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Resumen

Este protocolo tiene como objetivo evaluar péptidos biofuncionales autoensamblables para la adhesión celular, la morfología de organoides y la expresión génica mediante inmunotinción. Utilizaremos una línea celular de cáncer colorrectal para proporcionar una forma rentable de obtener organoides para pruebas intensivas.

Resumen

Los péptidos autoensamblables ultracortos (SAP) pueden formar espontáneamente nanofibras que se asemejan a la matriz extracelular. Estas fibras permiten la formación de hidrogeles que son biocompatibles, biodegradables y no inmunogénicos. Hemos demostrado previamente que los SAPs, cuando se biofuncionalizan con motivos derivados de proteínas, pueden imitar las características de la matriz extracelular que apoyan la formación de organoides colorrectales. Estos hidrogeles de péptidos biofuncionales conservan las propiedades mecánicas, la capacidad de ajuste y la capacidad de impresión del péptido original al tiempo que incorporan señales que permiten que las interacciones entre la célula y la matriz aumenten la adhesión celular. Este artículo presenta los protocolos necesarios para evaluar y caracterizar los efectos de varios hidrogeles peptídicos biofuncionales sobre la adhesión celular y la formación de lúmenes utilizando una línea celular de cáncer de adenocarcinoma capaz de formar organoides de cáncer colorrectal de manera rentable. Estos protocolos ayudarán a evaluar los efectos del hidrogel de péptidos biofuncionales en la adhesión celular y la formación luminal mediante inmunotinción y análisis de imágenes de fluorescencia. La línea celular utilizada en este estudio se ha utilizado previamente para generar organoides en matrices de origen animal.

Introducción

En los últimos años, los péptidos autoensamblables (SAP) han surgido como biomateriales prometedores para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Los SAP poseen propiedades únicas, incluida la formación espontánea de nanofibras, la biocompatibilidad, la biodegradabilidad y la no inmunogenicidad, lo que los convierte en candidatos atractivospara el desarrollo de andamios. Los SAP se han utilizado previamente junto con varios tipos de células y, en particular, los SAP ultracortos reportados han facilitado la encapsulación de células madre mientras mantienen su pluripotencia durante períodos prolongados que abarcan más de 30 pasajes y con una incidencia mínima de aberraciones cromosómicas 2,3,4. Por lo tanto, la adaptación de los SAP para su uso en el cultivo de organoides constituyó un paso racional posterior.

Los organoides son estructuras tridimensionales complejas que surgen de células pluripotentes individuales. Estas estructuras dan lugar a varios tipos de células, que luego se autoorganizan para replicar los procesos de desarrollo del crecimiento embrionario y tisular in vitro5. Este marco innovador se ha convertido en una herramienta formidable para investigaciones in vitro, conservando eficientemente los atributos genéticos, fenotípicos y de comportamiento característicos de los órganos in vivo 6. Sin embargo, un obstáculo principal en la transición del laboratorio a la cabecera del paciente de los hallazgos basados en organoides es la necesidad de reproducibilidad7. Esta variación en los resultados se atribuye principalmente a la dificultad de diferenciar completamente las células madre pluripotentes humanas en linajes celulares especializados, agravada por la ausencia de una arquitectura tisular auténtica y la complejidad inherente que se encuentra en los modelos de organoides. Dado el aumento de la popularidad de los estudios basados en células madre y organoides8, ha habido una creciente demanda de biomateriales con propiedades mecánicas dinámicas y sitios de adhesión similares a las integrinas o andamios con degradabilidad controlada 7,9. Estos atributos se pueden ajustar de manera efectiva a través de la utilización estratégica de SAP biofuncionalizados.

