Desarrollo y caracterización de hidrogeles de matriz extracelular pulmonar descelularizada

Resumen

El protocolo dilucida dos metodologías de descelularización distintas aplicadas a los tejidos pulmonares bovinos nativos, proporcionando una descripción completa de sus respectivas caracterizaciones.

Resumen

El uso de hidrogeles derivados de la matriz extracelular (MEC) en la ingeniería de tejidos se ha vuelto cada vez más popular, ya que pueden imitar el entorno natural de las células in vitro. Sin embargo, mantener el contenido bioquímico nativo de la MEC, lograr la estabilidad mecánica y comprender el impacto del proceso de descelularización en las propiedades mecánicas de los hidrogeles de la MEC es un desafío. Aquí, se describió una línea para la descelularización del tejido pulmonar bovino utilizando dos protocolos diferentes, la caracterización posterior de la efectividad de la descelularización, la fabricación de hidrogeles de MEC pulmonar descelularizada reconstituida y la evaluación de sus propiedades mecánicas y de citocompatibilidad. La descelularización del pulmón bovino se llevó a cabo mediante un método físico (ciclos de congelación-descongelación) o químico (a base de detergente). Se realizó tinción con hematoxilina y eosina para validar la descelularización y retención de los principales componentes de la MEC. Para la evaluación del contenido residual de colágeno y glicosaminoglicanos sulfatados (sGAG) dentro de las muestras descelularizadas, se emplearon técnicas de tinción con rojo de Sirio y azul alcián, respectivamente. Las propiedades mecánicas de los hidrogeles de MEC pulmonar descelularizados se caracterizaron mediante reología oscilatoria. Los resultados sugieren que los hidrogeles pulmonares bovinos descelularizados pueden proporcionar una alternativa organotípica fiable a los productos comerciales de MEC al conservar la mayoría de los componentes nativos de la MEC. Además, estos hallazgos revelan que el método de descelularización elegido afecta significativamente a la cinética de gelificación, así como a la rigidez y las propiedades viscoelásticas de los hidrogeles resultantes.

Introducción

Las condiciones convencionales de cultivo de monocapa no ofrecen una representación fiel de los microambientes de los tejidos nativos y carecen de la capacidad de proporcionar un andamio tridimensional (3D) con ligandos instructivos que permitan las interacciones célula-matriz y célula-célula¹. La composición de la matriz extracelular (MEC) y las propiedades mecánicas son altamente específicas de los tejidos, dependientes del tiempo y sufren alteraciones en condiciones patológicas. Por lo tanto, existe la necesidad de modelos tisulares biomiméticos en 3D que permitan la sintonización de dichas características, la modulación del comportamiento celular y el logro de la funcionalidad tisular deseada. Los biomateriales nativos derivados de la MEC atraen mucha atención en la ingeniería de tejidos con la capacidad de utilizar directamente la MEC 1,2,3,4,5 específica del tejido. Los portadores basados en ECM se han utilizado en muchas aplicaciones, desde la regeneración de tejidos hasta el desarrollo de modelos de enfermedades. Se utilizan como andamios de biomateriales inyectables o implantables ^4,5, en aplicaciones de cribado de fármacos ^6,7, en el desarrollo de materiales que inducen el crecimiento celular ^8,9,10, como biotintas 11,12,13, en microfluídica¹⁴ y en modelos de tejido canceroso 15,16,17^,18,19.

La descelularización de tejidos y órganos es un enfoque popular para generar andamios que imitan la MEC específica del tejido. La reconstitución de tejidos y órganos descelularizados en hidrogeles permite la inclusión de células en modelos biomiméticos de tejidos 3D²⁰. Las técnicas de descelularización se centran principalmente en eliminar los componentes celulares conservando la composición de la MEC. Los métodos físicos, como los ciclos de congelación y descongelación o los procesos químicos, como el tratamiento con Triton-X-100, se aplican comúnmente para descelularizar los tejidos. Además, se prefiere el tratamiento con DNasa para eliminar el ADN residual con el fin de minimizar las respuestas inmunológicas tras la inclusión celular. Es fundamental lograr la máxima eliminación celular y el mínimo deterioro de la MEC para optimizar los procedimientos de descelularización²¹. Además de estos aspectos, la caracterización de las propiedades bioquímicas y mecánicas de los andamios reconstituidos, incluyendo la viscoelasticidad y la rigidez, es crucial para mejorar los modelos de tejidos 3D de ingeniería derivados de matrices nativas²⁰.

