Fabricación y caracterización de organoides de cáncer colorrectal de la línea celular SW1222 en matriz de péptidos autoensamblables ultracortos

Resumen

Este protocolo tiene como objetivo evaluar péptidos biofuncionales autoensamblables para la adhesión celular, la morfología de organoides y la expresión génica mediante inmunotinción. Utilizaremos una línea celular de cáncer colorrectal para proporcionar una forma rentable de obtener organoides para pruebas intensivas.

Resumen

Los péptidos autoensamblables ultracortos (SAP) pueden formar espontáneamente nanofibras que se asemejan a la matriz extracelular. Estas fibras permiten la formación de hidrogeles que son biocompatibles, biodegradables y no inmunogénicos. Hemos demostrado previamente que los SAPs, cuando se biofuncionalizan con motivos derivados de proteínas, pueden imitar las características de la matriz extracelular que apoyan la formación de organoides colorrectales. Estos hidrogeles de péptidos biofuncionales conservan las propiedades mecánicas, la capacidad de ajuste y la capacidad de impresión del péptido original al tiempo que incorporan señales que permiten que las interacciones entre la célula y la matriz aumenten la adhesión celular. Este artículo presenta los protocolos necesarios para evaluar y caracterizar los efectos de varios hidrogeles peptídicos biofuncionales sobre la adhesión celular y la formación de lúmenes utilizando una línea celular de cáncer de adenocarcinoma capaz de formar organoides de cáncer colorrectal de manera rentable. Estos protocolos ayudarán a evaluar los efectos del hidrogel de péptidos biofuncionales en la adhesión celular y la formación luminal mediante inmunotinción y análisis de imágenes de fluorescencia. La línea celular utilizada en este estudio se ha utilizado previamente para generar organoides en matrices de origen animal.

Introducción

En los últimos años, los péptidos autoensamblables (SAP) han surgido como biomateriales prometedores para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Los SAP poseen propiedades únicas, incluida la formación espontánea de nanofibras, la biocompatibilidad, la biodegradabilidad y la no inmunogenicidad, lo que los convierte en candidatos atractivos^{para el desarrollo} de andamios. Los SAP se han utilizado previamente junto con varios tipos de células y, en particular, los SAP ultracortos reportados han facilitado la encapsulación de células madre mientras mantienen su pluripotencia durante períodos prolongados que abarcan más de 30 p....

Protocolo

1. Preparación del tampón y de la solución

NOTA: Todas las concentraciones indicadas son concentraciones finales.

1. Añadir suero fetal bovino (FBS) y penicilina-estreptomicina a una concentración final de 10% y 1%, respectivamente, para preparar el Medio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM) completo. Almacenar en la oscuridad a 4 °C hasta por 1 mes.
2. Mezcle MgCl₂ (3 mM), sacarosa (300 mM) y Triton X-100 (0,5%) en solución salina tampón de fosfato (PBS) para preparar el tampón de permeabilización. Almacene esta solución a 4 °C durante un máximo de 2 meses.
3. Combine la albúmina sérica b....

Discusión

El enorme potencial de los SAP en la investigación biomédica se subraya por su maleabilidad y adaptabilidad a través de la biofuncionalización. Con una gama tan extensa de permutaciones, surge el desafío de probar y determinar de manera eficiente las configuraciones más prometedoras para aplicaciones específicas, especialmente en la investigación de organoides. Una solución rápida y rentable es primordial. La línea celular SW1222, derivada del adenocarcinoma colorrectal humano, emerge como un candidato fundame.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	14190144
6-well plate, tissue culture treated	Corning	07-200-83
10x PBS, no calcium, no magnesium	Gibco	70011044
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28906
24-well plate, tissue culture treated	Corning	09-761-146
96-well black plate, tissue culture treated	Corning	07-200-565
alamarBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	DAL1025
Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonal	Abcam	ab40839	Secondary used: anti-rabbit Dylight 633
Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonal	Abcam	ab16505	Secondary used: anti-rabbit Alexa 488
Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonal	Abcam	ab190085	Secondary used: anti-goat Alexa 488
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Cellpose 2.0	NA	NA	Obtained from https://github.com/MouseLand/cellpose
Confocal Laser Scanning Microscope with Airyscan	ZEISS	LSM 880
DAPI	Invitrogen	D1306
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055
Glycine	Cytiva	GE17-1323-01
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633	Invitrogen	35562
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS)	Gibco	16140071
ImageJ 1.54f	NIH	NA
IMDM	Gibco	12440079
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Invitrogen	L3224
Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O)	Sigma-Aldrich	M2393
Matrigel for Organoid Culture, phenol-red free	Corning	356255	Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix.
Microscope, brightfield
Microscope, EVOS	Thermo Scientific	EVOS M7000
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154	OriginLab Corp	NA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Rhodamine Phalloidin	Invitrogen	R415
Round Cover Slip, 10 mm diameter	VWR	631-0170
Scanning Electron Microscope	Thermo Fisher - FEI	TENEO VS
Sterile 30 μm strainer	Sysmex	04-004-2326
sucrose	Sigma-Aldrich	S1888
SW1222 cell line	ECACC	12022910
Triton x-100	Thermo Scientific	85111
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibco	25200056
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
UltraPure water	Invitrogen	10977015