Los SAP son secuencias cortas de aminoácidos con la capacidad inherente de organizarse espontáneamente en estructuras bien definidas10. Estos péptidos a menudo contienen residuos hidrofóbicos e hidrofílicos alternados, que impulsan su autoensamblaje a través de interacciones no covalentes, incluidos los enlaces de hidrógeno, las interacciones electrostáticas y los efectos hidrofóbicos11,12. El proceso de autoensamblaje de estos péptidos está impulsado principalmente por la necesidad de minimizar la energía libre del sistema. Cuando se encuentran en un ambiente acuoso, los residuos hidrofóbicos tienden a agruparse para minimizar su exposición al agua, mientras que los residuos hidrófilos interactúan con las moléculas de agua circundantes. Este fenómeno conduce a la formación de varias nanoestructuras. En este caso, los péptidos ultracortos autoensamblables forman nanofibras con características que dependen de la secuencia peptídica y de las condiciones ambientales 2,12,13,14,15,16. Estos péptidos adoptan una conformación de β vueltas, donde las hebras de péptidos individuales se alinean paralelas o antiparalelas entre sí, estabilizadas por enlaces de hidrógeno (Figura 1). La presencia de iones positivos acelera los procesos de autoensamblaje que conducen a la formación de nanofibras.

Se ha identificado que las nanofibras peptídicas poseen una capacidad innata para atrapar volúmenes significativos de agua. Esta característica facilita la generación de un hidrogel, que posteriormente se manifiesta como un espacio tridimensional biocompatible y biodegradable propicio para la proliferación y el crecimiento celular. Estas nanofibras peptídicas autoensamblables emulan intrincadamente las características topográficas inherentes al entorno natural de la matriz extracelular (ECM)1. Esta semejanza dota a las células de un entorno que imita su hábitat fisiológico, promoviendo aún más las actividades celulares óptimas17. Además, la versatilidad inherente a estos péptidos permite un grado considerable de sintonización4. Dicha adaptabilidad permite cambios en las propiedades de la matriz, como la rigidez, la cinética de gelificación y la porosidad. Estas adaptaciones se logran a través de modificaciones en la secuencia peptídica. En consecuencia, los péptidos autoensamblables (SAP) han surgido como componentes fundamentales en la ciencia contemporánea de los biomateriales, ampliamente utilizados como andamios para la regeneración de tejidos y el cultivo celular13,17.

Una de las ventajas críticas de los péptidos autoensamblables es su capacidad para sintetizarse y modificarse fácilmente a nivel molecular. Esta ventaja permite la incorporación de grupos funcionales específicos o motivos bioactivos en la secuencia peptídica, permitiendo el diseño de péptidos con propiedades y funcionalidades personalizadas 18,19,20 (Figura 1B). Por ejemplo, los SAP biofuncionalizados pueden diseñarse para imitar la MEC y promover la diferenciación utilizando el péptido RGD19,21. También se ha informado que el péptido Ben-IKVAV aumenta significativamente la expresión de marcadores neuronales específicos debido a su motiedad específica del ligando22. Estos péptidos también pueden diseñarse para mostrar moléculas bioactivas, como los péptidos de unión a integrinas, para mejorar la supervivencia celular23. Por último, se han desarrollado otros SAPs biofuncionalizados para promover la angiogénesis mediante la inclusión de los motivos IKVAV y YIGSR en sus estructuras24.

Los SAP biofuncionalizados reportados en una publicación anterior muestran que el autoensamblaje puede modificarse aún más mediante la inclusión del péptido ingenuo del que se derivó el SAP biofuncionalizado25. Estas mezclas de SAP también pueden proporcionar una amplia gama de formulaciones de SAP que varían en su actividad bioquímica y propiedades fisicoquímicas. Por ejemplo, el péptido anfifílico IIFK es un SAP ultracorto que puede soportar la biofuncionalización con varios motivos, ejemplificado por la incorporación del motivo IKVAV (Figura 1B). Ambos péptidos pueden formar nanofibras, tanto solos como combinados. Cada formulación da como resultado hidrogeles con diferentes propiedades físicas (Figura 2)

Sin embargo, debido a la amplia gama de posibles permutaciones y alternativas obtenidas de la biofuncionalización de los SAP, existe la necesidad de proporcionar una opción rápida y rentable para las pruebas de organoides. Un candidato para esta evaluación intensiva y rentable de organoides es la línea celular SW1222, derivada del adenocarcinoma colorrectal humano 26,27. Las células SW1222 poseen características que permiten su agregación en estructuras 3D que se asemejan a organoides, lo que las convierte en un modelo ideal para estudiar el desarrollo de tejidos y las aplicaciones de medicina regenerativa. Las células SW1222 han sido identificadas como capaces de generar organoides debido a su sobreexpresión intrínseca del gen LGR5 27. La creación de organoides a partir de células madre LGR5+ individuales se ha demostrado de manera convincente antes, así como la propensión de las células SW1222 a alcanzar las características morfológicas de un organoide de cáncer colorrectal28.

