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En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados Representativos
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Presentamos un método para replicar el microambiente tumoral de glioma en el frente invasivo que incorpora flujo de líquido intersticial. Este modelo es un hidrogel de hialuronano-colágeno I en un inserto de cultivo de tejidos donde se puede aplicar un cabezal de presión de fluido. La invasión se puede cuantificar y las células se pueden aislar o lisar.

Resumen

La recurrencia del glioblastoma es un obstáculo importante para el éxito del tratamiento y se debe a la invasión de células madre de glioma (GSC) en el tejido sano que son inaccesibles para la resección quirúrgica y son resistentes a las quimioterapias existentes. El movimiento del líquido a nivel tisular, o flujo de líquido intersticial (IFF), regula la invasión de GSC de una manera dependiente del microambiente tumoral (TME), lo que pone de relieve la necesidad de sistemas modelo que incorporen tanto el IFF como el TME. Presentamos un método accesible para replicar el TME invasivo en el glioblastoma: un hidrogel de hialuronano-colágeno I compuesto por GSC humanas, astrocitos y microglía sembrado en un inserto de cultivo de tejidos. El IFF elevado se puede representar aplicando una cabeza de presión de fluido al hidrogel. Además, este modelo se puede ajustar para replicar las diferencias inter o intrapacientes en las proporciones celulares, las tasas de flujo o las rigideces de la matriz. La invasión se puede cuantificar, mientras que los geles se pueden cosechar para una variedad de resultados, incluida la invasión de GSC, la citometría de flujo, la extracción de proteínas o ARN, o la obtención de imágenes.

Introducción

El glioblastoma es una enfermedad devastadora, caracterizada por una supervivencia corta1 que se prolonga solo moderadamente con los tratamientos clínicamente disponibles 2,3. Este impedimento para una terapia eficaz se debe en gran medida a la naturaleza altamente infiltrativa de las células madre de glioma quimiorresistente (GSC) que son inaccesibles para la resección y la siembra de tumores recurrentes4. Al mismo tiempo, las GSC son altamente plásticas, respondiendo a diversos estímulos en el microambiente tumoral (TME) para s....

Protocolo

Este protocolo se desarrolló de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité Institucional de Bioseguridad de Virginia Tech.

NOTA: Realice todos los procedimientos en un gabinete de cultivo celular BSL-2 a menos que se especifique lo contrario. Consulte al comité de bioseguridad de la institución para obtener orientación sobre el uso de células humanas.

1. Cálculos para la preparación del gel

  1. Calcule el número de condiciones necesarias para el experimento.
    NOTA: Una "condición" se define por el contenido de la solución (por ejemplo, concentracio....

Resultados Representativos

Se proporcionan datos representativos de la invasión (Figura 3), la viabilidad y la expresión de Ki67 y CD71 a través de citometría de flujo (Figura 4) para las líneas GSC publicadas anteriormente para un hidrogel de hialurónico-colágenotiomodificado 12. La presencia de astrocitos y microglía dentro del modelo TME tiene un efecto diferencial en la invasión de GSC dependiendo de la línea celular .......

Discusión

El ensamblaje del modelo TME incluye seis pasos fundamentales: 1) el paso de las células y la separación de las células entre condiciones similares, 2) el ensamblaje de una solución concentrada de colágeno para todas las condiciones, 3) la combinación de los componentes del gel (células, colágeno, ácido hialurónico metacrilato y el fotoiniciador) para cada condición, 4) el recubrimiento de geles, 5) la reticulación por exposición a los rayos UV y el calor, y 6) la adición d.......

