Perfusión hepática de rata y aislamiento primario de hepatocitos: un antiguo procedimiento crucial para el cultivo de organoides 3D de última generación

Resumen

Este protocolo presenta una técnica optimizada de perfusión hepática de colagenasa en dos pasos en un modelo de rata y muestra el uso de hepatocitos aislados para el cultivo in vitro a largo plazo de organoides 3D.

Resumen

Los hepatocitos primarios son una herramienta comúnmente utilizada para estudios in vitro relacionados con el hígado. Sin embargo, el mantenimiento de estas células siempre ha sido un desafío debido a la rápida pérdida de morfología, viabilidad y funcionalidad en cultivo. Un enfoque reciente para el cultivo a largo plazo es la generación de organoides tridimensionales (3D), una herramienta in vitro que puede recapitular tejidos en un plato basándose en la maravillosa capacidad del hígado para regenerarse a sí mismo. Los protocolos publicados han sido diseñados para obtener organoides 3D funcionales a largo plazo a partir de hepatocitos adultos primarios (Hep-Orgs). La herramienta de vanguardia para organoides 3D requiere la capacidad de aislar las células del tejido adulto, y este paso inicial es crucial para obtener un resultado final de alta calidad. La perfusión de colagenasa en dos etapas, introducida en la década de 1970, sigue siendo un procedimiento válido para obtener hepatocitos individuales. El presente artículo tiene como objetivo describir todos los pasos cruciales del procedimiento quirúrgico, optimizando así el procedimiento de aislamiento de hepatocitos primarios en el modelo de rata. Además, se presta especial atención a las directrices PREPARE para aumentar la probabilidad de éxito de los procedimientos y garantizar resultados de alta calidad. Un protocolo detallado permite a los investigadores acelerar y optimizar el trabajo posterior para establecer organoides 3D a partir de hepatocitos primarios de ratas adultas. En comparación con los hepatocitos 2D, las Hep-Orgs seguían siendo viables y estaban en proliferación activa en el día 15, lo que demuestra un potencial a largo plazo.

Introducción

Los hepatocitos primarios son una herramienta importante y ampliamente utilizada para los estudios in vitro relacionados con el hígado. Sin embargo, su expansión y mantenimiento han sido históricamente desafiantes, ya que pierden morfología y funcionalidad después de unos días en el cultivo¹. El cultivo 2D es una condición limitante, en particular, para los hepatocitos que tienen una forma poligonal y una estructura polarizada con membranas apicales y basolaterales diferenciadas. De hecho, la adhesión de los hepatocitos a la placa interfiere con su actividad normal, ya que conduce a un citoesqueleto plano con interacción limitada entre las células y entre las células y la matriz extracelular (MEC), reduciendo la polarización y las vías de señalización involucradas².

Para eludir las limitaciones de este método, Dunn y sus colegas³ utilizaron primero la doble capa de colágeno. Este método de cultivo, conocido como "método de cultivo en sándwich", se basa en la siembra de hepatocitos primarios entre las dos capas de la matriz. Este método tiene muchas ventajas, incluyendo el cultivo a largo plazo, el mantenimiento de la morfología poligonal y las actividades transcripcionales comparables a las de los hepatocitos recién aislados⁴. Un método similar, basado en el mismo principio, en el que la capa subyacente está compuesta por Matrigel mientras que la capa está compuesta por colágeno, ha evidenciado la presencia de una red canalicular bien establecida⁵.