La MEC específica de órganos en la ingeniería de tejidos pulmonares permite imitar el microambiente pulmonar para modelar procesos de desarrollo, homeostáticos o patológicos in vitro y probar terapias en un entorno fisiomimético 20,22,23. Estudios anteriores han demostrado la descelularización del tejido pulmonar de varias especies, como ratas, porcinos y humanos, pero estos métodos aún no se han adaptado a especies de uso menos frecuente, como los bovinos. Una mejor comprensión de los parámetros del proceso de descelularización y cómo afectan a los andamios de MEC reconstituidos resultantes en cuanto a composición bioquímica y propiedades mecánicas permitirá un mejor ajuste de estos aspectos y allanará el camino para modelos de tejidos más fiables en salud y enfermedad. En este estudio, se describe explícitamente la descelularización pulmonar bovina con dos métodos distintos, ciclos de congelación-descongelación y tratamiento con Triton-X-100, seguida de análisis bioquímicos y mecánicos de hidrogeles de MEC pulmonar descelularizada (dECM). Los resultados revelan que ambos métodos producen una descelularización y retención efectivas de los ligandos de la MEC. En particular, la elección del método altera significativamente la rigidez y la viscoelasticidad resultantes de los hidrogeles reconstituidos. Los hidrogeles derivados de la dECM bovina demuestran notables analogías bioquímicas con la matriz extracelular del pulmón humano, y exhiben características confiables de gelificación térmica²⁰. Como se describió anteriormente, ambos métodos son adecuados para el cultivo 3D de células de cáncer de pulmón, células epiteliales bronquiales sanas y organoides pulmonares derivados del paciente²⁰.

Protocolo

Los pulmones nativos frescos de donantes bovinos jóvenes (1-2 años de edad) se obtuvieron de un matadero local y se transportaron en un recipiente de plástico sellado sobre hielo al laboratorio. El sacrificio de animales se realiza para el consumo general de carne (pulmones desechados como desechos) y no está relacionado ni se debe al estudio. Confirmamos que el matadero cumple con las leyes y regulaciones nacionales de sacrificio de animales. Además, confirmamos que solo utilizamos material de desecho y que el proyecto de investigación no tuvo un efecto en el número de animales sacrificados.

1. Extracción de órganos y preparación de tejidos

1. Almacenar los tejidos pulmonares bovinos recién obtenidos a -80 °C hasta el experimento.
2. El día del experimento, espere a que los tejidos pulmonares congelados se descongelen a temperatura ambiente.
3. Diseccionar los tejidos con bisturíes estériles y tijeras para eliminar la tráquea y las vías respiratorias cartilaginosas, y luego picar en trozos pequeños (5 mm³).
4. Lávese bien con agua ultrapura que contenga un 2% de penicilina/estreptomicina (P/S) al menos 3 veces.

2. Descelularización de los tejidos

NOTA: Los tejidos pulmonares bovinos nativos se descelularizaron utilizando dos protocolos distintos.

