Separación rápida y visualización de agentes fibrinogenolíticos activos en Sipunculus nudus mediante electroforesis en gel de fibrinógeno-poliacrilamida

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo de electroforesis en gel de fibrinógeno-poliacrilamida (PAGE) para separar y mostrar rápidamente los agentes fibrinogenolíticos de Sipunculus nudus.

Resumen

Los agentes fibrinogenolíticos que pueden disolver el fibrinógeno directamente se han utilizado ampliamente en el tratamiento de la anticoagulación. En general, la identificación de nuevos agentes fibrinogenolíticos requiere primero la separación de cada componente y luego la verificación de sus actividades fibrinogenolíticas. Actualmente, la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y la cromatografía se utilizan principalmente en la etapa de separación. Mientras tanto, el ensayo en placa de fibrinógeno y los productos de reacción basados en PAGE generalmente se adoptan para mostrar sus actividades fibrinogenolíticas. Sin embargo, debido a la separación espacio-temporal de esas dos etapas, es imposible separar y mostrar los agentes fibrinogenolíticos activos con el mismo gel. Para simplificar los procesos de separación y visualización de la identificación de agentes fibrinogenolíticos, construimos un nuevo método fibrinógeno-PAGE para separar y mostrar rápidamente los agentes fibrinogenolíticos de los gusanos del maní (Sipunculus nudus) en este estudio. Este método incluye la preparación de fibrinógeno-PAGE, electroforesis, renaturalización, incubación, tinción y decoloración. La actividad fibrinogenolítica y el peso molecular de la proteína se pueden detectar simultáneamente. De acuerdo con este método, detectamos con éxito más de un agente fibrinogenolítico activo del homogeneato de gusano de maní en 6 h. Además, este método fibrinógeno-PAGE es amigable con el tiempo y el costo. Además, este método podría utilizarse para estudiar los agentes fibrinogenolíticos de los otros organismos.

Introducción

En los últimos años, debido al continuo aumento de las enfermedades trombóticas, las enfermedades trombóticas se han convertido en un nuevo gran problema de salud mundial¹. En la actualidad, los fármacos antitrombóticos se clasifican en tres grupos: antiagregación plaquetaria, anticoagulantes y trombolíticos. Entre ellos, los fármacos trombolíticos, como la uroquinasa (UK), el activador tisular del plasminógeno (tPA), etc., son los únicos fármacos clínicamente utilizados que pueden hidrolizar el trombo². Mientras tanto, se están desarrollando fármacos trombolíticos más seguros y eficaces mediante la identificación de nuevos agentes trombolíticos³.

Sin embargo, la identificación de nuevos agentes trombolíticos requiere mucho tiempo y trabajo, lo que implica principalmente las etapas de separación/purificación y caracterización/comprobación. El primero es para separar cada componente, y el segundo para mostrar sus actividades fibrinos(geno)líticas ^4,5. En estudios anteriores, a pesar de que hemos aislado con éxito una nueva enzima fibrinosa (geno)lítica (sFE) del gusano del maní (Sipunculus nudus) mediante cromatografía de afinidad y ensayo de placa de fibrina (ógeno) ^6,7,8, estos procesos requieren tanto tiempo y trabajo. En primer lugar, es necesario determinar si los homogeneizados de gusanos de cacahuete tienen actividad fibrinosa (geno)lítica mediante el método de placa de fibrina (ógeno) y productos de reacción basados en PÁGINA⁹. A continuación, se deben realizar una serie de cromatografías, como la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de filtración en gel, la cromatografía de afinidad y otros métodos, para la separación y purificación^10,11. Posteriormente, se vuelve a realizar el ensayo en placa de fibrina para comprobar la actividad fibrinogenolítica de cada componente separado. Finalmente, se realizan PAGE nativo y dodecil sulfato de sodio (SDS)-PAGE para determinar el peso molecular de los agentes fibrinogenolíticos activos¹². Por lo tanto, es fundamental separar y mostrar rápidamente los agentes fibrinogenolíticos activos.