En este artículo de métodos, presentamos protocolos detallados para evaluar y caracterizar los efectos de varios péptidos biofuncionales sobre la adhesión celular y la formación de lúmenes utilizando células SW1222 (Figura 3). Al proporcionar procedimientos paso a paso y métodos de análisis de imágenes, esperamos ofrecer información valiosa sobre la biofabricación de organoides y la evaluación de matrices SAP simplistas para el cultivo de organoides.

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Protocolo

1. Preparación del tampón y de la solución

NOTA: Todas las concentraciones indicadas son concentraciones finales.

  1. Añadir suero fetal bovino (FBS) y penicilina-estreptomicina a una concentración final de 10% y 1%, respectivamente, para preparar el Medio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM) completo. Almacenar en la oscuridad a 4 °C hasta por 1 mes.
  2. Mezcle MgCl2 (3 mM), sacarosa (300 mM) y Triton X-100 (0,5%) en solución salina tampón de fosfato (PBS) para preparar el tampón de permeabilización. Almacene esta solución a 4 °C durante un máximo de 2 meses.
  3. Combine la albúmina sérica bovina (BSA, 1%), la glicina (0,3 M) y la Tween-20 (0,1%) en PBS para preparar un tampón de bloqueo. Almacene esta solución a 4 °C durante un máximo de 2 meses.
  4. Diluya de 10 a 2 veces PBS con agua ultrapura en condiciones estériles. Guarde esta solución a temperatura ambiente durante más de 6 meses.
  5. Esterilice 3 mg del polvo peptídico bajo luz ultravioleta durante 30 min. Añadir 500 μL de agua ultrapura para disolver con un mezclador de vórtice.
    NOTA: La concentración final debe ser el doble de la concentración objetivo, es decir, 6 mg/mL, ya que la concentración 1x será de 3 mg/mL.

2. Fabricación de organoides de cáncer colorrectal a partir de SW1222 en péptido

  1. Descongele una alícuota durante la noche a 4 °C y manténgala en hielo hasta que sea necesario para preparar el control de la matriz del basamento.
  2. Coloque una gota de 10 μL de solución peptídica 2x en el centro de cada pocillo en una placa de 24 pocillos. Deje que la placa se incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Alternativamente, deposite de 8 a 10 gotas por pocillo en una placa de 6 pocillos.
    NOTA: Las muestras destinadas a ser utilizadas en microscopía confocal y electrónica son más accesibles para manipular si se siembran sobre un cubreobjetos estéril.
  3. Agregue 10 μL de 2x PBS. Mezcle la solución de PBS suavemente con la punta. Deje que los geles se estabilicen durante al menos 20 minutos, asegurándose de que las gotas permanezcan casi intactas.
    NOTA: El objetivo de la adición de PBS y la mezcla suave es mantener la integridad de la gota y evitar que el hidrogel se extienda en una capa.
  4. Separe las células SW1222 con una solución de tripsina-EDTA al 0,125% (5 ml). Incubar las células con tripsina a 37 °C durante 5-10 min hasta que se desprendan del matraz. Abstente de golpear el matraz para evitar la aglomeración de células.
  5. Añadir 5 mL de medio completo para inactivar la tripsina. Filtre la suspensión celular con un filtro celular de 30 μm. Alternativamente, use una jeringa con una aguja de 25 G para romper los agregados.
  6. Prepare una suspensión celular de 0,4 × 106 células/ml e inyecte 2 μL de la suspensión celular en cada gota de péptido utilizando una micropipeta de 10 μL.
  7. Incubar las gotas durante 30 min a 37 °C, 5% de CO2. Agregue 0,5 mL de medio suplementado a cada pocillo después de la incubación.
  8. Mientras espera, prepare el control de la matriz de la membrana basal diluyendo el stock principal (8-12 mg/mL, dependiendo del lote) hasta una concentración final de 3 mg/mL utilizando el medio suplementado. Agregue células a esta solución (800 células por 25 μL).
    NOTA: La manipulación de la membrana basal debe realizarse en hielo en todo momento. Las puntas deben enjuagarse con PBS helado antes de tocar el hidrogel. De lo contrario, se producirá polimerización dentro de las puntas.
  9. Coloque 20 μL de gotas de la solución de membrana basal en cada pocillo. Deje que las gotas se gelifiquen incubando durante 20 minutos a 37 °C. Después de gelificar el material, agregue 0,5 mL de medio completo.
  10. Cambie el medio cada 3-4 días. Observe las células organizándose y mostrando señales de formación de lúmenes ya el día 4.
  11. Tome imágenes de las células en campo claro el día 1, el día 4 y el día 7 para evaluar el crecimiento de organoides.

