Generación de iTenocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas a través de la sobreexpresión combinada de escleraxis y la tensión uniaxial 2D

Resumen

Este artículo describe un procedimiento para producir iTenocitos mediante la generación de células estromales mesenquimales derivadas de iPSC con sobreexpresión combinada de Scleraxis utilizando un vector lentiviral y estiramiento uniaxial a través de un biorreactor 2D.

Resumen

Los desafíos actuales en la reparación de tendones y ligamentos requieren la identificación de un candidato adecuado y eficaz para la terapia basada en células para promover la regeneración de los tendones. Las células estromales mesenquimales (MSC) se han explorado como una posible estrategia de ingeniería de tejidos para la reparación de tendones. Si bien son multipotentes y tienen potencial regenerativo in vivo, están limitados en su capacidad de autorrenovación y exhiben heterogeneidad fenotípica. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) pueden eludir estas limitaciones debido a su alta capacidad de autorrenovación y a su plasticidad de desarrollo sin precedentes. En el desarrollo de los tenocitos, la escleraxis (Scx) es un regulador molecular directo crucial de la diferenciación de los tendones. Además, se ha demostrado que la mecanorregulación es un elemento central que guía el desarrollo y la curación de los tendones embrionarios. Como tal, hemos desarrollado un protocolo para encapsular el efecto sinérgico de la estimulación biológica y mecánica que puede ser esencial para la generación de tenocitos. Las iPSC fueron inducidas a convertirse en células estromales mesenquimales (iMSC) y se caracterizaron con marcadores clásicos de células estromales mesenquimales mediante citometría de flujo. A continuación, utilizando un vector lentiviral, las iMSCs se transducieron a una sobreexpresión estable de SCX (iMSC^SCX+). Estas células^{iMSC SCX+} pueden madurar aún más en iTenocitos mediante carga de tracción uniaxial utilizando un biorreactor 2D. Las células resultantes se caracterizaron por la observación de la regulación positiva de los marcadores tendinosos tempranos y tardíos, así como la deposición de colágeno. Este método de generación de iTenocitos se puede utilizar para ayudar a los investigadores a desarrollar una fuente celular alogénica potencialmente ilimitada para aplicaciones de terapia celular tendinosa.

Introducción

Para hacer frente a los problemas contemporáneos en la reparación de tendones y ligamentos, se requiere una célula candidata pertinente adecuada para las terapias basadas en células. Una vía de investigación en ingeniería de tejidos para la reparación de tendones implica la exploración de células estromales mesenquimales derivadas de la médula ósea (BM-MSC) y células estromales derivadas del tejido adiposo (ASC) como posibles estrategias. Estas células tienen capacidad multipotente, gran abundancia y potencial regenerativo in vivo. Además, han demostrado una mayor capacidad de curación y mejores resultados funcionales en modelos animales¹

Protocolo

Este protocolo para producir iTenocytes se puede llevar a cabo en tres pasos principales: iPSC a iMSC (10 días), iMSC a iMSC^SCX+ (2 semanas), iMSC^SCX+ a iTenocytes (mínimo 4 días). Cada paso importante del protocolo se puede pausar y reiniciar más tarde, según el cronograma experimental. Para los métodos relacionados con el cultivo de células, se deben emplear técnicas estériles. Todas las células de este protocolo deben cultivarse a 37 °C, 5% de CO₂ y 95% de humedad.

1. Inducción de iPSC humanas en células estromales mesenquimales inducidas (iMSC)

1. Preparación del experimento

Discusión

En este protocolo, los iTenocitos se generan a través de tres pasos principales: (1) inducción de iPSCs a iMSCs, (2) sobreexpresión de SCX utilizando un vector lentiviral y (3) maduración de células a través de tensión uniaxial 2D.

El protocolo presentado para diferenciar las iPSCs en iMSCs ha sido descrito previamente por nuestro grupo². Desde esa publicación, se han desarrollado numerosos protocolos, incluido un protocolo establecido para el uso de iMSC en ens.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Accutase	StemCell Technologies	7920	cell dissociation reagent
Antibiotic-antimycotic solution	Thermofisher	15240096
Anti-CD105	Ancell	326-050
APC mouse anti-human CD44	BD Biosciences	559942
APC mouse IgG2 K isotype control	BD Biosciences	555745
BenchMark fetal bovine serum	GeminiBio	100-106
Biglycan	Thermofisher	Hs00959143_m1
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A3733
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer	Thermofisher	Hs00164004_m1
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer	Thermofisher	Hs00943809_m1
Dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	D8418
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red	Thermofisher	11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM)	ATCC	30-2003
Fibronectin bovine plasma	Sigma Aldrich	F1141
FITC mouse anti-human CD90	BD Biosciences	555595
Gelatin from porcine skin	Sigma Aldrich	G1890
Goat anti Mouse IgG1-PE	Bio-Rad	STAR117
HEK 293T/17	ATCC	CRL-11268
IMDM, no phenol red	Thermofisher	21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1	Cedars-Sinai iPSC Core Facility	N/A	https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC	Miltenyi Biotec	130-113-271
KnockOut serum replacement	Thermofisher	10828010
L-ascorbic acid	Sigma Aldrich	A4544
L-Glutamine	Thermofisher	2503081
Matrigel	Corning	354230	basement membrane matrix
MechanoCulture FX	CellScale	N/A	stretching apparatus
MEM non-essential amino acids solution	Thermofisher	11140050
Mohawk human Taqman primer	Thermofisher	Hs00543190_m1
mTeSR Plus	StemCell Technologies	100-0276
PBS	Thermofisher	10010023
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer	Thermofisher	Hs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)	Sigma Aldrich	192066
Polybrene infection/transfection reagents	Millipore Sigma	TR-1003
Recombinant human  TGF-beta 1 protein human Taqman primer	RnD Systems	240-B
Scleraxis human Taqman primer	Thermofisher	Hs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone	OriGene	RC224305L4
Silicone plates	CellScale	N/A
Sodium azide	Millipore Sigma	S2002
Tenascin C human Taqman primer	Thermofisher	Hs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman primer	Thermofisher	Hs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman primer	Thermofisher	Hs00170261_m1
Transfection reagent, BioT	Bioland Scientific LLC	B01-01
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermofisher	25200072
Tubulin polymerization promoting protein family member 3	Thermofisher	Hs03043892_m1
Y-27632 dihydrochloride	Biogems	1293823