Para separar y mostrar rápidamente los agentes fibrinogenolíticos activos en los homogeneizados de gusanos del maní, se desarrolló un nuevo método fibrinógeno-PAGE combinando los métodos PAGE y placa de fibrinógeno, es decir, los sustratos de los agentes fibrinogenolíticos fibrinógeno se agregaron al gel PAGE-nativo. Después de la página nativa, los componentes se separaron por su peso molecular. Mientras tanto, cada componente fibrinogenolítico activo se puede mostrar mediante tinción. Con este método, detectamos con éxito más de un agente fibrinogenolítico activo del homogeneizado del gusano del maní en 6 h. Además, este método fibrinógeno-PAGE es amigable con el tiempo y el costo. Además, este método podría utilizarse para estudiar los agentes fibrinogenolíticos de los otros organismos.

Protocolo

1. Preparación de homogeneizado de gusanos de maní

1. Añadir 50 g de gusanos de cacahuete y 150 mL de solución salina en el homogeneizador.
2. Homogeneizar a 24000 rpm durante 60 s.
   NOTA: Repita 3 veces.
3. Centrifugar el homogeneizado a 9710 x g durante 30 min a 4 °C.
4. Recoja el sobrenadante como homogeneizado del gusano del maní para su posterior estudio.

2. Preparación del gel Fibrinógeno-PAGE

1. Pesar 0,01 g de fibrinógeno en un vaso de precipitados de vidrio de 50 ml.
2. Agregue 1,9 mL de DDH₂O, 1,3 mL de Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8) y 0,05 mL de SDS (10%, p/v) en el vaso de precipitados; Mezclar bien pipeteando.
3. Coloque el vaso a 37 °C durante 30 min.
   NOTA: Este paso es para disolver el fibrinógeno.
4. Añadir 1,7 mL de acrilamida (30%, p/v), 0,05 mL de persulfato de amonio (APS; 10%, p/v), 0,002 mL de TEMED; Mezclar bien pipeteando.
   NOTA: Este es un gel separador.
5. Vierte el gel separador en un molde de gel de 10 pocillos.
6. Agregue 2 mL de DDH₂O en el molde de gel; Espere 30 min.
7. Retira bien el agua dando la vuelta al molde.
8. Añada 1,4 mL de DDH₂O, 0,25 mL de Tris-HCl (1,0 M, pH 6,8), 0,02 mL de SDS (10 % p/v), 0,33 mL de acrilamida (30 % p/v), 0,02 mL de APS (10 % p/v), 0,002 mL de tetrametiletilendiamina (TEMED) en el vaso de precipitados; Mezclar bien pipeteando.
   NOTA: Este es gel de carga.
9. Vierta el gel de carga en el mismo molde de gel que el paso 2.5; Inserte el peine inmediatamente.
   NOTA: El gel de fibrinógeno-PAGE utilizado aquí estaba compuesto por el fibrinógeno (0,2%) que contenía gel separador y gel de carga. La concentración de fibrinógeno se puede ajustar según sea necesario.

3. Electroforesis

1. Coloque el gel de fibrinógeno-PAGE preparado junto con el molde de pegamento en el tanque de electroforesis; verter 1300 mL de solución de electroforesis (1,963 g de Tris, 12,22 g de glicina, 0,65 g de SDS y 1300 mL de DDH₂O) en el tanque; Saca el peine.
2. Agregue 5 μL de tampón de carga no desnaturalizante 5x a los 20 μL de sFE y 20 μL de homogeneizado de gusano de maní; mezclar bien por pipeteo; cárguelos en el gel de fibrinógeno-PAGE preparado.
   NOTA: No hierva la mezcla. La sFE es una enzima fibrinosa(geno)lítica identificada^{previamente como 6,7,8} y se utiliza como control positivo en este estudio. El homogeneizado del gusano del cacahuete es la muestra a detectar. Tampón de carga no desnaturalizante sin azul de bromofenol, β-mercaptoetanol y SDS comparado con el tampón de carga SDS-PAGE. Cada línea de muestra está separada con el tampón de carga 1x SDS-PAGE para detectar claramente el movimiento de la proteína.
3. Realice la electroforesis a 80 V durante 30 min, o a 120 V durante 20 min.
4. Retire el gel de fibrinógeno-PAGE del molde de pegamento.

