Estabilización de una osteotomía de fémur con fijación en placa en Ambystoma mexicanum

Resumen

Se presenta un protocolo para la cirugía de osteotomía femoral con el uso de la fijación interna de la placa en ajolotes maduros. El procedimiento se puede utilizar para realizar estudios comparativos sobre la regeneración de extremidades y la curación de fracturas en anfibios acuáticos.

Resumen

El ajolote (Ambystoma mexicanum) es un organismo modelo prometedor para la medicina regenerativa debido a su notable capacidad para regenerar órganos perdidos o dañados, incluidas extremidades, cerebro, corazón, cola y otros. Los estudios sobre el ajolote arrojan luz sobre las vías celulares y moleculares que gobiernan la activación de los progenitores y la restauración de tejidos después de una lesión. Este conocimiento se puede aplicar para facilitar la curación de lesiones incompetentes por regeneración, como la pseudoartrosis ósea. En el protocolo actual se describe la estabilización de la osteotomía fémur mediante un sistema de fijación interna de placa. El procedimiento fue adaptado para su uso en animales acuáticos (ajolote, Ambystoma mexicanum). ≥Se utilizaron ajolotes de 20 cm desde el hocico hasta la punta de la cola con fémures comparables del tamaño de un ratón totalmente osificados, y se prestó especial atención a la posición y fijación de la placa, así como a los cuidados postoperatorios. Esta técnica quirúrgica permite la fijación ósea estandarizada y estabilizada y podría ser útil para la comparación directa con la regeneración de extremidades de ajolotes y estudios análogos de la curación ósea en anfibios y mamíferos.

Introducción

El ajolote (Ambystoma mexicanum) es un modelo importante para la regeneración de órganos, incluyendo la cola, la médula espinal, el cerebro, el corazón, las branquias y las extremidades 1,2,3,4,5. Los estudios detallados de la regeneración de las extremidades de los ajolotes descubrieron mecanismos de desdiferenciación celular y la formación de un grupo de células madre, blastema, en el sitio de la amputación. Debido a la capacidad de las células del blastema para reconstruir todas las partes faltantes de las extremidades, incluido un esqueleto con patrón ^6,7, el ajolote parece ser un organismo modelo atractivo para los estudios de curación ósea. Recientemente, varios estudios se centraron más en la biología ósea de los ajolotes, describiendo la morfología del esqueleto, la composición celular y la dinámica de osificación.

Se encontró en mamíferos que el proceso de curación ósea en huesos largos ocurre a través de la osificación endocondral y consta de varias etapas: hematoma, tejido de granulación y formación de callos blandos, osificación de callos en callo duro y hueso tejido, y remodelación ósea⁸. Un estudio reciente ha demostrado que se pueden observar etapas similares en la cicatrización del hueso del ajolote⁹.

Hasta ahora, las fracturas de ajolote se estudiaban en un sistema no estabilizado, en el que el hueso se corta simplemente con tijeras de iridectomía. Las grandes fracturas se crearon en el zeugópodo, donde la osteotomía se realiza en uno de los huesos, mientras que el otro sirve de soporte^10,11. Por el contrario, las fracturas se estudian de forma rutinaria en mamíferos, incluidas ratas y ratones, utilizando sistemas de fijación confiables, como clavos intramedulares y placas de alineación ósea, para controlar el tamaño de la fractura y garantizar la alineación ósea.