A pesar de la fiabilidad del método de cultivo en sándwich para el crecimiento de hepatocitos, el presente trabajo espera establecer un cultivo de organoides en 3D, una herramienta in vitro utilizada para recapitular tejidos en una placa y formar un puente potencial hacia la medicina personalizada, permitiendo la generación de conocimientos biológicos específicos de enfermedades, la identificación de objetivos moleculares, la prueba de fármacos, el establecimiento de biobancos y la apertura de nuevos horizontes para tecnologías innovadoras como el órgano en chip⁶. Los hepatocitos primarios se incrustaron en gotas de la matriz hemisférica conocidas como "cúpulas" para permitir un crecimiento robusto de organoides dentro de las cúpulas y garantizar el flujo de los factores solubles, incluidos el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF), desde el medio de cultivo. Estos factores de crecimiento activan directamente las vías de señalización para asegurar la supervivencia de los hepatocitos⁷. Los organoides hepáticos generalmente se obtienen a partir de células madre/progenitoras aisladas de etapas embrionarias o de ratas adultas, ratones, hígado humano (y también de perros y gatos)⁸. A pesar de que la conformación 3D mejora la diferenciación de las células madre a hepatocitos adultos, esta herramienta aún carece de la madurez del tejido primario original⁹. Para superar este problema, en 2018, dos grupos diferentes ^9,10 publicaron simultáneamente un protocolo para obtener un cultivo a largo plazo de organoides hepáticos 3D a partir de hepatocitos primarios de ratón adultos (denominados Hep-Orgs). Sus protocolos recapitulan la respuesta al daño proliferativo de la regeneración hepática, cultivando hepatocitos con un alto nivel de citocinas inflamatorias, tal y como se produce tras una hepatectomía parcial. De hecho, los estudios anteriores demuestran que los hepatocitos pueden cambiar a un estado ductal después de una lesión¹² o cuando se suprime la proliferación de colangiocitos¹³. Su capacidad bipotente permite la plasticidad celular, que es importante para estructuras complejas como los organoides. Por lo tanto, estos protocolos superan el problema de la incapacidad de expandir los hepatocitos primarios in vitro.

La herramienta de vanguardia para organoides 3D requiere la capacidad de aislar las células del tejido adulto, y este paso inicial es crucial para obtener un resultado final de alta calidad. Si bien la preparación de organoides en 3D podría considerarse una técnica reciente y en desarrollo (porque la definición de organoide fue acuñada por Lancaster¹⁴ y Huch¹⁵ hace solo diez años), la perfusión de colagenasa en dos pasos es un procedimiento antiguo introducido por Seglen en la década de 1970¹⁶. Centrándonos en las publicaciones más recientes en la materia, los protocolos de Ng¹⁷ y Shen¹⁸ podrían considerarse el estándar de oro para realizar el procedimiento en ratas, mientras que los de Cabral¹⁹ y Charni-Natan²⁰ para ratones. No es inusual que los investigadores se centren en elegir la mejor matriz extracelular (MEC) y factores de crecimiento para desarrollar organoides 3D, pero se encuentren con fracasos como un procedimiento quirúrgico inadecuado, baja viabilidad y rendimiento de los hepatocitos o altos niveles de contaminación bacteriana. Estos problemas alargan los experimentos posteriores y aumentan el número de animales necesarios para los siguientes experimentos. Por el contrario, si los procedimientos quirúrgicos y de aislamiento están bien establecidos, el alto número de hepatocitos viables obtenidos permite preparar una gran cantidad de organoides, limitando así el uso de animales. El presente protocolo aborda principalmente estos problemas utilizando soluciones comerciales y optimizando una canulación precisa de la vena porta que garantiza pasos óptimos de perfusión y digestión con el hígado in situ.

Con el fin de mejorar la calidad, la reproducibilidad y la traducibilidad de nuestra investigación con animales, consideramos cuidadosamente las directrices de PREPARE: Planificación de la investigación y los procedimientos experimentales en animales: Recomendaciones para la excelencia²¹. Estas pautas de presentación de informes intentan aumentar la probabilidad de éxito a través de la planificación y representan un paso importante en la implementación de las 3R de Russel y Burch (reemplazo, reducción y refinamiento). Las directrices de PREPARE abarcan 15 temas principales que deben abordarse de acuerdo con cada proyecto de investigación individual. Describiremos los temas en los que nos enfocamos durante la planificación y preparación del proyecto.