1. Método de congelación-descongelación
   1. Prepare las muestras de tejido de acuerdo con el paso 1. Sumerja los pañuelos picados en una solución de yodo al 2% en agua destilada estéril (_dH2O) durante 1 min. Realizar dos lavados consecutivos en dH₂O. estériles.
   2. Transfiera los trozos de tejido picado a un tubo de 50 ml hasta el nivel de 15 ml e implemente cinco ciclos manuales de congelación y descongelación utilizando un recipiente portátil de nitrógeno líquido. Llene los tubos hasta arriba con dH₂O estéril y congele los tubos durante 2 minutos en nitrógeno líquido. Después de 2 minutos, transfiéralos inmediatamente a un baño de agua a 37 °C durante 10 minutos. Esto constituye 1 ciclo de congelación-descongelación.
   3. Incubar las muestras con 30 mL de solución de DNasa (10 U/mL) en tampón MgCl₂ de 10 mM (pH 7,5) durante 1 h a 37 °C bajo agitación constante a 100 rpm.
   4. Continuar con un lavado extenso con dH₂O estéril durante 3 días bajo agitación constante a 100 rpm, con reposición de la solución cada 24 h.
   5. Realice la liofilización y la criomolienda de la siguiente manera²⁰: Congele las muestras húmedas de dECM a -80 °C durante 24 h. Transfiera las muestras congeladas a un liofilizador y opere en modo de secado al vacío durante 3 a 4 días hasta que se seque por completo. Una vez finalizado el liofilizado, realice la molienda de las muestras hasta convertirlas en polvo fino utilizando un aparato de molienda y hielo seco.
      NOTA: Este estado de polvo fino se considera necesario debido a sus propiedades de solubilidad mejoradas durante las etapas posteriores del proceso de digestión.
2. Método Triton-X-100
   1. Prepare las muestras de tejido de acuerdo con el paso 1. Tratar los tejidos pulmonares con Triton-X-100 al 1% durante 3 días bajo una rotación suave a 4 °C. Cambiar la solución cada 24 h.
   2. Incubar las muestras con solución de DNasa (10U/mL) en tampón MgCl₂ de 10 mM (pH 7,5) durante 1 h a 37 °C bajo agitación constante.
   3. Continuar con un lavado extenso con dH₂O estéril durante 3 días bajo rotación suave, con reposición de la solución cada 24 h.
   4. Realice la liofilización seguida de la criomolienda como se describe en el paso 2.1.

3. Digestión de la pepsina

1. Digiera muestras de dECM en polvo a una concentración de 15 mg/ml (p/v) en solución de pepsina (1 mg/ml de pepsina en HCl 0,01 M, pH 2). Llevar a cabo el proceso de digestión de la muestra a temperatura ambiente bajo agitación constante durante 48 h y mantener el pH de la solución con frecuencia para una digestión eficaz.
2. Transfiera los digestores a un tubo y centrifugue a 5000 x g durante 10 min.
3. Recoger el sobrenadante y neutralizarlo y amortiguarlo a condiciones fisiológicas (pH 7, 1x solución salina tampón fosfato (PBS)) mediante la adición de 5M NaOH y 10x PBS.
   NOTA: Se sugiere utilizar soluciones alcalinas concentradas para el ajuste del pH de la digestión ácida, ya que este enfoque evita la expansión de volumen no deseada que podría afectar negativamente la gelificación en los pasos posteriores.
4. Almacene los digestos de pregel a -20 °C para estudios posteriores.

4. Tinción histológica

1. Fijar una pequeña porción (5^mm3) de muestra de tejido descelularizado en 1 mL de solución de formaldehído al 3,7% a 4 °C durante la noche.
2. Incubar los tejidos en tubos que contengan 1 ml de solución de sacarosa al 30% en PBS durante 12 h a 4 °C sobre una roca firme.
3. Para incrustar tejidos en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT), vierta 1 ml de OCT en un criomolde, coloque el tejido en el medio del criomolde y luego vierta 2 ml de OCT sobre el tejido.
4. Coloque los criomoldes que contienen tejidos sobre hielo seco y congele rápidamente con nitrógeno líquido. Las muestras están listas cuando la OCT se vuelve completamente blanca, lo que generalmente toma 3 minutos. Almacenar los pañuelos de papel incluidos en OCT a -20 °C hasta su uso.
5. Obtenga secciones de 10 μm en el criostato a -25 °C en un portaobjetos de vidrio recubierto de poli-L-lisina y transfiera el portaobjetos a temperatura ambiente para permitir que la sección de tejido se derrita en el portaobjetos. Guarde los portaobjetos a -20 °C hasta su uso.
6. Para confirmar la ausencia de núcleos después de la descelularización, realice una tinción de hematoxilina y eosina (H&E) como se describe a continuación.
   1. Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 10 min. Sumerja los portaobjetos en PBS y tíñalos con 50 ml de solución de hematoxilina lista para usar en un frasco de tinción durante 3 minutos, seguido de un lavado de 3 minutos con agua del grifo.
   2. Sumerja los portaobjetos en etanol al 95 % y tiña con 50 ml de solución de eosina al 0,5 % de alcohol en un frasco de tinción durante 45 s.
7. Realice la tinción con rojo Sirius para mostrar la retención del contenido de colágeno después de la descelularización.
   1. Hidratar los portaobjetos con PBS y sumergirlos en 50 mL de rojo Sirius al 0,1% en solución acuosa saturada de ácido pícrico en un frasco de tinción durante 1 h.
   2. Enjuague los portaobjetos en una solución de ácido acético al 0,5 % durante 5 s y deshidrate todos los portaobjetos sumergiéndolos en etanol al 70 %, 95 % y 100 % secuencialmente durante 1 minuto cada uno.
8. Para analizar el contenido de sGAG en muestras de tejido, realice la tinción con azul alcián como se describe a continuación.
   1. Sumerja los portaobjetos en 50 ml de azul alcián al 1% en una solución de ácido acético al 3% (pH 2,5) en un frasco de tinción durante 30 min. Lave los portaobjetos con agua corriente del grifo durante 2 minutos.
   2. Deshidrate todos los portaobjetos sumergiéndolos en etanol al 70%, 95% y 100% secuencialmente durante 1 minuto cada uno.
9. Agregue 0,1 ml de medio de montaje en la parte superior de las muestras y visualícelas mediante microscopía óptica con un aumento de 10x.