Por lo tanto, el método tiene como objetivo asegurar una fijación estabilizada y uniforme del fémur del ajolote antes de la osteotomía. Con el fin de hacer los estudios de ajolotes más comparables con los de los mamíferos, incluidos los ratones y los humanos, se consideró la fijación del pin^{intramedular 12}, el fijador de la placa externa^{13,14 y la} fijación de la placa de alineación ósea interna 15,16,17. Se demostró que este último asegura la correcta fijación del hueso y permite crear un espacio de cierto tamaño mediante el uso de uno o dos cortes con una sierra Gigly de un diámetro específico. Como los ajolotes representan las larvas acuáticas de Ambystoma mexicanum, el fijador externo podría haber causado complicaciones postquirúrgicas debido a la herida abierta y al contacto con el agua. Dado que los ajolotes no desarrollan centros de osificación secundarios incluso hasta muy tarde en su desarrollo (20 años¹⁸) y, por lo tanto, no se podía evitar que el clavo intramedular estándar utilizado en ratones perforara las epífisis, se tomó la decisión de aplicar un método de fijación de placas internas a los ajolotes grandes. En los ajolotes grandes, el tamaño del fémur y el grado de osificación se asemejan a los de un ratón adulto, lo que permite una osteotomía diafisaria media con fijación de placa de titanio¹.

El tamaño del espacio de fractura determina en gran medida la dinámica de curación y el resultado. Por ejemplo, en un ratón, las fracturas estabilizadas de 0,25 mm se curan principalmente a través de la osificación intramembranosa debido a su pequeño tamaño y estabilización rígida; una fractura de 0,7 mm cicatriza por osificación endocondral, con la formación de un callo cartilaginoso alrededor de la fractura; Los defectos grandes, como los defectos de tamaño crítico de 3,5 mm, no se curan completamente y, por lo tanto, se utilizan para modelar la falta de consolidación de la fractura ósea¹⁶. En este estudio, se estableció el protocolo de fijación en placa del fémur del ajolote antes de la osteotomía utilizando el ejemplo de un espacio de fractura de 0,7 mm con el objetivo final de comparar la cicatrización del hueso del ajolote con la del ratón⁹.

Después de la osteotomía, las fracturas se sometieron al proceso de osificación endocondral, aunque más lento que en los ratones, posiblemente debido al estilo de vida acuático de los ajolotes y a tasas de división celular más lentas. En el método que aquí se presenta, se muestra la osteotomía de espacio de 0,7 mm con fijación de placa rígida; Sin embargo, otros tamaños de espacio y fijadores semiflexibles, así como placas de diferentes materiales, son potencialmente posibles. En general, el método presentado aquí se puede utilizar para la fijación ósea estandarizada y será útil para los estudios que comparan la regeneración de las extremidades de los ajolotes con la cicatrización ósea o para estudiar la cicatrización ósea en ajolotes en diferentes condiciones para garantizar la fijación estandarizada de las fracturas.

Protocolo

El siguiente procedimiento se realizó con la aprobación del Magistrado de Viena (GZ: MA 58-65248-2021-26). De 5 a 8 años de edad, ≥se utilizaron ajolotes de 20 cm de largo (hocico a la punta de la cola) de 20 cm para la cirugía de fracturas y amputaciones. Para las cirugías se utilizaron tanto hombres como mujeres. Los ajolotes se criaron en las instalaciones del Instituto de Investigación de Patología Molecular. El dolor y el riesgo de infecciones se trataron con analgésicos y antibióticos adecuados para garantizar un resultado exitoso. Los reactivos y equipos utilizados para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación animal

1. Bañe al animal en una solución de benzocaína al 0,03% durante unos 15-20 minutos hasta que se alcance la sedación completa y no haya movimiento reflejo al tocar las extremidades con pinzas.
2. Coloque al animal con el lado ventral hacia abajo sobre toallas de papel húmedas empapadas en una solución de benzocaína al 0,03% y cúbralo con toallas de papel empapadas en benzocaína. La piel de los animales acuáticos, como los ajolotes, es sensible a la sequedad y, por lo tanto, es esencial cubrir la superficie corporal para evitar la deshidratación y asegurar la respiración cutánea (piel).
3. Estire la extremidad trasera que se va a operar con pinzas de anillo. No aplique reactivos desinfectantes, como etanol, ya que la piel del ajolote es sensible a los productos químicos y se irrita fácilmente. En su lugar, use 0.7x PBS (A-PBS) con 50 U/mL de penicilina y 20 μg/mL de estreptomicina para limpiar la extremidad y luego para la irrigación ósea al aserrar.
   NOTA: La infección generalmente no es una preocupación para las cirugías realizadas en ajolotes. Sin embargo, debido a la naturaleza acuática de estos animales y a las suturas colocadas en la superficie de la piel, recomendamos el uso de antibióticos para evitar cualquier contaminación del sitio quirúrgico.