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses relevantes que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a las fuentes de financiación para este trabajo: los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional del Cáncer (R37 CA222563 a J.M.), la Fundación Coulter (J.M.) y Virginia Tech ICTAS-CEH (J.M. & J.H.). Las GSC utilizadas en este ensayo fueron derivadas por Jakub Godlewski, Ph.D. (Escuela de Medicina de Harvard).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
12 Well Tissue Culture Plate, SterileCelltreat Scientific Products 229112
250 mL Filter  System, PES Filter Material, 0.22 µm, 50 mm, SterileDOT Scientific667706
385 nm, 1650 mW (Min) Mounted LED, 1700 mA Thorlabs M385LP1-C1
75cm2 Tissue Culture Flask - Vent Cap, SterileCelltreat Scientific Products229341
8.0 μm Cell Culture Plate Insert 12 mm DiameterMillicellPI8P01250
Absolute Ethanol, 200 proof, Molecular Biology GradeThermo Fisher ScientificT038181000CSEthanol for flow cytometry dead cell control.
Astrocyte Medium (Astrofull)ScienCell Research Laboratories1801Contains astrobasal, FBS, and penicillin/streptomycin. 
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A (Gibco)Thermo Fisher Scientific12587010
BSA (MACS)Miltenyi Biotec 130-091-376
CD71 antibody (eBioscience, Invitrogen)Fisher Scientific 25-0719-41
Cell Counting Chambered SlidesNexcelom BioscienceCHT4-PD100-002
Cell ScrapersBiologix USA 70-1250
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter (Nexelcom Bioscience)VWR NEXCCMK2-SK150-FCS
Centrifuge - Low-SpeedEppendorf 5702 RCentrifuge for cell culture.
Clear Polystyrene 96-Well Microplates, CorningFisher Scientific07-200-108V-bottom plates for flow cytometry staining.
CO2 Incubator, 150L, Heracell 150i (Thermo Scientific)Thermo Fisher Scientific50116047
Collagen I, High Concentration, Rat TailCorning354249
Collagen I, Rat TailCorning354236"Low" concentration for coating adherent flasks.
Collagenase (CAS# 9001-12-1)United States BiologicalC7511-30
Collimation Adapter for Olympus BX & IX, AR Coating: 350 - 700 nmThorlabsCOP1-A
Cotton Swabs, Q-tips Precision Tips AmazonB01KCJB3R2
Dispase (CAS# 9001-92-7) United States BiologicalD3760
DMEM, high glucose (Gibco)Thermo Fisher Scientific11330032
EVOS FLInvitrogenAMF4300
Fetal Bovine Serum (Gibco)Thermo Fisher Scientific26140079For microglia culture.
Formalin solution, neutral buffered, 10% (Sigma-Aldrich) Millipore SigmaHT501128
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience, Invitrogen)Thermo Fisher Scientific00-5523-00
Glioma stem cellsn/an/aCan be patient derived or commercial glioma stem cell lines. 
Guava easyCyte HT SystemMillipore Sigma0500-4008Flow cytometer.
HBSS (Sigma-Aldrich) Millipore SigmaH6648
HEPES (1 M) (Gibco)Thermo Fisher Scientific15630080
High-Power 1-Channel LED Driver with Pulse Modulation, 10.0 A Max, 50.0 V Max ThorlabsDC2200Interface for UV Lamp.
Hoechst 33342 Solution (20 mM) (Thermo Scientific)Thermo Fisher Scientific62249
Human AstrocytesScienCell Research Laboratories1800Primary astrocytes derived from the cerebral cortex.
Human EGF Recombinant Protein (Gibco)Thermo Fisher ScientificPHG0311
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (aa 10-155) Recombinant Protein (Gibco)Thermo Fisher ScientificPHG0021
Immortalized Human Microglia - hTERTApplied Biological Materials T0251
Incu-mixer MP Heated Microplate Vortexer, 2 positionBenchmark Scientific H6002
Ki67 REAfinity, PerCP-Vio 700 antibodyMiltenyi Biotec130-120-420
LED UV Curing MeterGigahertz-OptikX1-RCH-116Optometer to measure UV light intensity.
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Advanced Biomatrix5269-100MG Photoinitiator.
LIVE/DEAD Fixable Near-IR (Invitrogen) Thermo Fisher ScientificL24975
Methacrylated hyaluronic acid (photoHA)Advanced Biomatrix5212-100MG
Microcentrifuge, Sorvall ST8R (Thermo Scientific)Fisher Scientific75-997-203Centrifuge for flow cytometry staining.
N-2 Supplement (100X) (Gibco)Thermo Fisher Scientific17502048
Neurobasal-A Medium (Gibco)Thermo Fisher Scientific10888022
PBS (10X), pH 7.4 without Ca & MgQuality Biological119-069-101
Sodium hydroxide, pellets ACS (CAS# 1310-73-2)VWR 97064-476
Synergy Ultrapure Water Purification System (MilliporeSigma)Fisher Scientific SYNS0HFUS
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red (Gibco)Thermo Fisher Scientific25200056
ViaStain AOPI Staining SolutionNexcelom BioscienceCS2-0106

Referencias

  1. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2016-2020. Neuro Oncol. 25, 1-99 (2023).
  2. Stupp, R., et al.

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