5. Caracterización mecánica

1. Implemente mediciones reológicas oscilatorias utilizando un reómetro con geometría de placa paralela.
2. Vierta 250 μL de solución de pregel mantenida en hielo en una placa inferior preenfriada (4 °C) para evitar una gelificación rápida.
3. Baje la placa paralela de 20 mm hasta que la solución de pregel forme un disco con un ancho de espacio de 1 mm entre las dos placas.
4. Inicie la medición inmediatamente. Mida los módulos de almacenamiento y pérdida a lo largo del tiempo con una frecuencia y deformación fijas mientras calienta la placa inferior a 37 °C durante 30 minutos para observar la cinética de gelificación. Utilice una frecuencia fija de 0,5 Hz y una deformación del 0,1%.
5. Realice una prueba de recuperación de fluencia después de que el valor del módulo de almacenamiento deje de aumentar y alcance una meseta.
6. Aplique una tensión cortante de 1 Pa al hidrogel durante 15 minutos, mida la deformación, descargue la muestra de la tensión y registre el cambio en el valor de la deformación durante 15 minutos.
7. Dibuja un gráfico de tensión frente al tiempo para mostrar el comportamiento de relajación del estrés. Repita las mediciones para tres resúmenes de dECM diferentes como réplicas.

Resultados

Descelularización
La descelularización del tejido pulmonar bovino para producir hidrogeles dECM que recapitularían el microambiente pulmonar nativo se ha logrado mediante métodos físicos (congelación-descongelación) y químicos (Triton-X-100). Después de la disección, las piezas de tejido se lavaron con antibióticos que contenían_dH2O para eliminar los patógenos que posteriormente pueden afectar a la esterilidad de los hidrogeles dECM. Se aplicó un total de cinco ciclos alternad...

Discusión

Los hidrogeles derivados de órganos se han convertido en modelos prometedores que recapitulan la MEC del tejido nativo e imitan la función celular organotípica. Aunque la MEC pulmonar descelularizada se ha utilizado a menudo en la ingeniería de tejidos, una caracterización exhaustiva de la composición del biomaterial y las propiedades mecánicas beneficiará una mejor comprensión de cómo se pueden modular las interacciones célula-MEC para modelar los procesos biológicos durante la homeostasis o la enfermedad. E...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	ISOLAB	64-17-5
Acetic acid	ISOLAB	64-19-7
Alcian blue solution	Sigma-Aldrich	B8438
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Discovery HR-2 rheometer	TA Instruments
Entellan mounting medium	Merck	107960
Eosin solution	Bright-slide	2.BS01-105-1000
Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50-980-485
Hydrochloric acid	Merck	100317
Iodine	Sigma-Aldrich	3002
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Mayer's haematoxylin staining solution	Merck	2.BS01-103-1000
O.C.T compound	Tissue-Tek	4583
Penicillin/Streptomycin	Biowest	L0018-100
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma-Aldrich	P6887
Picric acid	Polysciences	88-89-1
Sirius Red	Polysciences	09400-25
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Triton-X-100	Merck	112298