2. Cirugía

NOTA: Esterilice todos los instrumentos quirúrgicos. Los métodos de esterilización comunes, como la esterilización por calor, el autoclave y el lavado en etanol al 70%, seguidos de la eliminación completa de los restos de alcohol, son adecuados para este propósito. Si opera en varios animales, esterilice las herramientas entre medias con un esterilizador de perlas calientes o etanol al 70%.

1. Realizar una incisión longitudinal lateral (1,5-2 cm) con un bisturí por encima del hueso del fémur que abarque todo el muslo en la extremidad posterior superior. Para hacer esto, palpa el hueso antes de cortar la piel.
2. Desplazar con cuidado los músculos y nervios del sitio de la cirugía sin cortar. Use pinzas arqueadas para hacerlo de manera eficiente.
3. Coloque suavemente pinzas arqueadas debajo del fémur para exponerlo para la cirugía.
4. Coloque una placa fijadora rígida de 7,75 mm y 4 orificios junto con la diáfisis del fémur, evitando tocar las articulaciones, y asegúrela en la posición alineada con pinzas.
5. Utilice cuatro tornillos de titanio de 2 mm para fijar el hueso a la placa.
   NOTA: Los tornillos utilizados en este protocolo tienen un diseño complejo y constan de 4 partes: la parte principal (se atornillará en el hueso), cabeza de tornillo (permite la extracción de los tornillos y la placa con la llave de caja cuadrada), cuello más estrecho (utilizado como punto de rotura una vez que el tornillo se aprieta en el hueso) y un mango de tornillo (utilizado para sujetar al destornillador y al dispositivo de guía de la sierra).
6. El orden de fijación de los tornillos es importante. Comience con los tornillos interiores primero y luego con los dos tornillos exteriores para asegurarse de que la placa esté alineada con el eje del hueso. Utilice un taladro manual para crear el primer orificio en el hueso para facilitar la inserción del tornillo, seguido de la colocación del^1er tornillo. Taladre en el centro de la circunferencia ósea para evitar el hueso más delgado en un lado, lo que puede resultar en una fractura ósea espontánea. Utilice el riego con 0,7x PBS + 1% de pluma/estreptococo durante la perforación. No rompa el mango de los tornillos de la^1ª (opcional:^1ª y^2ª).
7. Aplique el dispositivo de guía de la sierra en el 1^tornillo (opcional: 1^punto y 2⁾ y alinéelo con el hueso y la placa.
   NOTA: En este protocolo, el mismo fabricante proporciona una placa, tornillos, un dispositivo de guía de sierra y una sierra y se optimizan para adaptarse entre sí. El dispositivo de guía de sierra puede venir en diferentes tamaños para ser compatible con diferentes placas y tamaños de sierra.
8. Utilice el dispositivo de guía de la sierra para perforar e insertar el resto de los tornillos. Asegúrese de alinear la placa con el hueso. Rompe las manijas de los tornillos.
9. Coloque un trozo de película plástica (6-7 mm por 4-5 cm), esterilizado con etanol al 70% y luego esterilizado en autoclave o esterilizado con calor (140 °C durante 4 horas), debajo del fémur para evitar daños en los tejidos blandos durante el proceso de osteotomía.
   NOTA: Para este propósito, se puede usar un trozo de película de plástico, cortado de una bolsa para la esterilización por calor.
10. Coloque la sierra de alambre Gigly entre el hueso y la película de protección.
11. Corte el hueso con la sierra de hilo Gigly de 0,66 mm, creando un solo corte de 0,7 mm en el fémur. Utilice el riego constante con 0,7x PBS + 1% de pluma/estreptococo durante el aserrado para minimizar el daño y la fricción en los tejidos.
12. Retire la sierra y la guía de la sierra y use un destornillador para separar los mangos de los tornillos.
13. Retire la película protectora e irriga el sitio de la cirugía con 0.7x PBS + 1% Pen/Strep.
14. Cubra la parte superior de la placa y los tornillos con cera de abeja de hueso estéril para proteger la piel y los músculos de la irritación por los bordes de los tornillos.
15. Coloca los músculos y la piel encima del hueso de cera de abeja.
16. Cierre el sitio de la incisión con una sutura sintética 7.0 (polipropileno/polietileno) usando puntos interrumpidos simples. La sutura sintética se utiliza para minimizar la contaminación con bacterias y hongos transmitidos por el agua.