3. Viabilidad y proliferación

  1. Prepare tres placas de pocillos negros para el ensayo de viabilidad y tres placas de pocillos negros para el ensayo de proliferación. Añadir 25 μL de solución peptídica 2x por pocillo y gelar utilizando el mismo volumen de 2x PBS. Siembra las células como se ha descrito anteriormente.
  2. Prepare tres pocillos para cada formulación de hidrogel peptídico que se utilizará como blancos en la placa de proliferación. No siembre células en estos.
  3. Retire el medio de la placa del pozo de viabilidad y lave con 1x PBS durante 3 x 5 min.
  4. Diluir Calceína-AM y homodímero de etidio a 8 μM del kit de viabilidad/citotoxicidad para células de mamíferos (ver Tabla de Materiales) en el mismo tubo cónico protegido contra la luz. Para preparar 2 mL de esta solución a 2 mL de PBS en un tubo cónico protegido contra la luz, agregue 4 μL de la solución madre de Calceína-AM y 8 μL de la solución madre de Ethidium homodimer-1.
  5. Agregue la solución de homodímero de calceína/etidio preparada en el paso 3.4 a la placa de 96 pocillos. Añadir 100 μL por pocillo. Proteger de la luz e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
  6. Lavar durante 3 x 5 min con 1x PBS. Visualice un mínimo de tres campos (centro, arriba, abajo) cuando se utiliza un objetivo de 4x o un mínimo de cinco campos (centro, arriba a la izquierda, arriba a la derecha, abajo a la izquierda, abajo a la derecha) cuando se utiliza un objetivo de 10x y 20x bajo un microscopio de fluorescencia.
  7. Retire el medio de la placa de pocillo de proliferación para asegurar un volumen final de 90 μL.
  8. Añadir 10 μL de solución de Azul Alamar (ver Tabla de Materiales) hasta alcanzar una concentración final del 10%.
  9. Proteger de la luz e incubar durante 2-4 h a 37 °C, 5% de CO2
  10. Utilice un lector de placas de pocillos para medir la fluorescencia (Ex/Em = 530-560/590 nm/nm) o la absorbancia (570 nm). Promedie los valores obtenidos para los espacios en blanco y réstelos de los valores de cada pocillo que contenga celdas.
  11. Calcule los valores de proliferación promediando la señal de cada condición y restando el promedio de sus respectivos espacios en blanco. Cree gráficos generando un diagrama de caja indexado de la señal relativa de absorbancia/fluorescencia en función del tiempo.

