Desarrollo y caracterización de hidrogeles de matriz extracelular pulmonar descelularizada

Resumen

El protocolo dilucida dos metodologías de descelularización distintas aplicadas a los tejidos pulmonares bovinos nativos, proporcionando una descripción completa de sus respectivas caracterizaciones.

Resumen

El uso de hidrogeles derivados de la matriz extracelular (MEC) en la ingeniería de tejidos se ha vuelto cada vez más popular, ya que pueden imitar el entorno natural de las células in vitro. Sin embargo, mantener el contenido bioquímico nativo de la MEC, lograr la estabilidad mecánica y comprender el impacto del proceso de descelularización en las propiedades mecánicas de los hidrogeles de la MEC es un desafío. Aquí, se describió una línea para la descelularización del tejido pulmonar bovino utilizando dos protocolos diferentes, la caracterización posterior de la efectividad de la descelularización, la fabricación de hidrogeles de MEC pulmonar descelularizada reconstituida y la evaluación de sus propiedades mecánicas y de citocompatibilidad. La descelularización del pulmón bovino se llevó a cabo mediante un método físico (ciclos de congelación-descongelación) o químico (a base de detergente). Se realizó tinción con hematoxilina y eosina para validar la descelularización y retención de los principales componentes de la MEC. Para la evaluación del contenido residual de colágeno y glicosaminoglicanos sulfatados (sGAG) dentro de las muestras descelularizadas, se emplearon técnicas de tinción con rojo de Sirio y azul alcián, respectivamente. Las propiedades mecánicas de los hidrogeles de MEC pulmonar descelularizados se caracterizaron mediante reología oscilatoria. Los resultados sugieren que los hidrogeles pulmonares bovinos descelularizados pueden proporcionar una alternativa organotípica fiable a los productos comerciales de MEC al conservar la mayoría de los componentes nativos de la MEC. Además, estos hallazgos revelan que el método de descelularización elegido afecta significativamente a la cinética de gelificación, así como a la rigidez y las propiedades viscoelásticas de los hidrogeles resultantes.

Introducción

Las condiciones convencionales de cultivo de monocapa no ofrecen una representación fiel de los microambientes de los tejidos nativos y carecen de la capacidad de proporcionar un andamio tridimensional (3D) con ligandos instructivos que permitan las interacciones célula-matriz y célula-célula¹. La composición de la matriz extracelular (MEC) y las propiedades mecánicas son altamente específicas de los tejidos, dependientes del tiempo y sufren alteraciones en condiciones patológicas. Por lo tanto, existe la necesidad de modelos tisulares biomiméticos en 3D que permitan la sintonización de dichas características, la modulación del comportamiento c

Protocolo

Los pulmones nativos frescos de donantes bovinos jóvenes (1-2 años de edad) se obtuvieron de un matadero local y se transportaron en un recipiente de plástico sellado sobre hielo al laboratorio. El sacrificio de animales se realiza para el consumo general de carne (pulmones desechados como desechos) y no está relacionado ni se debe al estudio. Confirmamos que el matadero cumple con las leyes y regulaciones nacionales de sacrificio de animales. Además, confirmamos que solo utilizamos material de desecho y que el proyecto de investigación no tuvo un efecto en el número de animales sacrificados.

1. Extracción de órganos y preparación de

Resultados

Descelularización
La descelularización del tejido pulmonar bovino para producir hidrogeles dECM que recapitularían el microambiente pulmonar nativo se ha logrado mediante métodos físicos (congelación-descongelación) y químicos (Triton-X-100). Después de la disección, las piezas de tejido se lavaron con antibióticos que contenían_dH2O para eliminar los patógenos que posteriormente pueden afectar a la esterilidad de los hidrogeles dECM. Se aplicó un total de cinco ciclos alternad...

Discusión

Los hidrogeles derivados de órganos se han convertido en modelos prometedores que recapitulan la MEC del tejido nativo e imitan la función celular organotípica. Aunque la MEC pulmonar descelularizada se ha utilizado a menudo en la ingeniería de tejidos, una caracterización exhaustiva de la composición del biomaterial y las propiedades mecánicas beneficiará una mejor comprensión de cómo se pueden modular las interacciones célula-MEC para modelar los procesos biológicos durante la homeostasis o la enfermedad. E...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	ISOLAB	64-17-5
Acetic acid	ISOLAB	64-19-7
Alcian blue solution	Sigma-Aldrich	B8438
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Discovery HR-2 rheometer	TA Instruments
Entellan mounting medium	Merck	107960
Eosin solution	Bright-slide	2.BS01-105-1000
Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50-980-485
Hydrochloric acid	Merck	100317
Iodine	Sigma-Aldrich	3002
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Mayer's haematoxylin staining solution	Merck	2.BS01-103-1000
O.C.T compound	Tissue-Tek	4583
Penicillin/Streptomycin	Biowest	L0018-100
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma-Aldrich	P6887
Picric acid	Polysciences	88-89-1
Sirius Red	Polysciences	09400-25
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Triton-X-100	Merck	112298