3. Manejo postoperatorio

1. Para despertar al animal, colóquelo en un tanque con agua fresca de estanque artificial, suplementada con 50 U/mL de penicilina, 20 μg/mL de estreptomicina y Butorfanol analgétic (0,5 mg/L de agua).
2. Observe al animal para comenzar a mover las branquias, dar pasos y nadar, generalmente dentro de 1 hora después de la cirugía.
3. Mantenga al animal durante 3 días en agua de estanque artificial con 50 U/mL de penicilina y 20 μg/mL de estreptomicina antes de devolverlo al tanque de retención. Para asegurar la analgesia, añadir Butorfanol (0,5 mg/L de agua).
4. Asegúrese de que las suturas permanezcan en su lugar y que se produzca una cicatrización adecuada de la herida.

Resultados

El procedimiento quirúrgico descrito aquí (Figura 1) dura entre 20 min y 30 min y requiere un cirujano y un asistente. Opcionalmente, utilice un microscopio de disección binocular o un sistema de lupa.

Figura 1: Esquemas del procedimiento quirúrgico y la configura...

Discusión

El método actualmente descrito de fijación de la placa de fémur y osteotomía permite su aplicación en animales acuáticos, como el Ambystoma mexicanum (axolotl). Este método quirúrgico se utilizó recientemente para comparar la cicatrización de fracturas y la regeneración de extremidades en ajolotes con la cicatrización de fracturas en ratones⁹. Al igual que en los ratones, se puede unir una placa fijadora de 4 orificios al hueso con tornillos a...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.66 mm Gigly wire saw	RISystem	RIS.590.120
7.0 Optilene suture	Braun	C3090538
Benzocaine	Sigma-Aldrich	E1501	dilute to 0.03%  prior to using
Butorphanol (Butomidor 10 mg/mL)	Richter Pharma AG	-	dilute to 0.5 mg/L  prior to using
Drill bit 0.30 mm	RISystem	RIS.590.200
Dumont #5 Forceps - Standard/Inox	Fine Science Tools	11251-20
Hand drill	RISystem	RIS.390.130	better to have at least 3 pieces
Micro CT data analyzer	Bruker, Billerica, MA, USA	SkyScan NRecon software
Micro CT specimen scanner	Bruker, Billerica, MA, USA	SkyScan 1172
Moria MC31b Iris forceps - smooth, curved, 10 cm	Fine Science Tools	11373-12FST	2 pieces
MouseFix Drill-&Saw guide 1.75 mm, rigid	RISystem	RIS.301.102
MouseFix plate 4 hole, rigid	RISystem	RIS.401.110
MouseFix screw, L =2.00 mm	RISystem	RIS.401.100	need 4 per bone
Narrow Pattern Forceps	VWR	FSCI11002-12
penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122
Ring forceps	Fine Science Tools	11103-09
scalpel #15	B Braun, Thermo Fischer Scientific	5518032
Square box wrench 0.50 mm	RISystem	RIS.590.111
Sterile bone wax, 2.5 g	Ethicon, Johnson & Johnson	W810
Student Fine Scissors - Straight/11.5cm	Fine Science Tools	91460-11