Comprender el desarrollo de vías compensatorias en un parásito mutante de la malaria que alberga un alelo hipomórfico de quinasas similares a las plantas

Resumen

La genética química implica la sustitución de un residuo guardián por un aminoácido que contiene una cadena lateral diferente en el locus objetivo. Aquí, hemos generado un parásito mutante que contiene un alelo hipomórfico de cdpk1 e identificado las vías compensatorias adoptadas por el parásito en el fondo mutante.

Resumen

Uno de los mecanismos para subvertir el efecto de los medicamentos por el parásito de la malaria es a través del recableado de su transcriptoma. El efecto es más pronunciado en el caso de los genes diana que pertenecen a la familia multigénica. Las proteínas quinasas de Plasmodium falciparum pertenecientes a la familia CDPK son esenciales para el desarrollo de la etapa sanguínea. Como tales, las CDPK se consideran buenos objetivos para el desarrollo de compuestos antipalúdicos. El enfoque de la genética química se ha utilizado históricamente para dilucidar la función de las proteínas quinasas en los eucariotas superiores. Requiere la sustitución del residuo guardián por otro aminoácido con una cadena lateral diferente a través de la manipulación genética. La sustitución de aminoácidos en la posición de guardián modula la actividad de una proteína quinasa y cambia su susceptibilidad a una clase específica de compuestos conocidos como inhibidores de la quinasa (BKI) que ayudan en la identificación funcional del gen objetivo. Aquí, hemos explotado el enfoque de la genética química para comprender los mecanismos compensatorios evolucionados por un parásito mutante que alberga un alelo hipomórfico de cdpk1. En general, nuestro enfoque ayuda a identificar vías compensatorias que pueden ser dirigidas simultáneamente para prevenir el desarrollo de resistencia a los medicamentos contra quinasas individuales.

Introducción

La malaria es una de las principales enfermedades infecciosas que causa millones de muertes cada año, especialmente en niños menores de 5 años¹. No existe una vacuna clínicamente disponible contra la malaria. Además, se sabe que el Plasmodium falciparum, el parásito más mortal de la malaria humana, ha adquirido resistencia contra el fármaco de primera línea llamado artemisinina 2,3,4,5. Existe una necesidad urgente de identificar nuevos objetivos farmacológicos y estrategias ....

Protocolo

La P. La cepa del parásito falciparum (NF54) se obtuvo de Álvaro Molina Cruz 21,32,33. Los glóbulos rojos humanos O⁺ utilizados para el cultivo del parásito se obtuvieron del Centro Rotario de Sangre de Nueva Delhi (India). Los plásmidos, pL6eGFP y pUF1, se obtuvieron de José-Juan López-Rubio. El DSM267 se obtuvo de Margaret A. Phillips y Pradipsinh K. Rathod. WR99210 fue proporcionado por Jacobus Pharmaceutical Company.

1. Construcción de un plásmido para la expresión de CDPK1 re....

Discusión

La generación de un parásito transgénico mutante que contiene un alelo hipomórfico de cdpk1 se basa en los datos de actividad de quinasas in vitro con enzimas recombinantes. Es mejor generar tantas proteínas recombinantes mutantes con diferentes residuos de control como sea posible. Dado que el genoma de P. falciparum es altamente rico en AT, por lo tanto, la expresión de proteínas recombinantes en E. coli puede requerir optimización d.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	04906 845001
AflII	NEB	R0520S
Albumax II	Gibco	11021-037
Anti-GST antibody	ThermoFisher Scientific	G7781
Anti-Mouse HRP	Sigma-Aldrich	A4416
Anti-Rabbit HRP	Sigma-Aldrich	A6154
BamHI	NEB	R3136S
BtgZ1	NEB	R0703S
Centrifuge	ThermoFisher Scientific	Sorvall legend micro 17R
Centrifuge ( For pelleting Bacterial cell)	ThermoFisher Scientific	Sorvall ST 8R
Centrifuge ( For pelleting/processing parasite)	ThermoFisher Scientific	Sorvall ST 8R (TX-400 rotor)
DpnI	NEB	RO1765
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
E. coli BLR(DE3) pLysS competent cells	Sigma-Aldrich	69956
E. coli DH5a Competent Cells	Takara Bio	9057
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap	BioRad	1652086
Electroporator	BioRad	GenePulser Xcell
femtoLUCENTTM PLUS HRP chemiluminescent reagent	G-Bioscience	7860-003
Gentamicin	ThermoFisher Scientific	15750078
Giemsa Stain	Himedia	S011-100ML
Glutathione Sepharose 4B	GE Healthcare	17075601
HEPES, Free Acid	Merck	391338
Hypoxanthine	Merck	4010CBC
In-fusion HD cloning Kit	Takara Bio	1711641A
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	1708880EDU
MBP, dephosphorylated	Merck	13-110
NotI	NEB	R3189S
Nucleobond Xtra Maxi EF	Takara Bio	740424
NucleoSpin Gel and PCR clean-up Mini kit	Takara Bio	740609
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
p-nitrobenzyl mesylate (PNBM)	Abcam	Ab138910
Primestar Max DNA Polymerase	Takara Bio	R045A
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
Qiaprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QuikChange II XL site-directed mutagenesis kit	Agilent	200521
RNeasy Mini kit	Qiagen	74104
RPMI-1640	ThermoFisher Scientific	31800-105
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
SpeI-HF	NEB	R3133S
SuperScript III First-Strand Synthesis kit	ThermoFisher Scientific	18080-051
T4 DNA Ligase	ThermoFisher Scientific	15224017
Thiophosphate ester antibody	Abcam	Ab92570