4. Ensayo de adherencia de las células a la matriz

  1. Prepare 100 μL de hidrogeles peptídicos en dos placas independientes de 96 pocillos.
  2. Siembre 20.000 células en cada pocillo y agregue 100 μL de medio. Incubar las placas durante 90 min a 37 °C, 5% de CO2.
  3. Después de la incubación, tome solo una placa y vuelva a suspender cuidadosamente el medio con una micropipeta P200 durante 20-30 s. Tenga cuidado de no alterar el hidrogel manteniendo la punta alejada del gel. Alternativamente, si las propiedades mecánicas del hidrogel lo permiten (G' > 8.000 Pa), se golpean los cuatro lados de la placa del pozo utilizando un vórtice móvil.
    NOTA: La resuspensión del medio (o el golpeteo de la placa de pocillo con el vórtice) eliminará tanto las células no adheridas como las células con una adhesión tenue a la superficie de la matriz. La unión celular se producirá en 90 minutos, aunque la fuerza de esta unión variará en función de los hidrogeles peptídicos específicos y de sus propiedades adhesivas y aglutinantes. Se sabe que el crecimiento de organoides colorrectales se ve favorecido en matrices con valores de rigidez inferiores a 2.000 Pa. Por lo tanto, debido a que los hidrogeles presentados en este protocolo son blandos y quebradizos, nos esforzamos por utilizar un estrés mecánico suave.
  4. Retire 100 μL de medio de ambas placas de pocillos y agregue el lavado una vez con 1x PBS.
  5. Prepare una solución de DAPI de 1 μg/mL. Añadir 100 μL de la solución DAPI a todos los pocillos e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
  6. Obtenga imágenes de un número representativo de campos bajo un microscopio de fluorescencia. Asegúrese de que todas las imágenes se obtengan con el mismo objetivo para mantener constante la relación píxel/distancia.
    NOTA: Imagine nueve campos para un objetivo de 10x o 15 campos con un objetivo de 20x.
  7. Cargue las imágenes de fluorescencia en el software de análisis de imágenes (por ejemplo, ImageJ) y analice las partículas en todas las imágenes.
    1. En el menú Imagen , seleccione Tipo y haga clic en 8 bits.
    2. En el menú Imagen , selecciona Ajustar y haz clic en Brillo/Contraste. Haga clic en el botón Auto | Aplicar.
    3. En el menú Imagen , seleccione Ajustar y haga clic en Umbral. Haga clic en el botón Auto y cierre la ventana.
    4. En el menú Analizar , haga clic en Analizar partículas. Marque la opción de resumen y haga clic en Aceptar.
    5. En la ventana Resumen , coloque el cursor sobre el menú Archivo y haga clic en Guardar para guardar los valores de resumen.
  8. Exporte los resultados de todas las imágenes a un software de estadísticas estándar.
  9. Calcule el porcentaje de área cubierta por las células antes y después del estrés. Elabore un diagrama de caja indexado del porcentaje de área con respecto a cada condición.

5. Inmunotinción de organoides en hidrogel peptídico

  1. Siembre 800 células en gotas de 20 μL de hidrogel peptídico durante 4 días, como se describe en los pasos 2.1-2.10.
  2. El día 4, retire el medio y lave cada pocillo 2 veces con 1x PBS.
  3. Añadir 400 μL de una solución de formaldehído al 4%. Incubar la placa de pocillos durante 30 minutos a temperatura ambiente.
  4. Retire la solución de formaldehído con un P1000 y lave una vez con 1x PBS.
  5. Añadir 1 mL de tampón de permeabilización e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
  6. Retire el tampón de permeabilización con un P1000 y lave una vez con 1x PBS.
  7. Añadir 0,5 mL de tampón de bloqueo e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
  8. Retire el tampón de bloqueo con un P1000 y lave con 1x PBS.
  9. Diluya el anticuerpo primario en el tampón de bloqueo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la tabla de materiales). Agregue 200 μL a dos pocillos.
  10. Incubar durante la noche a 4 °C.
  11. Retire la solución de tinción con un P200 y lávese una vez con 1x PBS.
  12. Diluir el anticuerpo secundario en tampón de bloqueo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales). Añadir el conjugado de faloidina en una proporción de 1:40 en la solución de anticuerpos secundarios.
  13. Proteger de la luz e incubar a temperatura ambiente durante no más de 3 h. Retire la solución de tinción con un P200 y lávese una vez con 1x PBS.
  14. Prepare una solución de DAPI de 1 μg/mL en el tampón de bloqueo. Agregue 300 μL de la solución de DAPI a cada pocillo.
  15. Proteger de la luz e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
  16. Retire la solución de tinción con un P200 y lávese una vez con 1x PBS.
  17. Proteger de la luz y almacenar a 4 °C durante un máximo de 7 días.