El presente trabajo tiene como objetivo describir, en un protocolo exhaustivo, detallado y consecuente, los pasos cruciales de la cirugía en el modelo de rata para permitir a los investigadores acelerar y optimizar el trabajo posterior. Cuando abordamos estos protocolos al principio, experimentamos problemas de contaminación bacteriana, baja eficiencia de digestión hepática, bajo rendimiento de hepatocitos primarios y baja viabilidad de hepatocitos que pueden afectar fácilmente el éxito de la técnica. Al mostrar cómo abordar y resolver características críticas, este protocolo optimizó el procedimiento para el aislamiento primario de hepatocitos de rata. La perfusión hepática de rata y el posterior aislamiento primario de hepatocitos adultos son los principales pasos preliminares para diferentes aplicaciones. En particular, este protocolo es adecuado para todos los procedimientos que requieren un buen rendimiento de hepatocitos adultos de alta calidad y alta viabilidad. Los resultados del protocolo son apropiados para establecer modelos in vitro para estudiar la fisiología y patología hepática.

Protocolo

Todos los procedimientos y el alojamiento de los animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Ley italiana y la directiva de la Comunidad Europea. El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Cuidado Animal local y por el Ministerio de Salud italiano (permiso n° 321/2022-PR) de acuerdo con el art.31 del decreto 26/2014.

1. Preparación para el procedimiento con animales

NOTA: Consulte la Tabla 1 para conocer la composición del medio y el tampón y la Tabla de Materiales para obtener detalles comerciales.

1. Calentar el baño de agua a 42 °C y, a continuación, colocar el tampón de perfusión y 1x PBS en el baño de agua durante unos 20 minutos.
   NOTA: Debido a la sensibilidad de las enzimas, el tampón de digestión se calienta solo cuando el procedimiento de perfusión se ha iniciado con éxito. Durante el procedimiento de perfusión, mantenga las soluciones en el baño de agua.
2. Coloque el medio completo de William y PBS + 3% P/S en hielo.
3. Prepare la bomba peristáltica y conecte el tubo con la botella de vidrio y la trampa de burbujas, ambas llenas de tampón de perfusión.
4. Mientras ceba la bomba, llene el tubo con tampón de perfusión tibio para eliminar el aire y lavar el etanol residual (baja velocidad de la bomba). Este paso también es importante para comprobar el correcto funcionamiento de la bomba y las posibles fugas en los tubos.

2. Preparación para el aislamiento de hepatocitos

1. Durante el procedimiento con animales, exponga los siguientes instrumentos a la luz ultravioleta: placa de Petri de 100 mm, colador de células de 100 μm, raspador tamaño M, pinzas grandes, vaso de precipitados para hielo, bandeja para hielo.

3. Procedimiento inicial con el animal y anestesia

1. Anestesiar a la rata adulta (250-350 g de peso corporal; 10-12 semanas de edad) mediante inyección intraperitoneal de mezcla de anestésicos (concentración final para xilacina: 22,5 mg/kg; para ketamina: 112,5 mg/kg; volumen final aprox.: 0,8-1,0 mL).
2. Controle la profundidad de la anestesia pellizcando los dedos de los pies hasta que la rata ya no responda a los estímulos nocivos. Por lo general, tarda 5 minutos. La dosis anestésica garantiza una anestesia quirúrgica profunda que minimiza el riesgo de sufrimiento o angustia durante el procedimiento
   NOTA: La exanguinación es el método secundario de eutanasia en ratas utilizado en este experimento, y asegura que el animal ha sido sacrificado de manera efectiva.
3. Afeitar el abdomen y limpiarlo con etanol al 70% para reducir la contaminación bacteriana durante la cirugía.
   NOTA: Esta es una cirugía que no es de supervivencia, por lo que no se mantiene una asepsia completa.
4. Coloque la rata en el centro de la bandeja de disección y asegure las extremidades con agujas.
5. Haz una incisión en forma de U a través de la piel y el músculo desde el centro de la parte inferior del abdomen hasta la caja torácica, sujeta la piel y dóblala hasta la cabeza, exponiendo los intestinos.
6. Mueva con cuidado el intestino hacia el lado izquierdo del animal, fuera de la cavidad abdominal, y exponga la vena porta hepática y la vena cava.
7. Con unos alicates, pase un hilo de algodón por debajo de la vena porta y prepare 2 nudos, a 1 cm uno del otro, que rodeen la vena misma.
   NOTA: Un hilo negro es más fácil de visualizar.
8. Inyectar 100-150 UI de heparina disuelta en 1x PBS (volumen total 300 μL) en la vena cava para prevenir la coagulación de la sangre.

