Reconstitución del canal receptor de glutamato bacteriano mediante encapsulación de un sistema de expresión libre de células

Resumen

Este protocolo describe el método de emulsión invertida utilizado para encapsular un sistema de expresión libre de células (CFE) dentro de una vesícula unilaminar gigante (GUV) para la investigación de la síntesis e incorporación de una proteína de membrana modelo en la bicapa lipídica.

Resumen

Los sistemas de expresión libre de células (CFE) son herramientas poderosas en biología sintética que permiten la biomímesis de funciones celulares como la biodetección y la regeneración de energía en células sintéticas. Sin embargo, la reconstrucción de una amplia gama de procesos celulares requiere la reconstitución exitosa de las proteínas de membrana en la membrana de las células sintéticas. Si bien la expresión de proteínas solubles suele tener éxito en los sistemas CFE comunes, la reconstitución de proteínas de membrana en bicapas lipídicas de células sintéticas ha demostrado ser un desafío. Aquí, se demuestra un método para la reconstitución de una proteína de membrana modelo, el receptor bacteriano de glutamato (GluR0), en vesículas unilaminares gigantes (GUVs) como células sintéticas modelo basado en la encapsulación e incubación de la reacción CFE dentro de células sintéticas. Utilizando esta plataforma, se demuestra el efecto de la sustitución del péptido señal N-terminal de GluR0 por el péptido señal de proteorrodopsina en la translocación cotraduccional exitosa de GluR0 en membranas de GUV híbridos. Este método proporciona un procedimiento robusto que permitirá la reconstitución libre de células de varias proteínas de membrana en células sintéticas.

Introducción

La biología sintética ascendente ha ganado un interés creciente en la última década como un campo emergente con numerosas aplicaciones potenciales en bioingeniería, administración de fármacos y medicina regenerativa ^1,2. El desarrollo de células sintéticas como piedra angular de la biología sintética ascendente, en particular, ha atraído a una amplia gama de comunidades científicas debido a las prometedoras aplicaciones de las células sintéticas, así como a sus propiedades físicas y bioquímicas similares a las de las células que facilitan los estudios biofísicos in vitro ^<....

Protocolo

Los reactivos y equipos utilizados para este estudio se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Reacciones masivas de CFE en presencia de pequeñas vesículas unilaminares (SUV)

1. Preparación para SUV
   NOTA: Este paso debe realizarse en una campana extractora siguiendo las instrucciones de seguridad para trabajar con cloroformo.
   1. Prepare 5 mM de SUV de 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) en un vial de vidrio transfiriendo 76 μL de solución madre de POPC de 25 mg/mL disuelta en cloroformo.
   2. Mientras gira suavemente el vial de vidrio, sople un suave chorro de argón en ....

Discusión

Prácticamente cualquier proceso celular que dependa de la transferencia de moléculas o información a través de la membrana celular, como la señalización celular o la excitación celular, requiere proteínas de membrana. Por lo tanto, la reconstitución de proteínas de membrana se ha convertido en el principal cuello de botella en la realización de varios diseños de células sintéticas para diferentes aplicaciones. La reconstitución tradicional mediada por detergentes de proteínas de membrana en membranas biol.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 nm polycarbonate filter	STERLITECH	1270193
96 Well Clear Bottom Plate	ThermoFisher Scientific	165305
BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader	Agilent	11-120-533
Creatine phosphate	Millipore Sigma	10621714001
CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep)	Millipore Sigma	D1556	Optional to switch with sucrose in inner solution
Filter supports	Avanti	610014
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
Folinic acid calcium salt hydrate	Millipore Sigma	F7878
Glucose	Millipore Sigma	158968
HEPES	Millipore Sigma	H3375
iXon X3 camera	Andor	DU-897E-CS0
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate	Millipore Sigma	G1501
Light mineral oil	Millipore Sigma	M5904
Magnesium acetate tetrahydrate	Millipore Sigma	M5661
Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand)	Avanti	610020
Olympus IX81 Inverted Microscope	Olympus	IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective	Olympus	1-U2B933
PEO-b-PBD	Polymer Source	P41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA	Homemade	N/A
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA	Homemade	N/A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA	Homemade	N/A
POPC lipid in chloroform	Avanti	850457C
Potassium chloride	Millipore Sigma	P9541
PUREfrex 2.0	Cosmo Bio USA	GFK-PF201
Ribonucleotide Solution Set	New England BioLabs	N0450
RNase Inhibitor, Murine	New England BioLabs	M0314S
RTS Amino Acid Sampler	Biotechrabbit	BR1401801
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888
Spermidine	Millipore Sigma	S2626
Sucrose	Millipore Sigma	S0389
VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600	ELITechGroup	VAPRO 5600