6. Imagen y análisis de imágenes de organoides en matriz

  1. Obtenga imágenes de las muestras teñidas utilizando un microscopio de epifluorescencia a 10x. Utilice únicamente los canales de faloidina y DAPI.
  2. Abra el software Cellopose y presione ctrl + L para cargar una imagen. Como el software tendrá acceso a todos los archivos en la ubicación de la imagen seleccionada, asegúrese de guardar todas las imágenes de fluorescencia en la ubicación exacta sin tener ninguna subcarpeta.
  3. Escriba el diámetro medio de las colonias en el panel Segmentación y haga clic en INTRO.
  4. Seleccione un modelo personalizado para los organoides del colon y haga clic en el botón Ejecutar modelo .
    NOTA: Aquí, sugerimos usar dos modelos desde cero en Cellpose2.029,30
  5. Presione ctrl + s para guardar las máscaras como un archivo .npy.
  6. Utilice las flechas del teclado para desplazarse por las imágenes de la carpeta y ejecute el modelo de organoides de dos puntos en todas las imágenes de la carpeta.
  7. Haga una copia de la carpeta y repita los pasos 6.2-6.6 utilizando un modelo para el lumen del organoide del colon.
  8. Abre ImageJ y haz clic en Plugin | Macros | Correr... para ejecutar el archivo imagej_roi_converter.py disponible en el sitio de Github de Cellpose y esperar a que aparezca una ventana.
  9. Seleccione el primer archivo de la carpeta de organoides de dos puntos y haga clic en Abrir.
  10. Seleccione el archivo seg.npy correspondiente al primer archivo y haga clic en Abrir.
    NOTA: ImageJ convertirá las máscaras en regiones de interés y las superpondrá con las imágenes de fluorescencia correspondientes.
  11. Haga clic en Seleccionar todo en la ventana Administrador de ROI y haga clic en Medir.
  12. Haga clic en Archivo | Guardar como... en la ventana Resultados y guarde los resultados.
    NOTA: Esto dará como resultado un archivo .csv que contiene todas las propiedades de forma de cada colonia en el campo.
  13. Repita los pasos 6.8-6.12 para la misma imagen en la carpeta para el lumen del organoide del colon.
  14. Cargue OriginPro y presione ctrl + 3 para abrir el Asistente de importación. Haga clic en el botón de tres puntos y seleccione ambos archivos de .csv correspondientes a las propiedades de organoide y forma de lúmenes para la misma imagen.
  15. Copie y pegue los resultados de las propiedades de forma de lúmenes en una columna junto a los resultados de la colonia para asegurarse de que cada medición de lúmenes esté emparejada con su colonia respectiva.
  16. En una nueva columna, divida las áreas del lumen y la colonia para obtener el área relativa del lumen de la colonia que la contiene.
  17. Seleccione la columna correspondiente a la circularidad de cada colonia y el área de lúmenes. Haga clic en Parcela | 2D básico | Dispersión.
  18. Haga clic con el botón derecho en la ventana de trazado y seleccione Detalles del trazado. Haga clic en la pestaña Centroide (PRO) y marque las opciones que dicen Mostrar punto de centroide para subconjunto, Conectar a puntos de datos y Mostrar elipse.

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Resultados

Primero, evaluamos las células cultivadas en una placa de 24 pocillos durante 7 días utilizando imágenes de campo claro. Identificamos pequeños grupos de células que se ensamblaban en organoides durante la semana, como se ve en la Figura 4. Un método de escaneo controlado puede seguir la movilidad de las células y los organoides entre diferentes días. En general, observamos la evolución de la morfología de las células durante toda la semana. Los organoides derivados de SW1222 debe...

