y O/N antes de la recolección, respectivamente.
4. Recoja los huesos enteros de la pantorrilla preparados para el procedimiento de limpieza de tejidos un día después de la segunda inyección.

4. Tinción de EdU

1. Inyección intraperitoneal: Inyectar EdU por vía intraperitoneal 2 h antes de la eutanasia de los ratones (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente). La dosis es de 1 mg/10 g de peso corporal.
2. Preparación del cóctel de etiquetado: Mezclar solución salina tamponada con Tris (100 mmol/L final, pH 7,6), CuSO₄ (4 mmol/L final), Sulfo-cianina 3 Azide (2-5 μmol/L final) y Ascorbato de Sodio (100 mmol/L final, hecho fresco cada uso) (ver Tabla de Materiales).
3. Tinción de montaje completo de EdU: Después del paso de decoloración del tejido en el método de limpieza de tejidos PEGASOS (paso 7), coloque las muestras en el cóctel de etiquetado durante 1 día a temperatura ambiente (RT).

5. Imágenes de microtomografía computarizada

1. Fijación y almacenamiento de tejidos: Fijar los huesos de la pantorrilla en paraformaldehído (PFA) al 4% a 4 °C O/N y almacenarlos en PFA al 0,5% antes de escanear.
2. Escaneo y análisis: Escanee las muestras con un sistema de imágenes de microtomografía computarizada (μCT) con alta resolución y un tamaño de vóxel de 7 μm.

6. Preparación de la solución de trabajo para la limpieza de tejidos PEGASOS

1. Poliformaldehído (PFA) al 4%: Disuelva 4 g de polvo de PFA en 1× PBS a 100 ml.
2. Solución de perfusión cardíaca: Heparina al 0,02%, es decir, 20 mg de heparina en polvo disuelto en 1× PBS a 100 mL; alternativamente, utilice 0,05 mol/L de EDTA, es decir, 0,05 mol de ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) (véase la Tabla de materiales), disuelto en una solución acuosa desionizada hasta un volumen total de 1 L.
3. Solución de descalcificación: 0,5 mol/L de EDTA, es decir, 0,5 mol de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), disuelto en una solución acuosa desionizada hasta un volumen total de 1 L.
4. Solución de decoloración: Quadrol al 25%, que son 250 ml de Quadrol (N, N, N', N' - Tetrakis (2-hidroxipropil) etilendiamina) (ver Tabla de materiales) disuelto en agua desionizada hasta un volumen total de 1 L.
   NOTA: Debido a la viscosidad de Quadrol, se puede calentar a 60 °C para aumentar su fluidez antes de la configuración.
5. Solución desengrasante: terc-butanol (tB) al 30%, 50%, 70% (ver Tabla de Materiales), preparada con agua por fracción volumétrica.
   NOTA: Teniendo en cuenta que la tB pura es cristalina a temperatura ambiente, debe calentarse a 60 °C hasta que se disuelva antes de poder utilizarse. Posteriormente, se añade entre un 3% y un 5% (v/v) de trietanolamina (TEA) para regular el pH de la solución >9,5.
6. Solución de deshidratación: Solución TB-PEG, 70% tB + 27% PEG-MMA + 3% Quadrol (v/v), en la que PEG-MMA es poli (etilenglicol) metil éter metacrilato con un peso molecular medio de 500 (poli (etilenglicol) metacrilato 500, PEG-MMA 500) (ver Tabla de Materiales).
7. Solución transparente: solución BB-PEG, 75% BB + 22% PEG-MMA + 3% Quadrol (v/v), en la que BB es benzoato de bencilo (BB).