4. Canulación y perfusión hepática

1. Encienda la bomba a baja velocidad (menos de 1 mL/min de flujo).
2. Inserte el angiocath de 18 G en la vena porta a nivel de la rosca en un ángulo plano con respecto a la vena.
3. Retire manualmente la aguja interna para dejar la cánula en la vena. La sangre fluirá en su interior, llenando el tapón y evitando las burbujas de aire atrapadas en el siguiente paso.
4. Mientras el tampón de perfusión fluye en el tubo, conecte la cánula presionando el botón C al extremo de salida usando un conector de bloqueo Luer.
5. En este punto, ate los nudos, uno alrededor del catéter dentro de la vena y otro alrededor del catéter, antes de ingresar a la vena para estabilizar el tubo en la posición correcta.
6. Corta la vena cava para dejar salir la sangre. Asegúrese de que el hígado comience a hincharse y blanquearse rápidamente (segundos) en 2-3 s. Esto confirma que el tampón de perfusión fluye correctamente a través del hígado.
   NOTA: Si algunos lóbulos permanecen rojos, el angiocatéter se coloca demasiado profundo. Si solo hay puntos rojos, golpear ligeramente el hígado puede ayudar a la perfusión en los puntos específicos. Vierta un poco de PBS 1x sobre el abdomen abierto para ayudar a mover la sangre y verificar si hay fugas.
7. Aumente lentamente el caudal de la bomba a 10 mL/min y manténgalo durante al menos 10 min para permitir la limpieza del hígado de la sangre.
8. Durante la perfusión, aplique presión sobre la vena cava con un bastoncillo de algodón durante intervalos de 10 s: Asegúrese de que el hígado se hinche al pinzar y se relaje al soltarlo. Repita la presión periódicamente (5-10 veces) y compruebe si hay hinchazón y relajación del hígado.
   NOTA: Este paso sirve como un punto de control crucial para validar visiblemente la perfusión. Ha sido esencial para garantizar una alta vitalidad de los hepatocitos y maximizar el rendimiento final. Al verificar activamente este proceso, el tampón puede llegar eficazmente a todas las partes de la vasculatura hepática, lo que la limpieza pasiva de la sangre por sí sola no lograría.

5. Digestión hepática

1. Después de la perfusión, cambie al tampón de digestión precalentado sin interrumpir el flujo y evitando burbujas de aire en el tubo.
   NOTA: La reducción temporal del flujo puede ayudar a realizar este pasaje. El tampón de digestión incluye rojo de fenol, lo que facilita la visualización del cambio del tampón de perfusión al tampón de digestión.
2. Aumente la velocidad de la bomba a 20 mL/min y presione periódicamente con el hisopo para la hinchazón y relajación del hígado.
3. Después de este paso (que dura unos 15 minutos), asegúrese de que el hígado se vuelva cada vez más blando. En este punto, se puede quitar la aguja y la bomba se detiene.
4. Como la cápsula hepática es frágil después de la digestión, diseccione el hígado con suavidad y cuidado: agarre el tejido conectivo central entre los lóbulos con pinzas. Corta todas las conexiones con otros órganos y levanta el hígado.
5. Lave el hígado, sumergiéndolo en la solución preenfriada de PBS + 3% P/S durante unos segundos. Luego, colóquelo en el tubo completo de contenido medio de William's preenfriado.
   NOTA: La exanguinación y la muerte aseguran la perfusión a través de la vena cava. La confirmación de la muerte del animal proviene del neumotórax inducido en el momento en que se explanta el hígado, y el diafragma se diseca por completo, y tras la inspección, la respiración y los latidos del corazón ya no son funcionales.