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Discusión

El enorme potencial de los SAP en la investigación biomédica se subraya por su maleabilidad y adaptabilidad a través de la biofuncionalización. Con una gama tan extensa de permutaciones, surge el desafío de probar y determinar de manera eficiente las configuraciones más prometedoras para aplicaciones específicas, especialmente en la investigación de organoides. Una solución rápida y rentable es primordial. La línea celular SW1222, derivada del adenocarcinoma colorrectal humano, emerge como un candidato fundame...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo financiero de la Universidad de Ciencia y Tecnología Rey Abdullah. Los autores agradecen la Subvención del Fondo Semilla de KAUST y el Fondo de Innovación de KAUST otorgados por el Departamento de Innovación y Desarrollo Económico de KAUST. Los autores desean agradecer a los Laboratorios Centrales de Biociencia e Imagen de KAUST por apoyar la caracterización biológica y los análisis de microscopía.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSGibco14190144
6-well plate, tissue culture treatedCorning07-200-83
10x PBS, no calcium, no magnesiumGibco70011044
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-freeThermo Scientific28906
24-well plate, tissue culture treatedCorning09-761-146
96-well black plate, tissue culture treatedCorning07-200-565
alamarBlue Cell Viability ReagentInvitrogenDAL1025
Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonalAbcamab40839Secondary used: anti-rabbit Dylight 633
Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonalAbcamab16505Secondary used: anti-rabbit Alexa 488
Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonalAbcamab190085Secondary used: anti-goat Alexa 488
BSASigma-AldrichA9418
Cellpose 2.0NANAObtained from https://github.com/MouseLand/cellpose
Confocal Laser Scanning Microscope with AiryscanZEISSLSM 880
DAPIInvitrogenD1306
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11055
GlycineCytivaGE17-1323-01
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11008
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633Invitrogen35562
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS)Gibco16140071
ImageJ 1.54fNIHNA
IMDMGibco12440079
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cellsInvitrogenL3224
Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O)Sigma-AldrichM2393
Matrigel for Organoid Culture, phenol-red freeCorning356255Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix.
Microscope, brightfield
Microscope, EVOSThermo ScientificEVOS M7000
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154OriginLab CorpNA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)Lab-madeNACan be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)Lab-madeNACan be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2)Lab-madeNACan be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Rhodamine PhalloidinInvitrogenR415
Round Cover Slip, 10 mm diameterVWR631-0170
Scanning Electron MicroscopeThermo Fisher - FEITENEO VS
Sterile 30 μm strainerSysmex04-004-2326
sucroseSigma-AldrichS1888
SW1222 cell lineECACC12022910
Triton x-100Thermo Scientific85111
Trypsin-EDTA 0.25%Gibco25200056
Tween 20Sigma-AldrichP1379
UltraPure waterInvitrogen10977015