7. Transparencia de los huesos del calvario con el método PEGASOS

1. Anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal de anestésicos (paso 2.1) y juzgar la profundidad de la anestesia del ratón a través de la reacción de pellizco para asegurarse de que no haya reacción de resistencia antes de la perfusión cardíaca.
2. Realizar perfusión y fijación cardíaca.
   1. Sostenga el abdomen del ratón hacia arriba, fije las extremidades con cinta adhesiva y corte con cuidado a lo largo de la circunferencia del tórax para exponerlo por completo.
   2. Inmediatamente después de realizar una pequeña incisión en la aurícula derecha con unas tijeras oftálmicas, inserte una aguja de perfusión 22 G en el ápice del ventrículo izquierdo.
      NOTA: Solo se inserta la punta de la aguja para evitar dañar la válvula cardíaca a través de una inserción excesiva. De lo contrario, el líquido de perfusión cardíaca entrará en la circulación pulmonar, afectando el efecto de perfusión de la circulación sistémica.
   3. Empuje el líquido de perfusión cardíaca de 30-50 ml (paso 6.2) en la jeringa. Se puede ver que el hígado gradualmente se vuelve pálido de rojo brillante.
   4. Después de que el líquido de salida de la aurícula derecha se vuelva completamente transparente, infunda una solución de PFA al 4% en el mismo volumen. La operación de perfusión de PFA se lleva a cabo en una campana ventilada.
   5. Diseccionar y separar los tejidos y órganos, y fijarlos durante la noche con PFA al 4% a 4 °C.
3. Descalcificación de tejidos: Para muestras procesadas por tinción de EdU, colocar el tejido duro fijado en una solución de EDTA (pH 7,0) 0,5 mol/L (10 mL) en una mesa vibratoria a 37 °C durante aproximadamente 2 días y cambiar el líquido diariamente.
   NOTA: Omita el proceso de descalcificación en el método PEGASOS normalizado para los huesos marcados con agente quelante de calcio para preservar completamente la señalización. La descalcificación es necesaria para tratar los huesos y visualizar la fluorescencia endógena o las señales inmunoteñidas de montaje completo.
4. Decoloración de los tejidos: Colocar los huesos fijos del calvario en una solución de Quadrol al 25% (20 mL) en una mesa agitadora a 37 °C durante 1 día, y cambiar el líquido una vez.
   NOTA: El tiempo de decoloración está relacionado con el contenido de hemo en el tejido. Observe el color del líquido de tratamiento, ya que la profundidad del color representa la necesidad de continuar con el tratamiento de reemplazo de líquidos.
5. Tinción de EdU: Enjuague las muestras en 1× PBS durante 5 min (tres veces) y luego sumérjalas en el cóctel de etiquetado durante 1 día. Después de eso, enjuague las muestras en 1× PBS durante 1 h (tres veces).
6. Desengrasado y deshidratación de tejidos
   1. Coloque los tejidos en soluciones de 30 % tB, 50 % tB y 70 % tB en secuencia para realizar la disminución del gradiente en una mesa vibratoria a 37 °C. Colocar en cada concentración durante aproximadamente 2 h.
   2. Posteriormente, deshidratar las muestras en solución TB-PEG durante 6 h sobre una mesa vibratoria a 37 °C.
      NOTA: El tiempo de procesamiento anterior puede aumentarse o disminuirse según el número de tejidos.
7. Transparencia del tejido: Colocar el tejido completamente deshidratado en una solución BB-PEG sobre una mesa agitadora a 37 °C (2-4 h) hasta que esté transparente. Actualmente, las muestras se pueden almacenar hasta 1-2 años.
   NOTA: Después de limpiar casi por completo, abra la tapa del tubo para exponer las muestras y el medio al aire con agitación para mejorar aún más la transparencia. Este método es adecuado para mejorar la transparencia de los tejidos y órganos individuales, así como de toda la cabeza y el cuerpo de ratones jóvenes. Sin embargo, para la transparencia de todo el cuerpo de ratones adultos, los pasos anteriores deben realizarse utilizando un método de perfusión de ciclo completo.

8. Imágenes

NOTA: En este estudio se utilizó microscopía confocal para la visualización en 3D de tejidos transparentes. La microscopía de lámina de luz también es apropiada para este protocolo. Se ha verificado que varios sistemas operativos están disponibles antes. Aquí, se toma como ejemplo un sistema operativo de microscopio confocal láser (ver Tabla de materiales).

