Microscopía electrónica y de luz correlativa de inclusión posterior a Epon

Resumen

Presentamos un protocolo detallado para la microscopía correlativa de luz y electrónica posterior a la inclusión de Epon utilizando una proteína fluorescente llamada mScarlet. Este método puede mantener la fluorescencia y la ultraestructura simultáneamente. Esta técnica es susceptible de una amplia variedad de aplicaciones biológicas.

Resumen

La microscopía correlativa de luz y electrónica (CLEM) es una microscopía integral que combina la información de localización proporcionada por la microscopía de fluorescencia (FM) y el contexto de la ultraestructura celular adquirida por la microscopía electrónica (EM). CLEM es un compromiso entre fluorescencia y ultraestructura y, por lo general, la ultraestructura compromete la fluorescencia. En comparación con otras resinas de inclusión hidrofílicas, como el metacrilato de glicidilo, HM20 o K4M, Epon es superior en propiedades de conservación y seccionamiento de la ultraestructura. Anteriormente, habíamos demostrado que mEosEM puede sobrevivir a la fijación de tetróxido de osmio y a la inclusión de Epon. Usando mEosEM, logramos, por primera vez, Epon post embeding CLEM, que mantiene la fluorescencia y la ultraestructura simultáneamente. Aquí, proporcionamos detalles paso a paso sobre la preparación de la muestra EM, las imágenes FM, las imágenes EM y la alineación de la imagen. También mejoramos los procedimientos para identificar la misma célula fotografiada por imágenes FM durante la imagen EM y detallamos el registro entre las imágenes FM y EM. Creemos que se puede lograr fácilmente la microscopía electrónica y de luz correlativa posterior a la inclusión de Epon siguiendo este nuevo protocolo en instalaciones EM tradicionales.

Introducción

La microscopía de fluorescencia (FM) se puede utilizar para obtener la localización y distribución de la proteína diana. Sin embargo, se pierde el contexto que rodea a la proteína diana, lo cual es crucial para investigar a fondo la proteína diana. La microscopía electrónica (EM) tiene la resolución de imagen más alta y proporciona varios detalles subcelulares. Sin embargo, EM carece de etiquetado de objetivos. Al fusionar con precisión la imagen de fluorescencia tomada por FM con la imagen gris adquirida por EM, la microscopía correlativa de luz y electrónica (CLEM) puede combinar la información obtenida por estos dos modos de imagen

Protocolo

La cría de animales y los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico de la Universidad Médica de Fujian. El flujo de trabajo paso a paso del protocolo actual se muestra en la Figura 1.

1. Preparación de la muestra

1. Cerebro de ratón
   1. Compre ratones transgénicos (ver Tabla de Materiales) y cebadores de oligonucleótidos (ver Tabla de Materiales) para genotipar a estos ratones.
   2. Perfundir y extraer el cerebro intacto de la bóveda craneal siguiendo el protocolo previamente publica....

Discusión

El protocolo que aquí se presenta es un método de imagen versátil, que puede combinar la información de localización de la proteína diana de la microscopía óptica (LM) y el contexto que rodea a la proteína diana de la microscopía electrónica (EM)⁶. Con las limitaciones de las proteínas fluorescentes actuales, el método ampliamente utilizado es la microscopía correlativa de luz y electrónica (CLEM), lo que significa que la imagen de LM se realiza antes de la preparación de la muestr.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 M Phosphate Buffer (PB)			NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O
0.2 M Tris-Cl (pH 8.5)	Shanghai yuanye Bio-Technology	R26284
25% Glutaraldehyde (GA)	Alfa Aesar	A17876	Hazardous chemical
Abbelight 3D	Nanolnsights
Acetone	SCR	10000418
Ammonium hydroxide	J&K Scientific	335213
BioPhotometer D30	eppendorf
Cleaning buffer of cover glasses			50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O
Coverglass	Warner	64-0715
DABCO	Sigma	290734	Hazardous chemical
DDSA	SPI company	GS02827	Hazardous chemical
Desktop centrifuge	WIGGENS	MINICEN 10E
Diamond knife	DiATOME	MX6353
DMP-30	SPI company	GS02823	Hazardous chemical
DNA transfection reagent	Thermo Fisher	2696953	Lipofectamine 3000 Transfection Kit
Epon 812	SPI company	GS02659	Hazardous chemical
Ethanol	SCR	10009218
Fiji image J	National Institutes of Health
Fixative solution			4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB
Formvar	Sigma	9823
Glycerol	SCR	10010618
Gold nanoparticles	Corpuscular	790120-010
Gradient resin			Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3
Hydrofluoric acid	SCR	10011118
Hydrogen peroxide	SCR	10011218
ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/)			Easy CLEMv0 Plugin
Imaging chamber	Thermo Fisher	A7816
Large gelatin capsules	Electron Microscopy Sciences	70117
Mounting buffer			Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO
Mowiol 4-88	Sigma	9002-89-5
Na2HPO4 ž12H2O	SCR	10020318
NaH2PO4 ž2H2O	SCR	20040718
NMA	SPI company	GS02828	Hazardous chemical
Oligonucleotide primers	Takara Biomedical Technology (Beijing)		Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers  5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type.
Oscillating microtome	Leica	VT1000S
Osmium tetroxide	SCR	L01210302	Hazardous chemical
OsO4 solution			1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O
Parafilm	Amcor	PM-996
Paraformaldehyde (PFA)	SCR	80096618	Hazardous chemical
Perfusion buffer			4% PFA+0.1 M PB
Pioloform	Sigma	63148-65-2	Hazardous chemical
Poly-L-lysine	Sigma	25986-63-0
Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O)	SCR	10016818
Scalpel blades	Merck	S2771
Scalpel handles	Merck	S2896-1EA
Stereomicroscope	OLYMPUS	MVX10
Transgenic mice	The Jackson Laboratory		Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g.
Transmission electron microscope (TEM)	FEI		TECNAL G2
UA solution (2% UA)			Aqueous solution
Ultramicrotome	Leica	LEICA EM UC6
Uranyl acetate (UA)	TED PELLA	19481	Hazardous chemical