Referencias

  1. Susapto, H. H., et al. Ultrashort peptide bioinks support automated printing of large-scale constructs assuring long-term survival of printed tissue constructs. Nano Letters. 21 (7), 2719-2729 (2021).
  2. Loo, Y., et al. A chemically well-defined, self-assembling 3D substrate for long-term culture of human pluripotent stem cells. ACS Applied Bio Materials. 2 (4), 1406-1412 (2019).
  3. Loo, Y., et al. Self-assembled proteins and peptides as scaffolds for tissue regeneration. Advanced Healthcare Materials. 4 (16), 2557-2586 (2015).
  4. Loo, Y., et al. Peptide bioink: self-assembling nanofibrous scaffolds for three-dimensional organotypic cultures. Nano Letters. 15 (10), 6919-6925 (2015).
  5. Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. -S. Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936(2018).
  6. Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21(2020).
  7. Kim, S., et al. Tissue extracellular matrix hydrogels as alternatives to Matrigel for culturing gastrointestinal organoids. Nature Communications. 13 (1), 1692(2022).
  8. Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. Concise review: current status of three-dimensional organoids as preclinical models. Stem Cells. 36 (9), 1329-1340 (2018).
  9. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  10. Hauser, C. A., et al. Natural tri- to hexapeptides self-assemble in water to amyloid beta-type fiber aggregates by unexpected alpha-helical intermediate structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1361-1366 (2011).
  11. Lakshmanan, A., Zhang, S., Hauser, C. A. E. Short self-assembling peptides as building blocks for modern nanodevices. Trends in Biotechnology. 30 (3), 155-165 (2012).
  12. Rauf, S., et al. Self-assembling tetrameric peptides allow in situ 3D bioprinting under physiological conditions. Journal of Materials Chemistry B. 9 (4), 1069-1081 (2021).
  13. Bilalis, P., et al. Dipeptide-based photoreactive instant glue for environmental and biomedical applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (40), 46710-46720 (2023).
  14. Abdelrahman, S., et al. The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds. ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).
  15. Moretti, M., et al. Selectively positioned catechol moiety supports ultrashort self-assembling peptide hydrogel adhesion for coral restoration. Langmuir. 39 (49), 17903-17920 (2023).
  16. Alhattab, D. M., et al. Fabrication of a three-dimensional bone marrow niche-like acute myeloid Leukemia disease model by an automated and controlled process using a robotic multicellular bioprinting system. Biomaterials Research. 27 (1), 111(2023).
  17. Abdelrahman, S., et al. The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds. ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).
  18. Habibi, N., Kamaly, N., Memić, A., Shafiee, H. Self-assembled peptide-based nanostructures: smart nanomaterials toward targeted drug delivery. Nano Today. 11 (1), 41-60 (2016).
  19. Yan, Y., et al. Enhanced osteogenesis of bone marrow-derived mesenchymal stem cells by a functionalized silk fibroin hydrogel for bone defect repair. Advanced Healthcare Materials. 8 (3), 1801043(2018).
  20. Kisiday, J., et al. Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (15), 9996-10001 (2002).
  21. Hogrebe, N. J., et al. Independent control of matrix adhesiveness and stiffness within a 3D self-assembling peptide hydrogel. Acta Biomaterialia. 70, 110-119 (2018).
  22. Wu, F. J., Lin, H. C. Synthesis, self-assembly, and cell responses of aromatic IKVAV peptide amphiphiles. Molecules. 27 (13), 4115(2022).
  23. Cringoli, M. C., et al. Bioadhesive supramolecular hydrogel from unprotected, short d,l-peptides with Phe-Phe and Leu-Asp-Val motifs. Chemical Communications. 56 (20), 3015-3018 (2020).
  24. Pulat, G. O., Gökmen, O., Çevik, Z. B. Y., Karaman, O. Role of functionalized self-assembled peptide hydrogels in in vitro vasculogenesis. Soft Matter. 17 (27), 6616-6626 (2021).
  25. Pérez-Pedroza, R., et al. Fabrication of lumen-forming colorectal cancer organoids using a newly designed laminin-derived bioink. International Journal of Bioprinting. 9 (1), 633(2022).
  26. Ashley, N., Yeung, T. M., Bodmer, W. F. Stem cell differentiation and lumen formation in colorectal cancer cell lines and primary tumors. Cancer Research. 73 (18), 5798-5809 (2013).
  27. Yeung, T. M., Gandhi, S. C., Wilding, J. L., Muschel, R., Bodmer, W. F. Cancer stem cells from colorectal cancer-derived cell lines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3722-3727 (2010).
  28. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  29. Pachitariu, M., Stringer, C. Cellpose 2.0: how to train your own model. Nature Methods. 19 (12), 1634-1641 (2022).
  30. Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).
  31. Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
  32. Humphries, M. J. Cell-substrate adhesion assays. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 9, Unit 9.1 (2001).
  33. Munevar, S., Wang, Y. -l, Dembo, M. Distinct roles of frontal and rear cell-substrate adhesions in fibroblast migration. Molecular Biology of the Cell. 12 (12), 3947-3954 (2001).
  34. Djomehri, S., Burman, B., González, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer. Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2018).
  35. Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
  36. Matthews, J. M., et al. OrganoID: A versatile deep learning platform for tracking and analysis of single-organoid dynamics. PLOS Computational Biology. 18 (11), 1010584(2022).
  37. Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR × LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
  38. Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg. Scientific Reports. 8 (1), 5319(2018).
  39. Bergdorf, K. N., et al. Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100578-100578 (2021).
  40. Yang, Z., Xu, H., Zhao, X. Designer self-assembling peptide hydrogels to engineer 3D cell microenvironments for cell constructs formation and precise oncology remodeling in ovarian cancer. Advanced Science. 7 (9), 1903718(2020).
  41. Yadav, N., et al. Ultrashort peptide-based hydrogel for the healing of critical bone defects in rabbits. ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (48), 54111-54126 (2022).
  42. Alshehri, S., Susapto, H. H., Hauser, C. A. E. Scaffolds from self-assembling tetrapeptides support 3D spreading, osteogenic differentiation, and angiogenesis of mesenchymal stem cells. Biomacromolecules. 22 (5), 2094-2106 (2021).

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