1. De acuerdo con el manual del usuario, siga los pasos correctos para abrir la interfaz de operación confocal láser y LAS AF. Encienda el láser requerido en diferentes canales de disparo y ajuste la potencia. Establezca la ruta óptica y la longitud de onda correspondiente, 561 nm para el rojo de alizarina y 488 nm para el verde de calceína, cualquiera de los cuales se utiliza para la señal EdU de acuerdo con el cóctel de etiquetado.
2. Coloque las muestras transparentes en la placa de Petri de vidrio cóncavo que puede transportar muestras gruesas, cajas de inclusión o dispositivos de colocación de fabricación propia, como pegamento impermeable, para sumergir las muestras transparentes en un líquido transparente.
3. Seleccione una lente de objetivo de baja potencia para localizar rápidamente la muestra. Haga una visión general de todo el tejido de la pantorrilla con la función de escaneo rápido y encuentre el área de interés para la obtención de imágenes.
4. Ajuste la potencia de salida, seleccione el modo de escaneo y ajuste primero los coeficientes de disparo (resolución, velocidad de escaneo, factor de zoom, calidad de imagen, ruido de fondo medio, etc.).
   NOTA: Generalmente, Smart Gain oscila entre 500 y 800 (tanto la señal como el ruido cambian); Smart Offset es lo más cercano posible a 0 al tiempo que garantiza la calidad de la imagen (para reducir el ruido de fondo). Cuando la ganancia PMT es superior a 800, o la ganancia HyD es superior al 100%, y el brillo sigue siendo insuficiente, la intensidad del láser se puede aumentar adecuadamente, pero en principio, cuanto más baja, mejor.
5. Establezca la distancia axial Z rango y el paso Z, que se profundiza desde el lado menos profundo de la organización transparente; es decir, establecer los lados más profundos y menos profundos.
   NOTA: Confirme la clasificación y la distancia de trabajo para cada lente. Ajuste con cuidado el rango Z y no opere la distancia de trabajo excediendo el límite de la lente seleccionada. El "z-Galvo" se puede seleccionar cuando se necesita una regulación fina.
6. Vuelva a ajustar los parámetros de disparo y comience a disparar. Una vez completado, fusione y procese las imágenes a través del módulo multifuncional. Finalmente, guarde y apague el instrumento en el orden indicado.

Resultados

Utilizando este protocolo, se ha establecido un modelo de ratón para la expansión de la sutura sagital (Figura 1-2). Para la visualización en 3D de los cambios en el modelado óseo después de la expansión de la sutura, se aplicó el método de limpieza de tejido PEGASOS a todos los huesos del calvario después de la expansión. Después de la perfusión, se separaron los huesos del calvario (Figura 3A) y se continuó con el...

Discusión

Se aplicó un modelo de ratón de expansión de sutura estándar para observar los cambios morfológicos regulares que ocurren cada semana durante todo el ciclo de remodelación de un mes de duración¹⁰. Este modelo es útil para investigar la remodelación y regeneración ósea del calvario mediante la expansión de las suturas del calvario, así como para estudiar varias células de sutura in vivo. Para presentar completamente los resultados de dicha investigación, se necesita una visu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Acid etching	Xihubiom	E10-02/1807011
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A3882
AUSTRALIAN WIRE	A.J.WILCOCK	0.014''
Benzyl benzoate	Sigma-Aldrich	B6630
Calcein green	Sigma-Aldrich	C0875
Copper(II) sulfate, anhydrous	Sangon Biotech	A603008
Dynamometer	Sanliang	SF-10N
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
EdU	Invitrogen	E104152
Laser Confocal Microscope	Leica	SP8
PBS	Sangon Biotech	E607008
PEG-MMA 500	Sigma-Aldrich	447943
PFA	Sigma-Aldrich	P6148
pH Meters	Mettler Toledo	S220
Quadrol	Sigma-Aldrich	122262
Sodium Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
Sodium bicarbonate	Sangon Biotech	A500873
Sodium chloride	Sangon Biotech	A610476
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Spring	TAOBAO	0.2*1.5*1*7
Sulfo-Cyanine3 azide	Lumiprobe	A1330
tert-Butanol	Sigma-Aldrich	360538	Protect from light. Do not freeze.
Transbond MIP Moisture Insensitive Primer	3M Unitek	712-025
Transbond XT Light Cure Adhesive Paste	3M Unitek	712-035
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	V900257
Tris-buffered saline	Sangon Biotech	A500027