6. Purificación de hepatocitos

1. Bajo el capó biológico, transfiera el hígado a la placa de Petri de 100 mm con los 15 mL de medio completo William's frío sobre una bandeja llena de hielo.
2. Presione el órgano vigorosamente con el raspador para liberar las células en el medio.
   NOTA: Si la fase de digestión se ejecuta correctamente, la liberación celular debería ser fácil y no requerir mucha presión sobre el hígado. No corte el hígado en trozos; Déjalo intacto. Mantener el hígado sumergido en el medio mejora la liberación de células.
3. Recoja las células que contienen medio y fíltrelas con el filtro de 100 μm mientras las transfiere a un tubo cónico estéril. La filtración permite la eliminación de tejidos conectivos y fragmentos de tejido no digeridos.
4. Vierta aproximadamente 15 ml de medio completo frío de William sobre el hígado triturado en la placa de Petri para ayudar a liberar más células. Repita los pasos 6.2 y 6.3.
5. Repita el punto 6.4 al menos una vez, hasta que se liberen todas las celdas. Si es necesario, divida el medio en tubos más cónicos y utilice varios filtros de 100 μm.
   NOTA: Después de la liberación de los hepatocitos y antes del filtrado, el medio debe verse opaco debido a la presencia de los hepatocitos. El hígado restante debe tener un aspecto fibroso y se desechará.
6. Centrifugar el medio filtrado que contiene células hepáticas a 50 x g durante 3 min a 4 °C con un freno de baja velocidad.
   NOTA: Los hepatocitos son más densos que otras células hepáticas. Debido a la baja fuerza de centrifugación, solo los hepatocitos estarán en el gránulo, mientras que otras células permanecerán en el sobrenadante.
7. Deseche el sobrenadante sin alterar la pelletización de la célula. Agregue suavemente unos 40 ml de medio completo William's helado en el tubo y pipetee lentamente hacia arriba y hacia abajo de 2 a 3 veces para resuspender el pellet de celda.
   NOTA: El pellet de celda debe resuspenderse con cuidado para evitar dañar las celdas.
8. Centrifugar a 50 x g durante 3 min a 4 °C.
   NOTA: Para los primeros intentos, cuente las células viables con un ensayo de azul de tripán 1:10 después de la segunda centrifugación antes de continuar con los siguientes pasos. Esto puede evitar la pérdida de medios y tiempo si todas las celdas están muertas.
9. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 25 mL de medio completo William's helado.
10. Agregue 25 ml de solución de gradiente de densidad al 90% en el tubo y mezcle suavemente.
    NOTA: Una solución de gradiente de densidad separa los hepatocitos viables de los hepatocitos muertos y los restos celulares en función de su densidad.
11. Centrifugar a 200 x g durante 10 min a 4 °C. Se debe obtener una bolita visible en la parte inferior del tubo, correspondiente a los hepatocitos viables, y una capa transparente en la parte superior del gradiente compuesta por hepatocitos muertos.
    NOTA: Si no hay ningún pellet, intente mezclar la solución nuevamente girando y repita la centrifugación.
12. Aspire la capa de células muertas desde la parte superior del gradiente y deje 1-2 mL del medio con el pellet.
13. Vuelva a suspender el pellet en 30-40 mL del medio completo de William.
    NOTA: Para todo el procedimiento, utilice únicamente pipetas serológicas de 25 ml. Las pipetas de menor diámetro pueden reducir la viabilidad de los hepatocitos. Todos los pasos deben realizarse sobre hielo para mantener +4 °C.
14. Centrifugar a 200 x g durante 10 min a 4 °C y, a continuación, aspirar el sobrenadante.