4. Renaturalización

1. Transfiera el gel de fibrinógeno-PAGE a una caja de plástico.
2. Añada 100 mL de Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) y 2 mL de Triton X-100 en la caja. Colócalo en una coctelera a 60-70 rpm durante 10 min.
3. Retire el tampón de lavado mediante pipeteo.
   NOTA: Repita tres veces.

5. Incubación

1. Agregue 50 ml de Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) en la caja de plástico.
2. Incubar a 37 °C durante 4 h.
   NOTA: El tiempo de incubación se puede ajustar de acuerdo con la fuerza de la actividad fibrinogenolítica.

6. Manchas

1. Retire el tampón de incubación mediante pipeteo.
2. Agregue 50 mL de solución de tinción Coomassie Brillant Blue en la caja y coloque la caja en un agitador a 60-70 rpm durante 30 min.

7. Decoloración

1. Retire la solución de tinción mediante pipeteo.
2. Agregue 50 mL de DDH₂O en la caja.
3. Coloque la caja en una coctelera a 60-70 rpm durante 30 min.
   NOTA: Aquí se utilizó DD_{H 2}O como solución destaining. El tiempo de agitación se puede ajustar de acuerdo con la fuerza de la actividad fibrinogenolítica.

Resultados

Después de la electroforesis, se mostraron claramente todas las bandas del marcador. Los carriles de carga 1x SDS-PAGE solo mostraron bandas de 10 kDa (azul de bromofenol). Las muestras de sFE y gusano del maní no mostraron ninguna banda observable (Figura 1). Aunque las bandas de las muestras no son visibles, el rendimiento del marcador y del azul de bromofenol indicó que la electroforesis fue exitosa y las muestras se separaron según su peso molecular....

Discusión

La sFE es una nueva enzima fibrino(geno)lítica aislada de gusanos del cacahuete por nuestro equipo previamente 3,6,8,13. Sin embargo, los procesos de identificación de sFE requirieron mucho tiempo y trabajo, e involucraron la detección de la actividad fibrinogenolítica, la separación de componentes proteicos y las etapas de confirmación de la actividad. C...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1  M Tris-HCl (pH 6.8)	Solarbio	T1020
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)	Solarbio	T1010
30% Acrylamide/Bis-acrylamide	Biosharp	BL513B
Ammonium persulfate	XiLONG SCIENTIFIC	7727-54-0
Beaker	PYREX	2-9425-02
Centrifuge Tube (1.5 mL)	Biosharp	BS-15-M
Constant Temperature Incubator	JINGHONG	JHS-400
Coomas Brillant Blue Stainning solution	Beyotime	P0017F
Electronic Analytical Balance	DENVER	TP-213
Fibrinogen	Solarbio	F8051
Gel loading pipette tips, Bulk	Biosharp	BS-200-GTB
Homogenizer	AHS	ATS-1500
Horizontal rotation oscillator	NuoMi	NMSP-600
Milli-Q Reference	Millipore	Z00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra Cell	BIO-RAD	165-8000~165-8007
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sigma	T9281
Pipette Tip (1 mL)	Axygene	T-1000XT-C
Pipette Tip (10 µL)	Axygene	T-10XT-C
Pipette Tip (200 µL)	Axygene	T-200XT-C
Pipettor (1 mL)	Thermo Fisher Scientific	ZY18723
Pipettor (10µL)	Thermo Fisher Scientific	ZX98775
Pipettor (200 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY20280
Pipettor (50 µL)	Thermo Fisher Scientific	ZY15331
Refrigerated Centrifuge	cence	H1650R
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	V900859
Tris	Solarbio	T8060
Tris-HCl	Solarbio	T8230
Triton X-100	Solarbio	T8200