7. Cultivo de hepatocitos y recolección de ARN

1. Agregue una cantidad adecuada de medio para el conteo de células. Cuente la viabilidad de las células con azul de tripano 1:10.
2. Cultivo de hepatocitos en 2D
   1. Placas de células a la concentración de 500.000 células/pocillo de placa de 6 pocillos en una placa de células recubierta de colágeno con medio completo de William precalentado.
   2. Colocar el cultivo celular en una incubadora humidificada con 95% de aire, 5% de CO₂ a 37 °C.
   3. Después de 4 h, cambie el medio por el nuevo medio completo William's precalentado.
   4. Mantenga las células en la incubadora. Cambie el medio a diario.
   5. Recoja los hepatocitos primarios en un reactivo para la extracción de ARN antes de la siembra (día 0) y en los días 1 a 3 de cultivo.
   6. Extraiga el ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante y transcriba de forma inversa a ADNc para la evaluación de genes marcadores hepáticos mediante RT-qPCR. La lista de cebadores se presenta en la Tabla 2.
3. Para el cultivo de hepatocitos a largo plazo en 3D:
   1. Vuelva a suspender las células en la matriz pura fría a la concentración de 1.000-10.000 células en 20 μL.
      NOTA: Trate de evitar hacer burbujas de matriz.
   2. Usando puntas de pipeta preenfriadas, placa las gotas celulares que contienen matriz en placa de cultivo celular precalentada.
   3. Dale la vuelta a la placa y déjala en la incubadora de cultivos celulares durante 20-30 min.
   4. Súbelo y añade el medio de hepatocitos 3D a largo plazo precalentado y el medio de cultivo específico según el trabajo de Peng²². Mantenga las células en la incubadora.
   5. Cambie el medio de hepatocitos a largo plazo 3D cada 2-3 días.
   6. Al menos después de 14 días de cultivo, las Hep-Orgs se separan de la matriz y las Hep-Orgs viables se evalúan mediante el ensayo de proliferación de Trypan blue y EdU y se pasan de acuerdo con el trabajo de Peng.

Resultados

Al final de los procedimientos de configuración (paso 6.13), obtuvimos un rendimiento celular de hasta 1 x 10⁸ células por aislamiento del hígado de aproximadamente 300 g de una rata. La viabilidad celular entre el 78% y el 97% se estableció mediante el conteo con azul de tripano.

Como ya se ha descrito en estudios previos ^1,18,19, los hepatocitos prima...

Discusión

Los organoides 3D son una frontera para la medicina personalizada y permiten un cultivo de hepatocitos a largo plazo. La calidad de esta técnica innovadora requiere un buen rendimiento de hepatocitos primarios viables y un buen rendimiento de perfusión hepática y aislamiento de hepatocitos. Este antiguo procedimiento sigue siendo muy utilizado; Sin embargo, comprende diferentes pasos que pueden ser desafiantes. Al abordar el procedimiento, experimentamos problemas críticos como la co...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
A83-01- ALK5 Inhibitor IV	Twin Helix	T3031
B27	Thermofisher Scientific	0080085SA
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad
CHIR99021	Twin Helix	T2310
Click EdU Alexa 488 imaging kit	Thermofisher Scientific	C10499
Collagen, Type I, solution from rat tail	Merck	C3867-1VL
Dexamethasone	Merck	D4902
EGF	Merck	E9644
Fetal bovine serum (FBS)	Euroclone	ECS0180L
GELTREX LDEV FREE RGF BME	Thermofisher Scientific	A1413202
Heparin Sodium 25000 IU/5 ml	B. Braun Melsungen AG	B01AB01
HGF	Peprotech	100-39H
Insulin-Transferrin-Selenium solution 100x	Thermofisher Scientific	41400045
L-Glutamine solution	Euroclone	ECB3000D
Liver Digest Medium	Thermofisher Scientific	17703-034
Liver Perfusion Medium	Thermofisher Scientific	17701038
N2 supplement	Thermofisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A9165
Nicotinamide	Merck	N-0636
Non-Essential Amino Acids	Merck	M7145
Normocin	Aurogene	ant-nr-1
PBS buffer 1X	PanReac AppliChem	A0964,9050
Penicillin-streptomycin solution 100x	Euroclone	ECB3001D
Percoll	Santa Cruz	sc-296039A
Peristaltic pump	Ismatec™	MS-4/12 Reglo Digital Pump
TNFa	Peprotech	300-01A
TRI Reagent	Merck	T9424
Tubing	Ismatec™	ID.2,79mm
Williams' E Medium, no glutamine	Thermofisher Scientific	31415029
Y27632	Twin Helix	T1725